Name: gene knock-in by crispr/cas9 and cell sorting in macrophage and t cell lines
Uploaded: 2021-11-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Gene Knock-in by CRISPR/Cas9 and Cell Sorting in Macrophage and T Cell Lines at JoVE.com

Ringraziamo la struttura principale della citometria a flusso della Xinxiang Medical University. Lo sviluppo di tale tecnologia è stato sostenuto da sovvenzioni NSFC 81601360 a LZ, 81471595 e 32070898 a YL. Il lavoro è anche sostenuto dalla Fondazione del Comitato Educativo dell'Henan n. 21IRTSTHN030.

1. Progettazione e costruzione di plasmidi di sgRNA destinati al locus Rosa26
<ol><li>Guida alla progettazione RNA intorno al sito di inserimento desiderato
	<ol>
<li>Assicurarsi che il sito di inserimento per gli esperimenti knock-in del topo Rosa26 (di seguito designato come mRosa26) si trovi nel primo introne di mRosa26; questo sito è stato utilizzato in studi precedenti28,29. Per gli esp...

Nei nostri esperimenti, abbiamo dimostrato come eseguire l'editing knock-in nelle cellule immunitarie dalla progettazione del costrutto allo screening e alla convalida delle cellule knock-in utilizzando cellule T Jurkat umane e macrofagi RAW264.7 murini come esempi. Sia le linee cellulari delle cellule T che delle macrofaghe sono resistenti alla trasfezione36,37; tuttavia, il problema della bassa efficienza della consegna CRISPR / Cas9 può essere superato con l'...

Le cellule immunitarie sono fondamentali per la difesa contro gli agenti patogeni. Sia l'immunità innata che quella adattativa sono necessarie per la clearance degli infettanti e il mantenimento dell'omeostasi tissutale1,2. I modelli di linee cellulari sono strumenti essenziali per comprendere i fondamenti molecolari del sistema immunitario dei mammiferi; sono utilizzati in saggi funzionali in vitro, come quelli che modellano l'attivazione delle cellule T umane, e nel determinare la funzione dei fattori genetici nell'attivare o smorzare le risposte immunitarie3,4. È importante notare che il sistema immunitario dei mammiferi è enormemente eterogeneo e, altrettanto importante, un numero enorme di molecole controlla la differenziazione, la migrazione e la funzione di un dato tipo di cellula5,6.
Gli strumenti di editing del genoma CRISPR /Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) consentono la manipolazione genetica di specifici tipi di cellule, che facilita l'annotazione funzionale dei geni in modo preciso7,8. Diversi protocolli pubblicati hanno descritto la somministrazione di CRISPR / Cas9 sotto forma di complessi di RNA Guida Cas9 noti come ribonucleoproteine (RNP) in cellule HEK293, linee cellulari Jurkat, cellule T primarie9,10, macrofagi11,12,13, cellule staminali14e altri15,16. In questi protocolli, il gene tagging è solitamente ottenuto fondendo un tag fluorescente alle proteine endogene17,18. Tuttavia sono stati fatti pochi tentativi di utilizzare due reporter fluorescenti, che sono compatibili con lo smistamento a singola cellula, per facilitare gli esperimenti knock-in19,20, in particolare nelle cellule immunitarie.
Analisi meccanicistiche approfondite volte a comprendere le funzioni di un nuovo fattore genetico nelle cellule immunitarie richiedono generalmente la delezione specifica del tipo cellulare di un gene, esperimenti di salvataggio genetico e idealmente l'identificazione dei suoi interattori. Anche se i metodi per l'ottimizzazione della delezione genetica dei geni nelle cellule immunitarie sono stati pubblicati9,15,21,sono stati segnalati molti meno metodi per introdurre alleli knock-in con funzioni versatili per comprendere la risposta immunitaria. Pertanto, in questo protocollo ci proponiamo di descrivere in dettaglio un protocollo efficiente e altamente riproducibile per esprimere una proteina di interesse (POI) al locus Safe Harbor Rosa26 in linee cellulari immunitarie sia umane che murine. Abbiamo progettato un sistema reporter a due colori per arricchire le cellule trasfettate con plasmidi che esprimono CRISPR/Cas9 (DsRed2) e un modello di DNA ricombinante (EBFP2), che può essere isolato mediante selezione cellulare. Seguendo questo protocollo, abbiamo ottenuto più linee knock-in della linea di cellule T umane Jurkat e del macrofago murino RAW264.7 per analisi funzionali di proteine scarsamente studiate.
Ad esempio, mostriamo in questo protocollo come ottenere macrofagi RAW264.7 knock-in che esprimono stabilmente ACE2 umano (un recettore di SARS-Cov-2)22. Poiché le cellule immunitarie innate sono coinvolte nella patogenesi di Covid-1923,24 e l'ACE2 umano è considerato un recettore principale richiesto per l'ingresso virale nelle cellule prima della replicazione, i macrofagi con knock-in di ACE2 umano possono servire come strumento utile per studi meccanicistici di moltiplicazione virale all'interno dei macrofagi. Parallelamente, presentiamo anche un esempio di knock-in di un gene nel locus umano ROSA26 per esprimere la proteina RASGRP1, che è stata fusa al suo terminale amminico con un'affinità Twin-Strep-tag (OST). Le cellule T sono cellule bersaglio chiave nelle terapie immunitarie e un numero crescente di studi si è concentrato sulla manipolazione della loro reattività al cancro25,26. Poiché Rasgrp1 è noto per essere una molecola di segnalazione chiave a valle del recettore delle cellule T e i suoi interattori non sono ben chiariti27, il modello knock-in OST-RASGRP1 fornisce le basi per identificare gli interattori che regolano la risposta delle cellule T ai tumori e alle infezioni. Presi insieme, questi strumenti possono essere utilizzati per gli studi Covid-19 e la scoperta di nuove molecole che interagiscono con Rasgrp1.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amersham Imager 600</td>
			<td>Ge Healthcare</td>
			<td></td>
			<td>imaging of chemiluminescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin, sodium salt</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>194526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>7074</td>
			<td>at 1/5000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-RasGRP1 antibody, clone 10.1</td>
			<td>Merck</td>
			<td>MABS146</td>
			<td>1.0 &#956;g/mL of working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AscI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0558S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Actin (D6A8) Rabbit mAb</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>8457</td>
			<td>at 1/1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BamHI-HF</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3136S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BbsI-HF</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3539S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellometer Mini Automated Cell Counter</td>
			<td>Nexcelom Bioscience</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.coli DH5&#945; Competent Cells</td>
			<td>Takara</td>
			<td>9057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO (Dimethyl Sulfoxide)</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>196055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNeasy Blood &#38; Tissue Kits</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69506</td>
			<td>cell culture reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (10X), no calcium, no magnesium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14200075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) with high glucose</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30022.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRI-HF</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3101S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSAria&#8482; Fusion</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>equipped with biosafety cabinet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Canto flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 5 ml polystyrene round bottom test tube</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10099141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo version 10.7</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH (D16H11) XP&#160;Rabbit mAb</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>5174</td>
			<td>at 1/1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>31430</td>
			<td>at 1/5000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon ECL Ultra Western HRP Substrate</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>WBKLS0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon-PSQ PVDF Membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ISEQ00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jurkat</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB-152</td>
			<td>https://www.atcc.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin sulfate</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>194531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB agar powder</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>22700041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-channel Pipette (30-300 &#956;L)</td>
			<td>Eppendorf, or similar</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MPK5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System, 10 &#956;L kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MPK1096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 15 mL Conical Sterile Centrifuge Tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>339651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OneTaq&#174; Hot Start Quick-Load&#174; 2X Master Mix</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>(M0489)</td>
			<td>for high GC% template</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>26616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip 0.1-20&#181;l</td>
			<td>Eppendorf, or similar</td>
			<td>0030 075.005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip 2-200&#181;l</td>
			<td>Eppendorf, or similar</td>
			<td>0030 075.021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip 50-1000&#181;l</td>
			<td>Eppendorf, or similar</td>
			<td>0030 075.064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pX458-DsRed2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>112219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td>purify plasmid from restriction digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0494S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RAW264.7</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB-71</td>
			<td>https://www.atcc.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Anti-ACE2 antibody [EPR4435(2)]</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab108252</td>
			<td>at 1/1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30027.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strep-Tactin Sepharose beads</td>
			<td>IBA Lifesciences</td>
			<td>2-1201-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTOX&#8482; Red Dead Cell Stain, for 633 or 635 nm excitation</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S34859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Polynucleotide Kinase</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution (0.25%), with phenol red</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZOE Fluorescent Cell Imager</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microtubes, PCR-clean</td>
			<td>Eppendorf, or similar</td>
			<td>0030 125.215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Clear Flat Bottom Polystyrene TC-treated Microplates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Clear Round Bottom TC-treated Microplate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3799</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

gene knock-in by crispr/cas9 and cell sorting in macrophage and t cell lines

Gli studi di genomica funzionale del sistema immunitario richiedono manipolazioni genetiche che comportano sia la delezione di geni bersaglio che l'aggiunta di elementi alle proteine di interesse. L'identificazione delle funzioni geniche in modelli di linee cellulari è importante per la scoperta e l'esplorazione dei meccanismi intrinseci delle cellule. Tuttavia, le manipolazioni genetiche delle cellule immunitarie come le cellule T e le linee cellulari dei macrofagi utilizzando il knock-in mediato da CRISPR / Cas9 sono difficili a causa della bassa efficienza di trasfezione di queste cellule, specialmente in uno stato quiescente. Per modificare i geni nelle cellule immunitarie, la selezione della resistenza ai farmaci e i vettori virali sono tipicamente utilizzati per arricchire le cellule che esprimono il sistema CRIPSR / Cas9, il che si traduce inevitabilmente in un intervento indesiderato delle cellule. In uno studio precedente, abbiamo progettato due reporter fluorescenti accoppiati a CRISPR / Cas9 che sono stati espressi transitoriamente dopo l'elettroporazione. Questa soluzione tecnica porta a una rapida delezione genica nelle cellule immunitarie; tuttavia, il knock-in genico nelle cellule immunitarie come le cellule T e i macrofagi senza l'uso della selezione della resistenza ai farmaci o dei vettori virali è ancora più impegnativo. In questo articolo, mostriamo che utilizzando lo smistamento cellulare per aiutare la selezione di cellule che esprimono transitoriamente costrutti CRISPR / Cas9 che prendono di mira il locus Rosa26 in combinazione con un plasmide donatore, il knock-in genico può essere ottenuto sia nelle cellule T che nei macrofagi senza arricchimento della resistenza ai farmaci. Ad esempio, mostriamo come esprimere ACE2 umano, un recettore di SARS-Cov-2, responsabile dell'attuale pandemia di Covid-19, nei macrofagi RAW264.7 eseguendo esperimenti knock-in. Tali cellule knock-in geni possono essere ampiamente utilizzate per studi meccanicistici.

Seguendo il protocollo sopra descritto per eseguire esperimenti knock-in presso il locus mRosa26 utilizzando macrofagi murini RAW264.7, abbiamo progettato un vettore di targeting per esprimere ACE2 umano, un recettore per il virus SARS-Cov-2 (Figura 2A). Utilizzando un design simile, abbiamo generato cellule T Jurkat umane con knock-in della proteina di fusione RASGRP1 con tag OST (Figura 2C). Dopo la trasfezione di tre plasmidi, due dei quali sono stat...

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Gene Knock-in by CRISPR/Cas9 and Cell Sorting in Macrophage and T Cell Lines

Questo protocollo utilizza reporter fluorescenti e ordinamento cellulare per semplificare gli esperimenti knock-in in macrofagi e linee cellulari T. Per questi esperimenti di knock-in semplificati vengono utilizzati due plasmidi, vale a dire un plasmide che esprime CRISPR / Cas9 e DsRed2 e un plasmide donatore di ricombinazione omologa che esprime EBFP2, che è permanentemente integrato nel locus Rosa26 nelle cellule immunitarie.

Gene Knock-in di CRISPR/Cas9 e smistamento cellulare in macrofagi e linee cellulari T

Functional genomics studies of the immune system require genetic manipulations that involve both deletion of target genes and addition of elements to ...

L'obiettivo di questo protocollo è quello di semplificare l'esperimento knock-in mediato CRISPR / Cas9 in linee di macrofagi e cellule T, con l'aiuto di reporter fluorescenti e influenzare lo smistamento cellulare. ROSA26 Locus è noto come sito genomico safe harbor per l'inserimento di transgeni. È un normale esprimere proteine di interesse con o senza attacco nel mondo topo di 26 locus, o nel log ortopedico umano.Parte 1: Progettazione e costruzione di plasmidi di sgRNA destinati a Rosa26 Locus. In primo luogo, progettare sgRNA dal locus Rosa26 del topo, utilizzando sequenze dall'informatica del genoma del topo e Dall'Ensemble Genome Browser, quindi scaricare la sequenza genomica del gene Rosa26 del topo. Vai allo strumento web online, CRISPOR, incolla 100 coppie di basi della sequenza di input dal Rosa26 Locus.Quindi selezionare un genoma, ad esempio, Mus musculus-mouse reference genome 2011. Quindi, selezionare il tipo di PAM. Utilizzare il motivo NGG"PAM a 20bp, riconosciuto da spCas9.Fai clic su Invia. Scegli la guida con un punteggio di specificità elevato, un punteggio di attività elevato e un minor numero di obiettivi fuori bersaglio. Le guide indicate come inefficienti dovrebbero essere evitate.In particolare, è preferibile selezionare due guide con sequenze sovrapposte, che possono aumentare l'efficienza di knock-in come riportato. Per la sequenza di cena calda, sintetizzare un illegale in avanti e un illegale di inversione, che ricotto fosforato e pronto per la clonazione a fattore. Preparare la diminuzione linearizzata per Vactor a cui potrebbe esprimere è devo reporter da BBS una digestione, come ottenere il Neal, i legali al vettore linearizzato per generare il costrutto finale, che esprime simultaneamente l'RNA guida e il CAS nove nucleo collegato con un DSRIP due reporter fluorescenti.Parte seconda: Costruzione del vettore di targeting come modello di ricombinazione omologa. Per l'espressione della proteina di interesse. Ad esempio, l'umano è durato.Si desidera sintetizzare la sequenza di cDNA per fonte commerciale e il tag OST di affinità o altro attacco comunemente usato per la purificazione delle proteine può essere fuso alla sequenza cDNA. Ricordarsi di includere la sequenza di consenso kazako prima dell'inizio del cDNA. Digerito dall'enzima di restrizione Asc1, e come ottenere il CD e l'inserto nella spina dorsale.Vactor, vale a dire pKhR26-IBFP IBP che produce il targeting finale concentrare il contenitore, ciascuno, KB di cinque bracci omologhi primi e tre primi. Il set di cast di espressioni include un promotore CG, il ristorante UST, se si desidera che la regione koonin sia collegata a un Iris, se il reporter VFD e un poly AC fondi. Infine, all'orizzonte, prendendo di mira il vettore utilizzando enzimi di taglio unici, come EcoR1 o BamH1, i digest e il prodotto vengono purificati in un negozio che meno 20 gradi sulle note di elettroporazione.Si raccomanda di ottenere un'alta concentrazione di DNA vettoriale linearizzato. Parte terza: L'elettroporazione delle linee di macrofagi e cellule T prepara la coltura cellulare seguita alla separazione per le cellule geritalk. La densità cellulare ottimale era di circa 0,5 milioni di cellule per ML al momento della trasfezione.L'elettroporazione completa in dieci macro piccoli formati di punta di moda nucleare prepara una piastra a 24 pozzetti contenente 500 microlitro di crescita completa, mezzo senza antibiotici in ogni pozzetto. Preriscalda le piastre in umidificate a 37 gradi, il 5% coprendo quell'incubatore di impostazione. Abbassare i parametri di elettroporazione di ingresso del sistema di funzionamento elettrico per jet cat o Rosales.Preparare i follow-up della miscela di DNA cellulare o l'operazione raccogliere le cellule di pollo. Curchin 25 centimetri quadrati celle di trasferimento del pallone nei 15 animali. Dal momento che tu tubo, quindi Phillip le cellule per centrofugazione a 90 volte G per otto minuti a temperatura ambiente, chiedilo, i supernatanti.Per il lavaggio, sospendare le cellule con i cinque ML PBS, quindi ruotare la sospensione cellulare mediante centrifugazione utilizzando la stessa condizione del passaggio precedente. Rimuovere i DPP. E risuspendare i cuscini delle cellule usando due ML di DBS.Si rimane micro piccola cella sospensione e mescolare con lo stesso volume di 0,2% Trepan Ballou per stimare il conteggio delle celle carico campione in termini di conteggio slot inserire Connie slide nella cella automatizzata Connor e visualizzare l'immagine stessa. Quindi ottenere un risultato di conteggio delle celle. Calcola 2 milioni di celle troverà la reputazione di elettroporazione per esperimento di knocking trasferire il numero di celle in 1,5 ML.Centrifugare due celle a pellet mediante centrifugazione.Per risparmiare tempo, la miscela di elettroporazione può essere preparata durante la centrifugalizzazione che aggiunge 2,5 microgrammi di ciascuno di CRISPR CAS nove vettori 2,4 microgrammi di riso Belinda, vettore loquace e risosoluzione bufalo. Il nostro volume totale totale di 55 macro lettiera in un nuovo tubo centrifugato da 1,5 ML vertex delicatamente e. Stare brevemente in piedi per mescolare bene.Lasciare la miscela a pressione Luxor e la temperatura ambiente prima dell'uso. Dopo la rotazione aspart, il DTB è questo essenzialmente fusibile per altri 30 secondi, rimuovere il maggior numero possibile di surnatante riaspensere le celle aggiungendo delicatamente la pipetta della miscela di elettroporazione preparata su e giù. L'elettroporazione ha chiesto che il miscelatore di elettroporazione della cella utilizzasse 10 micro piccole punte di fazione nucleare era importante per le pipette.Evitare bolle d'aria durante il pi petting costerà un guasto galvanica. Premere start. dopo di che l'operazione trasferisce il campione in un po '.Pozzo di 24, le piastre del pozzo con un pre-avvertimento del mezzo lordo eseguono la stessa pressione elettrica e le stesse procedure di cui sopra sui restanti quattro campioni replicati, scuotere delicatamente la piastra per assicurare una distribuzione uniforme delle celle. Incubare le cellule in un incubatore a 37 gradi per 48-72 ore. Prima del fatto, lo smistamento delle cellule A 24 ore dopo la trasfezione, esaminare l'espressione di interruzione due per il reporter del ristorante utilizzando la microscopia fluorescente staccata dal rappresentante per noi stessi indica che l'elettroporazione funziona correttamente.Parte 4: ordinamento delle celle per isolare le cellule putative knock-in. Prima di preparare la selezione delle cellule, in 96 piastre di pozzetto con 150 micro piccole di mezzo lordo specifico del tipo di cella per pozzo utilizzare il micro posto inferiore sbagliato per la coltura e se stesso e il micro posto a fondo piatto per tutte le cellule trasferiscono le cellule in un FACS sterile per mantenere il tubo sul ghiaccio e per mettere la scatola nel percorso attraverso la finestra, collegamento alla sala di selezione delle cellule quando applicabile impostare il sorter cellulare con ugello da 85 micrometri e bassa portata per lo smistamento delle cellule immunitarie per ottenere una valutazione e una sopravvivenza ottimali delle cellule, prendere brevemente i campioni dal vertice della finestra passante e caricare il campione nelle acquisizioni. Champer ha impostato il pattinaggio di fatto per lo smistamento delle celle prima ha definito gli imbuti di vendita per lo scatter Ford e lo scatter laterale, quindi ha definito le cellule di vita ottenendo il set parla di cellule rosse negative.Successivamente, trovano una singola cellule vive per singolo singoletto gating usando l'FSC H contro FSE un blocco multi-vario. Infine impostare un gate per i DSR desiderati due e B se la sottopopolazione Volvo positiva, che indica che le cellule sono co-trasfettate con successo con il vettore CRISPR e il vettore tascabile. Quindi 10 cellule singole in ciascun pozzetti del 96, piastra di pozzo integrata con il preguerra, il mezzo di crescita completo usando la modalità periodo o la modalità a singola cellula dopo lo smistamento incubano le 96 piastre di pozzo nell'incubatore di colture cellulari per l'espansione cellulare.Parte quinta: screening dell'elevazione delle cellule knock-in positive Dopo circa due settimane di espansione cellulare oltre la sopravvivenza, le cellule nella piastra a 48 pozzetti valutano l'espressione di BFP o citometria a flusso utilizzando una piccola percentuale di proliferano se stessa utilizzando le cellule di tipo a parete come popolazioni cellulari di controllo negative, possedendo una percentuale più elevata di cellule positive BFP sono mantenute per soddisfare l'estratto di convalida il DNA genomico dalle cellule che dovremmo esprimere BFP passa il DNA genomico isolato mediante PCR con primer che coprono ciascun lato dei bracci omologhi, vale a dire uno primario individua nella sequenza genomica, esterno al vettore di targeting. Il lato visto per parlare con il vettore in questo esperimento, la dimensione prevista del prodotto PCR amplificato con il primario è 1,2 KV. E con F due e R due è 1.2 KB Risultati di sequenziamento Sanger. Quindi i prodotti PCR mostrano le sequenze di ogni giunzione di integrazione dimostrando la posizione corretta e di bussare nel Rosa 26 Lucas.Dico come l'immuno blotting consente la convalida del corretto bussare a livello proteico parte sei risultati rappresentativi. Ad esempio, pubblicato in uno studio precedente, abbiamo espresso che ottenere 45 molecole tack che l'inter con un tag OSD, e c'era un 26 locus nel checkout delle cellule T successivamente USD tatto. Ottengo 45 e direttori di incidenti o abbattuti dalla purificazione dell'affinità e un soggetto alla spettrometria di massa.I dati di proteomica hanno rivelato l'interazione delle cellule T. Pertanto questo pool di prodotti ha notevolmente facilitato la ricerca di nuovi intercalatori per chiarire la funzione di una determinata proteina. Questa presentazione tecnica ha mostrato che per espresso transitoriamente aumentato per linea di cast RFP con il vettore parlante co-espresso e BFP per Rosa 26 locus.Abbiamo generato linee cellulari knocking con espressione genica permanente sia nelle cellule T che nei macrofagi, che sono difficili da eseguire nelle manipolazioni genetiche. Questi metodi e raccomandazioni sono applicabili a Chris consentiti nelle asserzioni di ampio segmento di DNA per studi meccanicistici delle cellule immunitarie, come per l'identificazione di proteine, studio di interazione proteica.

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The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Mouse NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Mouse Naïve CD4<sup&gt; +</sup&gt; Isolamento T cellulare e<em&gt; In vitro</em&gt; Differenziazione in T sottopopolazioni cellulari

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Analyzing the Functions of Mast Cells In Vivo Using 'Mast Cell Knock-in' Mice

Analyzing the Functions of Mast Cells In Vivo Using 'Mast Cell Knock-in' Mice

Analisi delle funzioni delle mastociti in vivo usando topi ' Mast Cell Knock-in'

Mast cells (MCs) are hematopoietic cells which reside in various tissues, and are especially abundant at sites exposed to the external environment, such ...

An Efficient and Simple Method to Establish NK and T Cell Lines from Patients with Chronic Active Epstein-Barr Virus Infection

Un metodo semplice ed efficace per stabilire NK e linee a cellula T da pazienti con infezione attiva cronica del Virus di Epstein - Barr

A number of methods have been described to establish NK/T cell lines from patients with lymphoma or lymphoproliferative syndrome. These methods employed ...