Name: gene knock-in by crispr/cas9 and cell sorting in macrophage and t cell lines
Uploaded: 2021-11-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Gene Knock-in by CRISPR/Cas9 and Cell Sorting in Macrophage and T Cell Lines at JoVE.com

신샹의과대학의 유동 세포측정 핵심 시설에 감사드립니다. 이러한 기술의 개발은 NSFC가 LZ, 81471595 및 YL에 32070898 81601360 보조금에 의해 지원되었습니다. 이 작품은 허난교육위원회 제21IRTSTHN030재단의 지원도 받고 있다.

1. 로사26 로커스를 대상으로 sgRNAs의 설계 및 플라스미드 건설
<ol><li>원하는 삽입 부위 주변의 설계 가이드 RNA
	<ol>
<li>마우스 Rosa26(이하 mRosa26로 지정) 노크-인 실험에 대한 삽입 부위가 mRosa26의첫 번째 인트론에 위치하고 있는지 확인; 이 사이트는 이전 연구에서 사용 되었습니다28,29. 인간 세포에서?...

우리의 실험에서, 우리는 예를 예로 인간 Jurkat T 세포 및 murine RAW264.7 대식세포를 사용하여 노크세포 검열 및 검증에 구조 설계에서 면역 세포에서 노크에 편집을 수행하는 방법을 보여주었습니다. T 세포및 대식세포주 모두 형질36,37에내성이 있다; 그러나 CRISPR/Cas9 전달의 저효율 문제는 세포 분류와 결합된 형광 기자의 도움으로 극복할 수 있다. 이 프?...

면역 세포는 병원체에 대한 방어를 위해 중요합니다. 선천성 면역은 감염제의 통관 및 조직 항상성1,2의유지보수에필요합니다. 세포주 모형은 포유류 면역 계통의 분자 기초를 이해하기 위한 필수적인 공구입니다; 그(것)들은 인간 T 세포 활성화를 모델링하는 것과 같은 체외 기능적인 소사에서 이용되고, 면역 반응3,4를활성화하거나 감쇠에 있는 유전 요인의 기능을 결정하는 에서. 포유류 면역 계통은 엄청나게 이질적이며, 동등하게 중요한, 분자의 거대한 숫자는 주어진 세포유형의분화, 이동 및 기능을 제어한다는 것을 주의하는 것이 중요합니다5,6.
클러스터링 정기적으로 간격짧은 Palindromic 반복 (CRISPR)/Cas9 게놈 편집 도구는 정확한 방식으로 유전자의 기능성 기여를 용이하게 특정 세포 유형의 유전자 조작을 허용7,8. 여러 개의 출판 된 프로토콜은 HEK293 세포에서 리보뉴클레오 단백질 (RNPs)으로 알려진 Cas9 가이드 RNA 복합체의 형태로 CRISPR / Cas9의 전달을 설명했습니다, Jurkat 세포주, 1차 T 세포9,10,대식세포11,12, 13,줄기 세포14,및 기타15,16. 이들 프로토콜에서, 유전자 태깅은 일반적으로 내인성단백질(17,18)에형광 태그를 융합시킴으로써 달성된다. 그러나 특히 면역 세포에서 노크 인 실험19,20을용이하게하기 위해 단일 세포 분류와 호환되는 이중 형광 기자를 사용하는 시도는 거의 이루어지지 않았습니다.
면역 세포에 있는 새로운 유전 인자의 기능을 이해하기 위한 심층 기계분석은 일반적으로 유전자의 세포 형 특정 삭제, 유전 구조 실험 및 그것의 상호 작용자의 이상적으로 확인을 요구합니다. 면역 세포에서 유전자의 유전 삭제를 최적화하는 방법이9,15,21에발표되었음에도 불구하고 면역 반응을 이해하기 위해 다재다능한 기능을 가진 노크 인 알레를 도입하는 방법은 훨씬 적습니다. 따라서, 이 프로토콜에서 우리는 인간과 뮤린 면역 세포주 모두에서 안전한 항구 궤엽로26에서 관심있는 단백질 (POI)을 표현하는 효율적이고 매우 재현 가능한 프로토콜을 자세히 설명하는 것을 목표로합니다. CRISPR/Cas9(DsRed2)를 발현하는 플라스미드와 세포 분류에 의해 격리될 수 있는 재조합 DNA 템플릿(EBFP2)을 발한 플라스미드로 감염된 세포를 보강하기 위해 2색 리포터 시스템을 설계했습니다. 이 프로토콜에 따라, 우리는 제대로 연구된 단백질의 기능적 분석을 위해 인간 T 세포주 Jurkat 및 뮤린 대식세포 RAW264.7의 다중 노크-인 라인을 획득했습니다.
예를 들어, 우리는 인간 ACE2 (SARS-Cov-2의 수용체)22를안정적으로 표현하는 노크인 RAW264.7 대식세포를 얻는 방법을 이 프로토콜에서 보여준다. 선천성 면역 세포는 Covid-1923,24 및 인간 ACE2의 병인에 관여하기 때문에 복제 전에 세포로 바이러스 성 진입에 필요한 주요 수용체로 간주되기 때문에, 인간 ACE2의 노크와 대식세포는 대식세포 내부의 바이러스 증식 연구의 기계형 연구를위한 유용한 도구로 사용될 수 있습니다. 병행하여, 우리는 또한 친화성 트윈 스트렙 태그 (OST)와 그것의 아미노산 종결에서 융합된 RASGRP1 단백질을 표현하기 위하여 인간 ROSA26 메뚜기에서 유전자의 노크인의 예를 제시합니다. T 세포는 면역 요법에서 주요 표적 세포이며, 연구의 증가는 암에 그들의 반응성의 조작에 초점을맞추고있다 25,26. Rasgrp1은 T 세포 수용체의 주요 신호 분자 하류로 알려져 있으며 그 인터액터는 잘 해명되지 않는27,OST-RASGRP1 노크 -인 모델은 종양 및 감염에 T 세포의 반응을 조절하는 상호 작용을 식별하기위한 기초를 제공합니다. 종합하면, 이 공구는 Covid-19 연구 및 Rasgrp1와 상호 작용하는 새로운 분자의 발견에 이용될 수 있습니다.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Amersham Imager 600</td>
			<td>Ge Healthcare</td>
			<td></td>
			<td>imaging of chemiluminescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin, sodium salt</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>194526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>7074</td>
			<td>at 1/5000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-RasGRP1 antibody, clone 10.1</td>
			<td>Merck</td>
			<td>MABS146</td>
			<td>1.0 &#956;g/mL of working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AscI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0558S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Actin (D6A8) Rabbit mAb</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>8457</td>
			<td>at 1/1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BamHI-HF</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3136S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BbsI-HF</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3539S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellometer Mini Automated Cell Counter</td>
			<td>Nexcelom Bioscience</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.coli DH5&#945; Competent Cells</td>
			<td>Takara</td>
			<td>9057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO (Dimethyl Sulfoxide)</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>196055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNeasy Blood &#38; Tissue Kits</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69506</td>
			<td>cell culture reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (10X), no calcium, no magnesium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14200075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) with high glucose</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30022.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRI-HF</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3101S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSAria&#8482; Fusion</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>equipped with biosafety cabinet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Canto flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 5 ml polystyrene round bottom test tube</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10099141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo version 10.7</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH (D16H11) XP&#160;Rabbit mAb</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>5174</td>
			<td>at 1/1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>31430</td>
			<td>at 1/5000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon ECL Ultra Western HRP Substrate</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>WBKLS0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon-PSQ PVDF Membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ISEQ00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jurkat</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB-152</td>
			<td>https://www.atcc.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin sulfate</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>194531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB agar powder</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>22700041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-channel Pipette (30-300 &#956;L)</td>
			<td>Eppendorf, or similar</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MPK5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System, 10 &#956;L kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MPK1096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 15 mL Conical Sterile Centrifuge Tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>339651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OneTaq&#174; Hot Start Quick-Load&#174; 2X Master Mix</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>(M0489)</td>
			<td>for high GC% template</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>26616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip 0.1-20&#181;l</td>
			<td>Eppendorf, or similar</td>
			<td>0030 075.005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip 2-200&#181;l</td>
			<td>Eppendorf, or similar</td>
			<td>0030 075.021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip 50-1000&#181;l</td>
			<td>Eppendorf, or similar</td>
			<td>0030 075.064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pX458-DsRed2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>112219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td>purify plasmid from restriction digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0494S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RAW264.7</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB-71</td>
			<td>https://www.atcc.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Anti-ACE2 antibody [EPR4435(2)]</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab108252</td>
			<td>at 1/1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30027.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strep-Tactin Sepharose beads</td>
			<td>IBA Lifesciences</td>
			<td>2-1201-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTOX&#8482; Red Dead Cell Stain, for 633 or 635 nm excitation</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S34859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Polynucleotide Kinase</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution (0.25%), with phenol red</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZOE Fluorescent Cell Imager</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microtubes, PCR-clean</td>
			<td>Eppendorf, or similar</td>
			<td>0030 125.215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Clear Flat Bottom Polystyrene TC-treated Microplates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Clear Round Bottom TC-treated Microplate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3799</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

gene knock-in by crispr/cas9 and cell sorting in macrophage and t cell lines

면역 계통의 기능적인 유전체학 연구 결과는 표적 유전자의 삭제 및 관심있는 단백질에 요소의 추가를 둘 다 관련시키는 유전 조작을 요구합니다. 세포주 모형에 있는 유전자 기능의 확인은 세포 본질적인 기계장치의 유전자 발견 그리고 탐구를 위해 중요합니다. 그러나 CRISPR/Cas9 매개 노크인을 사용하여 T 세포 및 대식세포와 같은 면역 세포의 유전자 조작은 특히 정지 상태에서 이러한 세포의 낮은 경질 효율 때문에 어렵습니다. 면역 세포에서 유전자를 수정하기 위해 약물 내성 선택 및 바이러스 벡터는 전형적으로 CRIPSR/Cas9 시스템을 발현하는 세포를 보강하는 데 사용되며, 이는 필연적으로 세포의 바람직하지 않은 개입을 초래합니다. 이전 연구에서는 전기기화 후 일시적으로 표현된 CRISPR/Cas9에 결합된 이중 형광 기자를 설계했습니다. 이 기술적인 해결책은 면역 세포에 있는 급속한 유전자 삭제로 이끌어 냅니다; 그러나, 약물 내성 선택 또는 바이러스 벡터를 사용하지 않고 T 세포 및 대식세포와 같은 면역 세포에서 유전자 노크인은 더욱 도전적이다. 본 기사에서는, 당사는 세포 선별을 사용하여 기증자 플라스미드와 함께 Rosa26 궤적을 대상으로 CRISPR/Cas9 구조를 과도하게 표현하는 세포의 선택을 지원함으로써, 유전자 노크-인은 약물 저항 농축 없이 T 세포 및 대식세포 모두에서 달성될 수 있다는 것을 보여준다. 예를 들어, 우리는 인간 ACE2를 발현하는 방법을 보여줍니다, SARS-Cov-2의 수용체, 이는 현재 Covid-19 전염병에 대한 책임이, RAW264.7 대식세포에서 노크 -인 실험을 수행하여. 이러한 유전자 노크 세포는 기계학 연구에 널리 사용될 수 있다.

murine RAW264.7 대식세포를 사용하여 mRosa26 궤적에서 노크-인 실험을 수행하기 위해 전술한 프로토콜에 따라, SARS-Cov-2바이러스(도 2A)의수용체인 인간 ACE2를 발현하기 위한 표적 벡터를 설계하였다. 유사한 설계를 사용하여, 우리는 OST 태그 RASGRP1 융합 단백질(도 2C)의노크인인간 Jurkat T 세포를 생성했다. 3개의 플라스미드의 전환 후, 그 중 2개는 CRISPR/...

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Gene Knock-in by CRISPR/Cas9 and Cell Sorting in Macrophage and T Cell Lines

이 프로토콜은 형광 기자 및 세포 분류를 사용하여 대식세포 및 T 세포주에서 노크-인 실험을 단순화합니다. 2개의 플라스미드는 면역 세포에 있는 Rosa26 메뚜기에서 영구적으로 통합되는 EBFP2를 표현하는 EBFP2를 표현하는 상동성 재조합 기증자 플라스미드와 CRISPR/Cas9- 및 DsRed2 표현 플라스미드와 균등하게 재조합 기증자 플라스미드인 이러한 단순화된 노크-인 실험에 사용됩니다.

CRISPR/Cas9 및 대식세포 및 T 세포주에서 세포 분류에 의한 유전자 노크인

Functional genomics studies of the immune system require genetic manipulations that involve both deletion of target genes and addition of elements to ...

이 프로토콜의 목표는 형광 기자의 도움으로 대식세포 및 T 세포주에서 CRISPR/Cas9 매개 노크-인 실험을 단순화하고 세포 분류에 영향을 미치는 것입니다. ROSA26 로커스는 게놈의 삽입을 위한 유전체 안전 항구 사이트로 알려져 있습니다. 26개의 궤적 또는 인간 직교 로그에 대한 마우스 세계 또는 공격 없이 관심 있는 단백질을 표현하는 것이 보통입니다.Part 1: 디자인 및 SgRNAs의 플라스미드 건설로 로사26 로커스를 타겟팅합니다. 먼저 마우스 Rosa26 궤적으로부터 sgRNAs를 설계하고 마우스 게놈 정보학 및 앙상블 게놈 브라우저의 서열을 사용하여 마우스 Rosa26 유전자의 게놈 서열을 다운로드합니다. 온라인 웹 도구인 CRISPOR로 이동하여 Rosa26 Locus의 입력 시퀀스 100쌍을 붙여넣습니다.그런 다음 게놈을 선택, 예를 들어, 머스 근육 마우스 참조 게놈 2011. 다음으로, PAM의 유형을 선택합니다.제출을 클릭합니다. 높은 특이성 점수, 높은 수행 점수, 적은 오프 대상가이드를 선택합니다. 비효율적인 것으로 표시된 가이드는 피해야 합니다.특히, 중복 시퀀스를 가진 두 개의 가이드를 선택하는 것이 바람직하며, 이는 보고된 대로 노크인 효율을 높일 수 있습니다. 따뜻한 식사 순서를 위해, 앞으로 불법 및 반전 불법 합성, 인과 요인에 복제에 대 한 준비. 발액사당 선형화된 감소를 준비하여, 닐을 얻는 것과 같이 BBS 1회 소화에 의해 리포터를 해야 하며, 최종 구조를 생성하는 선형 벡터에 대한 법적, 즉 가이드 RNA와 DSRIP 2개의 형광 리포터와 연결된 CAS 9핵을 동시에 표현한다.2부:대상 벡터를 동종 재조합 템플릿으로 구성합니다. 관심 있는 단백질의 발현을 위해. 예를 들어, 인간은 계속되었습니다.상용 소스 및 친화성 OST 태그 또는 다른 일반적으로 사용되는 공격으로 cDNA 서열을 합성할 수 있으며, 단백질의 정제를 위한 다른 일반적으로 사용되는 공격은 cDNA 서열에 융합될 수 있다. cDNA가 시작되기 전에 카자크 합의 서열을 포함해야 합니다. Asc1 제한 효소에 의해 소화되고, CD와 삽입을 백본에 넣는 것과 같습니다.Vactor, 즉 pKhR26-IBFP IBP는 최종 타겟팅을 산출하여 컨테이너, 각각 5개의 프라임 및 3개의 프라임 동상무기의 KB를 농축합니다. 표현 캐스트 세트에는 VFD 리포터와 폴리 AC 펀드의 경우 Iis에 연결된 Koonin 지역을 원하는 경우 CG 프로모터인 UST 레스토랑이 포함됩니다. 마지막으로 에코R1 또는 BamH1과 같은 독특한 커터 효소를 사용하여 수평선 표적 벡터에, 소화 및 제품은 전기 기화 노트에 마이너스 20도 매장에서 정제된다.선형 벡터 DNA의 고농도를 얻는 것이 좋습니다. 3부:대식세포와 T세포선의 전기포레이션은 게리톡 세포에 대한 분리를 따랐다. 최적의 세포 밀도는 형질 전환 시 ML당 약 0.5백만 개의 세포였다.10개의 매크로 리틀 핵 패션 팁 포맷의 전체 전기화는 500 마이크로리터의 완전한 성장을 포함하는 24개의 웰 플레이트를 준비하고, 각 우물에 항생제가 없는 매체를 준비한다. 플레이트를 가습 37도, 5%로 미리 떼어 그 설정 인큐베이터. 제트 고양이 또는 Rosales에 대한 전기 작동 시스템 입력 전기 기화 매개 변수를 거절하십시오.세포 DNA 혼합물 후속 을 준비하거나 수술은 닭 세포를 수집합니다. 커친 25 평방 센티미터 플라스크 15 동물에서 전송 세포. 튜브 이후, 다음 실온에서 8 분 동안 90 회 G에서 센티미터에 의해 세포를 필립, 그것을 요청, 초월제.세척을 위해, 5ML PBS로 세포를 다시 중단한 다음 이전 단계와 동일한 조건을 사용하여 원심분리에 의해 세포 현탁액을 회전시한다. DP를 제거합니다. 그리고 DBS의 두 ML을 사용하여 셀 베개를 다시 중단합니다.마이크로 작은 셀 서스펜션을 유지하고 0.2%의 Trepan Ballou의 동일한 부피와 혼합하여 자동 셀 코너에서 슬롯 삽입 코니 슬라이드를 계산하는 측면에서 셀 카운트 로드 샘플을 추정하고 이미지 자체를 볼 수 있습니다. 그런 다음 셀 카운트 결과를 가져옵니다. 2백만 개의 세포를 계산하면 노크 실험당 전기기화의 평판이 1.5 ML.원심분리기 2개의 펠릿 세포로 원심분리로 세포의 수를 전송한다.시간을 절약하기 위해, 전기화 혼합물은 벨린다 쌀의 CRISPR CAS 9 벡터 2.4 마이크로그램의 2.5 마이크로그램을 추가하는 원심화 중에 제조될 수 있고, 말화 벡터, 및 재서스펜션 버팔로. 새로운 1.5 ML 원심 분리 튜브에 55 매크로 쓰레기의 총 볼륨을 부드럽게 정점과. 짧게 잘 섞어 서 있다.사용 전에 룩소르 압력 혼합물과 실온을 그대로 둡니다. 인분 회전 후, DTB는 이 본질적으로 추가 30 초 동안 퓨즈, 준비 된 전기 화 혼합물 파이펫을 부드럽게 추가하여 가능한 한 많은 상류체를 제거합니다. 전기기는 10 마이크로 작은 핵 파면 팁을 사용하여 세포 전기 화 믹서를 요구파이펫 중요했다.파이 페팅 중에 기포를 피하면 전자 도금 장애가 발생합니다. 시작을 누릅니다. 그 후 작업이 샘플을 잠시 동안 전송합니다.24의 우물 판은, 총 배지가 나머지 4개의 복제된 견본에 위와 같이 동일한 전기 압력 및 절차를 능력을 발휘하고, 부드럽게 세포의 분포를 보장하기 위하여 판을 흔들어. 세포를 37도 인큐베이터에서 48~72시간 동안 배양한다. 실제로, 세포 분류 24 시간 후 형질전환에서, 우리 자신에 대한 담당자에서 분리 된 꽃집 현미경 을 사용하여 레스토랑 기자에 대한 중단 2의 표현을 검사하는 것은 전기 기공이 제대로 작동하고 있음을 나타냅니다.부품 4:세포 선별을 통해 putative knock-in 세포를 분리합니다. 세포 선별 준비 전에, 잘 당 150 마이크로 작은 세포 유형 특정 총 배지와 96 잘 플레이트에서 배양 및 자체에 대한 잘못된 바닥 마이크로 장소를 사용하고 모든 세포가 멸균 FACS로 세포를 전송하여 튜브를 얼음에 보관하고 창문을 통해 경로에 상자를 넣는 경우, 최적의 세포 증발성 및 생존을 달성하기 위해 면역 세포 분류를 위한 85 마이크로 미터 노즐 및 낮은 유량으로 셀 선별실에 연결하여 통과 창 정점에서 샘플을 간단히 채취하고, 수집에 샘플을 로드합니다. Champer는 포드 산란 및 측면 분산에 대한 첫 번째 정의 판매 깔때기를 정렬하기위한 팩트 스케이팅을 설정한 다음 세트 토크를 얻어 서 생명 세포를 정의적 인 음수 세포를 설정합니다.다음으로, FSC H 대 FSE를 사용하여 단일 게이팅을 사용하여 다각적인 블록을 찾습니다. 마지막으로 볼보 양성 하위 인구가 있는 경우 원하는 DSR 2및 B에 대한 게이트를 설정하여 CRISPR 벡터 및 포켓링 벡터로 성공적으로 감염된 세포를 나타냅니다. 따라서 96의 각 웰에 있는 10개의 단일 세포, 잘 플레이트는 프리웜으로 보충되고, 세포 확장을 위한 세포 배양 인큐베이터에서 96을 분류한 후 기간 모드 또는 단일 세포 모드를 사용하는 완전한 성장 배지.부품 5:양성 노크세포의 고도의 선별은 생존후 약 2주간의 세포 팽창 후, 48웰 플레이트의 세포는 음의 대조군 세포 집단으로서 벽형 세포를 이용하여 증식세포의 작은 비율을 이용하여 BFP 또는 유동 세포의 발현을 평가하고, BFP 양성 세포의 높은 비율을 보유하여 세포로부터 게놈 DNA를 발현하도록 유지한다. BFP는 동종 무기의 각 측면에 걸쳐 프라이머와 PCR에 의해 격리 된 게놈 DNA를 전달, 즉 하나의 주요 게놈 서열에서 찾습니다, 외부 표적 벡터. 본 측에서 벡터와 대화하는 것으로, 1차로 증폭된 PCR 제품의 크기는 1.2 KV이다. 그리고 F 2와 R 2는 1.2 KB Sanger 시퀀싱 결과입니다. 따라서 PCR 제품은 로사 26 루카스에 올바른 위치를 보여주는 각 통합 접합의 시퀀스를 보여줍니다.면역 블로팅이 단백질 레벨 6 부에서 올바른 노크의 유효성 검사를 가능하게하는 것처럼 말합니다. 예를 들어, 이전 연구에서 발표된 45개의 분자가 OSD 태그와 인터어프를 하고, 계산T 세포에 26개의 궤적이 있다는 것을 이후에 USD 전술로 표현했습니다. 나는 45 및 사건 이사를 얻거나 친화성 정화와 대량 분석의 대상이됩니다.그(것)들은 T 세포의 상호 작용을 드러낸 proteomics 데이터. 따라서 이 제품 풀은 주어진 단백질의 기능을 해명하기 위해 새로운 인터컬레이터를 찾는 것을 크게 촉진했습니다. 이 기술적인 프리젠테이션은 로사 26 궤적에 대해 토크 벡터와 BFP를 결합하여 캐스트 라인 RFP당 과도적으로 증가된 것으로 나타났다.우리는 유전 조작에서 수행하기 어려운 T 세포와 대식세포 모두에서 영구적 인 유전자 발현으로 두드리는 세포주를 생성했습니다. 이 방법 및 권고는 단백질의 식별, 단백질 상호 작용 연구 와 같은 면역 세포의 기계론 적 연구를 위한 대형 DNA 세그먼트의 주장에 허용되는 Chris에 적용됩니다.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

형광 활성 세포 정렬 (외과)에 의해 특정 세포 인구의 정제

Experimental and clinical studies often require highly purified cell populations.  FACS is a technique of choice to purify cell populations of known ...

연구

면역학 및 감염병학

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

마우스 T - 세포에서 T - 세포 수용체의 Retroviral 전달

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

에서 Thymic 림프종 T - 세포 라인의 유도 ATM - / -</sup과 p53의 - / -</sup 마우스

Established cell lines are a critical research tool that can reduce the use of laboratory animals in research. Certain strains of genetically modified ...

Methods to Assess Beta Cell Death Mediated by Cytotoxic T Lymphocytes

세포 독성 T Lymphocytes에 의해 베타 세포 죽음의 중재를 평가하는 방법

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease.  During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin ...

Generation of Multivirus-specific T Cells to Prevent/treat Viral Infections after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplant

Multivirus 특정 T 세포 생성 Allogeneic 조혈 줄기 세포 이식 후 바이러스 감염을 예방 / 치료

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully ...

Expanding Cytotoxic T Lymphocytes from Umbilical Cord Blood that Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr Virus, and Adenovirus

탯줄 혈액에서 세포 독성 T 림프구 확장이 대상 사이토 메갈로 바이러스, 엡스타인 - 바 바이러스, 그리고 아데노 바이러스

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

기본 인간 T 세포 piggyBac Transposon 시스템 변경

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Mouse NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

마우스 나이브 CD4<sup&gt; +</sup&gt; T 세포의 분리 및<em&gt; 시험관</em&gt; T 세포 하위 집합으로 차별화

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Analyzing the Functions of Mast Cells In Vivo Using 'Mast Cell Knock-in' Mice

Analyzing the Functions of Mast Cells In Vivo Using 'Mast Cell Knock-in' Mice

'마스트 셀 노크-인' 마우스를사용 하 여 생체 내 비만 세포의 기능 분석

Mast cells (MCs) are hematopoietic cells which reside in various tissues, and are especially abundant at sites exposed to the external environment, such ...

An Efficient and Simple Method to Establish NK and T Cell Lines from Patients with Chronic Active Epstein-Barr Virus Infection

NK과 만성 활성 엡 스타인-바 바이러스 감염을 가진 환자에서 T 셀 라인을 설정 하는 효율적이 고 간단한 방법

A number of methods have been described to establish NK/T cell lines from patients with lymphoma or lymphoproliferative syndrome. These methods employed ...