Name: gene knock-in by crispr/cas9 and cell sorting in macrophage and t cell lines
Uploaded: 2021-11-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Gene Knock-in by CRISPR/Cas9 and Cell Sorting in Macrophage and T Cell Lines at JoVE.com

新郷医科大学のフローサイトメトリーコア施設に感謝します。このような技術の開発は、LZ、81471595、および32070898に81601360のNSFC助成金によって支えられてきました。この作品は河南教育委員会第21IRTSTHN030の財団によっても支援されています。

1. Rosa26遺伝子座を標的としたsgRNAの設計とプラスミド構築
<ol><li>目的の挿入部位の周りの設計ガイドのRNA
	<ol>
<li>マウスRosa26の挿入部位 (以下、mRosa26と指定される) ノックイン実験がmRosa26の最初のイントロンに位置していることを確認します。このサイトは、以前の研究で使用されています28,29.?...

実験では、ヒトのJurkat T細胞とマウスRAW264.7マクロファージを例に、構築設計からノックイン細胞スクリーニング、検証まで、免疫細胞のノックイン編集を行う方法を実証しました。T細胞およびマクロファージ細胞株は両方トランスフェクション36、37に耐性である。しかし、CRISPR/Cas9送達の低効率の問題は、蛍光レポーターの助けを借りて細胞の選...

免疫細胞は病原体に対する防御に不可欠です。感染者のクリアランスと組織恒常性の維持のためには、自然免疫と適応免疫の両方が必要です1,2.細胞株モデルは、哺乳類の免疫系の分子基礎を理解するための不可欠なツールです。それらは、ヒトT細胞活性化をモデル化するもののようなインビトロ機能アッセイにおいて用いられ、免疫応答を活性化または減衰させる遺伝的要因の機能を決定する際に3、4。哺乳類の免疫系は非常に異質であり、同様に重要な、膨大な数の分子が、所定の細胞型5、6の分化、移動、および機能を制御することに注意することが重要である。
クラスター化された定期的に間隔を合わせた短いパリンドローム反復(CRISPR)/Cas9ゲノム編集ツールは、特定の細胞タイプの遺伝子操作を可能にし、遺伝子の機能的注釈を正確な方法7,8に容易にする。いくつかの公表されたプロトコルは、HEK293細胞におけるリボヌクレオタンパク質(RnPs)として知られているCas9ガイドRNA複合体の形態でCRISPR/Cas9の送達を説明している、ジュルカット細胞株、原発性T細胞9、10、マクロファージ11、12、13、幹細胞14、および他の15、16。これらのプロトコルにおいて、遺伝子タグ付けは、通常、内因性タンパク質17,18に蛍光タグを融合させることによって達成される。しかし、単一細胞選別に対応する二重蛍光レポーターを用いて、特に免疫細胞におけるノックイン実験19,20を容易にする試みがなされている。
免疫細胞における新しい遺伝的因子の機能を理解することを目的とした詳細な機械分析は、一般的に遺伝子の細胞型特異的な欠失、遺伝子救助実験、および理想的には、そのインターアクターの同定を必要とする。免疫細胞の遺伝子の遺伝的欠失の最適化方法は9、15、21に公表されているが、免疫応答を理解するために多目的な機能を持つノックイン対立遺伝子を導入する方法ははるかに少ない報告を受けている。したがって、このプロトコルでは、ヒトおよびマウスの両方の免疫細胞株において、目的のタンパク質(POI)を安全な港のLocus Rosa26で発現させる効率的で再現性の高いプロトコルを詳細に記述することを目指しています。CRISPR/Cas9(DsRed2)を発現するプラスミドを導入した細胞に対して、細胞選別で分離できる組換えDNAテンプレート(EBFP2)を用いて濃縮する2色レポーターシステムを設計しました。このプロトコルに従って、我々は、研究が不十分なタンパク質の機能解析のためにヒトT細胞株JurkatとマウスマクロファージRAW264.7の複数のノックインラインを得た。
一例として、このプロトコルでは、ヒトACE2(SARS-Cov-2の受容体)を安定的に発現するマクロファージRAW264.7マクロファージを安定的に得る方法を本プロトコルで示す。自然免疫細胞は、Covid-1923、24およびヒトACE2の病因に関与しているため、複製前に細胞へのウイルス侵入に必要な主要な受容体とみなされるため、ヒトACE2のノックインを伴うマクロファージは、マクロファージ内のウイルス増殖の機械化研究に有用なツールとして役立つ。また、ヒトROSA26遺伝子のノックイン例を、アミノ末でアフィニティツインストレップタグ(OST)と融合したRASGRP1タンパク質を発現させる例も紹介しています。T細胞は免疫療法における主要な標的細胞であり、癌25,26に対する応答性の操作に焦点を当てた研究が増えている。Rasgrp1はT細胞受容体の下流にある重要なシグナル伝達分子であることが知られており、そのインターアクターは27を十分に解明されていないので、OST-RASGRP1ノックインモデルは、T細胞の腫瘍および感染に対する応答を調節する界発体を同定するための基盤を提供する。これらのツールを組み合わせることで、Covid-19の研究やRasgrp1と相互作用する新しい分子の発見に使用できます。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amersham Imager 600</td>
			<td>Ge Healthcare</td>
			<td></td>
			<td>imaging of chemiluminescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin, sodium salt</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>194526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>7074</td>
			<td>at 1/5000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-RasGRP1 antibody, clone 10.1</td>
			<td>Merck</td>
			<td>MABS146</td>
			<td>1.0 &#956;g/mL of working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AscI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0558S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Actin (D6A8) Rabbit mAb</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>8457</td>
			<td>at 1/1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BamHI-HF</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3136S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BbsI-HF</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3539S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellometer Mini Automated Cell Counter</td>
			<td>Nexcelom Bioscience</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.coli DH5&#945; Competent Cells</td>
			<td>Takara</td>
			<td>9057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO (Dimethyl Sulfoxide)</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>196055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNeasy Blood &#38; Tissue Kits</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69506</td>
			<td>cell culture reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (10X), no calcium, no magnesium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14200075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) with high glucose</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30022.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRI-HF</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3101S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSAria&#8482; Fusion</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>equipped with biosafety cabinet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Canto flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 5 ml polystyrene round bottom test tube</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10099141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo version 10.7</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH (D16H11) XP&#160;Rabbit mAb</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>5174</td>
			<td>at 1/1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>31430</td>
			<td>at 1/5000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon ECL Ultra Western HRP Substrate</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>WBKLS0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon-PSQ PVDF Membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ISEQ00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jurkat</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB-152</td>
			<td>https://www.atcc.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin sulfate</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>194531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB agar powder</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>22700041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-channel Pipette (30-300 &#956;L)</td>
			<td>Eppendorf, or similar</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MPK5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System, 10 &#956;L kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MPK1096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 15 mL Conical Sterile Centrifuge Tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>339651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OneTaq&#174; Hot Start Quick-Load&#174; 2X Master Mix</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>(M0489)</td>
			<td>for high GC% template</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>26616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip 0.1-20&#181;l</td>
			<td>Eppendorf, or similar</td>
			<td>0030 075.005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip 2-200&#181;l</td>
			<td>Eppendorf, or similar</td>
			<td>0030 075.021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip 50-1000&#181;l</td>
			<td>Eppendorf, or similar</td>
			<td>0030 075.064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pX458-DsRed2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>112219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td>purify plasmid from restriction digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0494S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RAW264.7</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB-71</td>
			<td>https://www.atcc.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Anti-ACE2 antibody [EPR4435(2)]</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab108252</td>
			<td>at 1/1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30027.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strep-Tactin Sepharose beads</td>
			<td>IBA Lifesciences</td>
			<td>2-1201-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTOX&#8482; Red Dead Cell Stain, for 633 or 635 nm excitation</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S34859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Polynucleotide Kinase</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution (0.25%), with phenol red</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZOE Fluorescent Cell Imager</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microtubes, PCR-clean</td>
			<td>Eppendorf, or similar</td>
			<td>0030 125.215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Clear Flat Bottom Polystyrene TC-treated Microplates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Clear Round Bottom TC-treated Microplate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3799</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

gene knock-in by crispr/cas9 and cell sorting in macrophage and t cell lines

免疫系の機能ゲノミクス研究は、標的遺伝子の欠失と目的のタンパク質への要素の追加の両方を含む遺伝子操作を必要とする。細胞系モデルにおける遺伝子機能の同定は、細胞固有のメカニズムの遺伝子発見と探索に重要である。しかし、特に静止状態では、これらの細胞のトランスフェクション効率が低いため、CRISPR/Cas9を介したノックインを用いたT細胞やマクロファージ細胞株などの免疫細胞の遺伝子操作は困難である。免疫細胞の遺伝子を改変するために、薬物耐性選択およびウイルスベクターは、通常、CRIPSR/Cas9系を発現する細胞を濃縮するために使用され、必然的に細胞の望ましくない介入をもたらす。以前の研究では、エレクトロポレーション後に一時的に発現したCRISPR/Cas9に結合した二重蛍光レポーターを設計しました。この技術的なソリューションは、免疫細胞の迅速な遺伝子欠失につながります;しかし、薬剤耐性選択やウイルスベクターを使用しないT細胞やマクロファージなどの免疫細胞における遺伝子ノックインはさらに困難です。本稿では、細胞選別を用いて、ドナープラスミドと組み合わせて Rosa26 遺伝子座を標的とするCRISPR/Cas9構築物を一時的に発現する細胞の選択を支援することで、薬剤耐性濃縮のないT細胞とマクロファージの両方で遺伝子ノックインを達成できることを示す。一例として、現在のCovid-19大流行を担うSARS-Cov-2の受容体であるヒトACE2を、ノックイン実験を行ってRAW264.7マクロファージで発現させる方法を示す。このような遺伝子ノックイン細胞は、幅広く、機械研究に使用することができる。

mRosa26遺伝子座でのノックイン実験を行うプロトコルに従って、マウスRAW264.7マクロファージを用いて、SARS-Cov-2ウイルスの受容体であるヒトACE2を発現させる標的ベクターを設計した(図2A)。同様の設計を用いて、OST タグ付き RASGRP1融合タンパク質のノックインを持つヒト Jurkat T 細胞を生成しました (図 2C)。3つのプラスミドのトランスフェク?...

Watch this Scientific Journal Video about Gene Knock-in by CRISPR/Cas9 and Cell Sorting in Macrophage and T Cell Lines at JoVE.com

Gene Knock-in by CRISPR/Cas9 and Cell Sorting in Macrophage and T Cell Lines

このプロトコルは、蛍光レポーターと細胞分類を使用して、マクロファージおよびT細胞株におけるノックイン実験を簡素化します。これらの単純なノックイン実験、すなわちCRISPR/Cas9-およびDsRed2発現プラスミドと、免疫細胞内の Rosa26 遺伝子座に永久に統合されたEBFP2を発現する相同組換えドナープラスミドの2つのプラスミドが使用されます。

CRISPR/Cas9による遺伝子ノックインとマクロファージおよびT細胞株における細胞分類

Functional genomics studies of the immune system require genetic manipulations that involve both deletion of target genes and addition of elements to ...

このプロトコルの目的は、蛍光レポーターの助けを借りて、マクロファージとT細胞株におけるCRISPR/Cas9媒介ノックイン実験を簡素化し、細胞の選別に影響を与えることである。ローザ26ローカスは、遺伝子導入のためのゲノム安全港湾部位として知られている。マウスの世界では、26軌跡、またはヒトのオルソログで、攻撃の有無にかかわらず目的のタンパク質を発現するのが普通です。第1部:Rosa26ローカスを標的としたsgRNAの設計とプラスミド建設まず、マウスRosa26遺伝子からsgRNAを設計し、マウスゲノム情報学の配列とアンサンブルゲノムブラウザを用いて、マウスRosa26遺伝子のゲノム配列をダウンロードする。オンラインウェブツールCRISPORに移動し、Rosa26 Locusからの入力シーケンスの100ベースペアを貼り付けます。次いで、例えば、筋筋マウス参照ゲノム2011のゲノムを選択する。次に、PAMの種類を選択し、spCas9によって認識される20bp NGG"PAMモチーフを使用してください。[送信] をクリックします。特異性の高いスコア、高い得点、およびオフターゲットが少ないガイドを選択します。非効率的と示されたガイドは避けるべきです。特に、重複するシーケンスを持つ2つのガイドを選択すると、報告されたノックイン効率が向上する可能性があります。暖かい食事シーケンスの場合は、前方違法と逆転違法を合成し、リンアリングし、因子にクローンする準備ができています。発現可能なVactorあたりの線形化された減少を準備することは、DSRIP 2つの蛍光レポーターと結合したガイドRNAとCAS 9核を同時に発現する最終構築物を生成する線形化されたベクターであるニールを得るような、BBS 1つの消化によってレポーターしなければならない。第2部:相同組換えテンプレートとしてのターゲットベクトルの構築目的のタンパク質の発現のため。例えば、人間は続いた。cDNA配列を、市販のソースとアフィニティーOSTタグまたはタンパク質の精製のために一般的に使用される攻撃によってcDNA配列を合成したい場合は、cDNA配列に融合させることができます。cDNAの開始前にカザックコンセンサスシーケンスを含めておいてください。Asc1制限酵素によって消化され、CDとインサートをバックボーンに取り込むのが好きです。Vactorは、すなわちpKhR26-IBFP IBPが最終的なターゲティングを得て容器を濃縮し、それぞれ1つ、5つの素数および3つの素数相同腕のKB。VFDレポーターとポリACファンドの場合、表現キャストセットには、CGプロモーター、USTレストラン、クーニン地域をアイリスにリンクさせたい場合が含まれます。最後に、EcoR1やBamH1などのユニークなカッター酵素を使用したベクターをターゲットとする地平線上で、消化器と製品はエレクトロポレーションノートに20度を差し引いた店で精製されます。高濃度の線形化ベクターDNAを得ることを推奨します。第3部:マクロファージとT細胞株のエレクトロポレーションは、ゲリトーク細胞の分離後の細胞培養を準備する。最適な細胞密度は、トランスフェクション時に1MLあたり約50万個の細胞であった。10マクロ小さな核ファッションチップフォーマットの完全なエレクトロポレーションは、完全な成長の500マイクロリットル、各井戸に抗生物質のない培地を含む24ウェルプレートを準備します。プレートを加湿37度、5%がその設定インキュベーターを覆う前温め。ジェットキャットまたはロサレスの電気操作システム入力エレクトロポレーションパラメータを下げ細胞DNA混合物のフォローアップを準備するか、または操作は鶏細胞を収集します。15匹の動物のカーチン25平方センチメートルフラスコ転写細胞。チューブするので、室温で8分間Gの90倍の遠心分離によって細胞をフィリップし、上清を求めます。洗浄のために、5つのML PBSで細胞を再懸濁し、前のステップと同じ条件を使用して遠心分離によって細胞懸濁液を回転させる。DDP を削除します。そして、DBSの2つのMLを使用して細胞枕を再中断します。マイクロリトルセルサスペンションを維持し、0.2%トレファンバロウの等しいボリュームと混合して、自動セルConnorのスロット挿入コニースライドをカウントする点でセルカウント負荷サンプルを推定し、画像自体を表示します。次に、セル数の結果を取得します。計算200万細胞は、1.5 ML.遠心分離によって2つのペレット細胞に細胞の数を移すノック実験ごとにエレクトロポレーションの評判を見つけるでしょう。時間を節約するために、電気散液混合物は、ベリンダ米のCRISPR CAS 9ベクター2.4マイクログラム、おしゃべりベクター、および再懸濁水のそれぞれ2.5マイクログラムを加える遠心化の間に調製することができる。新しい1.5 ML遠心チューブの55マクロごみの総総量は穏やかに頂点を頂点にします。よく混ぜるために簡単に立ちます。ルクソール圧力混合物と室温は使用前に放置してください。アスパートを紡糸した後、DTBは、この本質的に30秒間融合し、調製したエレクトロポレーション混合物ピペットを上下に加えることによってできるだけ多くの上清を除去し、細胞を徐々に下にする。10マイクロ小核派の先端を用いて細胞エレクトロポレーションミキサーを求めたエレクトロポレーションは、ピペットが重要であった。piのふれあいの間に気泡を避け、電気めっきの故障を犠牲にします。開始ボタンを押します。その後、操作はしばらくの間サンプルを転送します。24の井戸プレートは、総媒体が残りの4つの複製サンプルで上記と同じ電気圧力と手順を実行し、細胞の分布を均等にするためにプレートを穏やかに揺らします。細胞を48〜72時間インキュベーターで37度インキュベーターでインキュベートします。実際、細胞選別トランスフェクション後24時間で、私たち自身のために担当者から切り離された花性顕微鏡を使用してレストラン記者のための混乱2の発現を調べることは、エレクトロポレーションが正常に動作していることを示しています。パート4:推定ノックイン細胞を分離する細胞の並べ替え。細胞選別準備の前に、150マイクロの細胞タイプ特異的なグロス培地を持つ96マイクロプレートでは、培養とそれ自体のための間違った底マイクロの場所を使用し、すべての細胞のためのフラットボトムマイクロの場所で、チューブを氷の上に保ち、窓を通して箱をパスに入れる無菌FACSに細胞を転送します。 最適な細胞の回避性を達成するために、85マイクロメートルノズルと低流量の免疫細胞選別でセルソーターを設定し、セルソーターに接続して、通過窓の頂点からサンプルを短時間で採取し、サンプルを集めます。Champerは、フォード散乱とサイドスキャッタの最初に定義された販売漏斗を定義したセルソートのためのファクトスケートを設定し、セットトーク赤負細胞を得ることによって生命細胞を定義します。次に、FSC H 対 FSE を使用した単一単一の単一の細胞を多量多様ブロックで見つけます。最後に、細胞がCRISPRベクターとポケットベクターで正常にコトランスフェクトされたことを示すボルボ正の亜集団である場合、所望のDSR2とBのゲートを設定します。そこで96の各ウェルに10個の単細胞が、プリウォームを添加したプレートがよく、96を分別した後の期間モードまたは単細胞モードを用いて完全増殖培地を、細胞増殖のための細胞培養インキュベーター内のウェルプレート。第5部:陽性ノックイン細胞の上昇のスクリーニング 生き残った後、48ウェルプレート内の細胞は、壁型細胞を負の対照細胞集団として使用してBFPまたはフローサイトメトリーの発現を評価し、BFP陽性細胞のより高い割合を有し、我々が発現すべき細胞からのゲノムDNAの検証抽出物を満たすために保持される。BFPは、同種腕の各側にまたがるプライマー、すなわちゲノム配列内の1つの一次位置を、標的ベクターに外面にしてPCRによって単離されたゲノムDNAを通過させる。この実験でベクターと話し合う側を見て、1次で増幅されたPCR産物のサイズが1.2KVであると予測した。そして、F 2とR 2は1.2 KBサンガーシーケンシング結果です。したがって、PCR産物は、Rosa 26ルーカスに正しい位置とノック位置を示す各統合接合部の配列を示しています。私は免疫ブロッティングのように、タンパク質レベルの部分6の代表的な結果で正しいノックの検証を可能にします。前の研究で発表された例として、我々はOSDタグとのインターで45分子がタタックを得ることを表明し、その後USDタクトのチェックアウトT細胞に26の軌跡があった。私は45とインシデントディレクターを取得するか、アフィニティの浄化と質量分析の対象によって引き下げられます。彼らはプロテオミクスデータがT細胞の相互作用を明らかにした。したがって、この製品プールは、特定のタンパク質の機能を解明するための新しいインターカレーターの探索を大いに容易にしました。この技術的なプレゼンテーションは、一過性発現によって、Rosa 26遺伝子座の共発現およびBFPとの共発現ベクトルとの一時的に発現した1つのキャストラインRFPあたりの増加を示した。遺伝子操作では行いにくいT細胞とマクロファージの両方で、永久的な遺伝子発現を有するノッキング細胞株を生成しました。この方法と推奨事項は、タンパク質の同定、タンパク質相互作用研究など、免疫細胞の機械学的研究のために大きなDNAセグメントのアサーションで許可されたクリスに適用されます。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

蛍光活性化細胞選別（FACS）によって特定の細胞集団の精製

Experimental and clinical studies often require highly purified cell populations.  FACS is a technique of choice to purify cell populations of known ...

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

マウスT細胞におけるT細胞受容体のレトロウイルス導入

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

から胸腺リンパ腫のT細胞株の導出 ATM - / -</supと p53の - / -</supマウス

Established cell lines are a critical research tool that can reduce the use of laboratory animals in research. Certain strains of genetically modified ...

Methods to Assess Beta Cell Death Mediated by Cytotoxic T Lymphocytes

傷害性Tリンパ球によって媒介ベータ細胞死を評価するための方法

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease.  During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin ...

Generation of Multivirus-specific T Cells to Prevent/treat Viral Infections after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplant

同種造血幹細胞移植後のウイルス感染を予防/治療するMultivirus -特異的T細胞の生成

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully ...

Expanding Cytotoxic T Lymphocytes from Umbilical Cord Blood that Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr Virus, and Adenovirus

臍帯血から細胞傷害性Tリンパ球の拡大をそのターゲットサイトメガロウイルス、エプスタイン - バーウイルス、およびアデノウイルス

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

プライマリーヒトT細胞のpiggyBacトランスポゾンシステムの変更

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Mouse NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

マウスナイーブCD4<sup&gt; +</sup&gt; T細胞の単離と<em&gt;インビトロ</em&gt; T細胞サブセットへの分化

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Analyzing the Functions of Mast Cells In Vivo Using 'Mast Cell Knock-in' Mice

Analyzing the Functions of Mast Cells In Vivo Using 'Mast Cell Knock-in' Mice

「マスト細胞ノックイン」マウスを用いた生体内肥満細胞の機能解析

Mast cells (MCs) are hematopoietic cells which reside in various tissues, and are especially abundant at sites exposed to the external environment, such ...

An Efficient and Simple Method to Establish NK and T Cell Lines from Patients with Chronic Active Epstein-Barr Virus Infection

NK と慢性的なアクティブなエプスタイン ‐ バーウイルス感染症から T 細胞株を確立する効率的かつ簡単な方法

A number of methods have been described to establish NK/T cell lines from patients with lymphoma or lymphoproliferative syndrome. These methods employed ...