Name: gene knock-in by crispr/cas9 and cell sorting in macrophage and t cell lines
Uploaded: 2021-11-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Gene Knock-in by CRISPR/Cas9 and Cell Sorting in Macrophage and T Cell Lines at JoVE.com

Vi takker strømningscytometrikjerneanlegget til Xinxiang Medical University. Utviklingen av slik teknologi har blitt støttet av NSFC-tilskudd 81601360 til LZ, 81471595 og 32070898 til YL. Arbeidet støttes også av Stiftelsen Henan Educational Committee No. 21IRTSTHN030.

1. Design og plasmid konstruksjon av sgRNAer rettet mot Rosa26 Locus
<ol><li>Designguide RNAer rundt ønsket innsettingssted
	<ol>
<li>Forsikre deg om at innsettingsstedet for mus Rosa26 (heretter utpekt som mRosa26) knock-in eksperimenter er plassert i den første intronen av mRosa26; dette nettstedet har blitt brukt i tidligere studier28,29. For knock-in eksperimenter i menneskelige celler,...

I våre eksperimenter demonstrerte vi hvordan man utfører knock-in redigering i immunceller fra konstruksjonsdesign til knock-in cellescreening og validering ved hjelp av menneskelige Jurkat T-celler og murine RAW264.7 makrofager som eksempler. Både T-cellen og makrofagcellelinjene er motstandsdyktige mot transfeksjon36,37; Imidlertid kan problemet med lav effektivitet av CRISPR / Cas9-levering overvinnes ved hjelp av fluorescerende reportere kombinert med cell...

Immunceller er kritiske for forsvar mot patogener. Både medfødt og adaptiv immunitet er nødvendig for clearance av smittestoffer og vedlikehold av vev homeostase1,2. Cellelinjemodeller er viktige verktøy for å forstå det molekylære grunnleggende i pattedyrets immunsystem; de brukes i in vitro funksjonelle analyser, for eksempel de som modellerer menneskelig T-celleaktivering, og for å bestemme funksjonen til genetiske faktorer i å aktivere eller dempe immunresponser3,4. Det er viktig å merke seg at pattedyrets immunsystem er enormt heterogent og like viktig, et stort antall molekyler kontrollerer differensiering, migrasjon og funksjon av en gitt celletype5,6.
Clustered Regelmessig Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/Cas9 genomredigeringsverktøy gir mulighet for genetisk manipulering av bestemte celletyper, noe som letter funksjonell merknad av gener på en presis måte7,8. Flere publiserte protokoller har beskrevet levering av CRISPR/Cas9 i form av Cas9-guide RNA-komplekser kjent som ribonukleoproteiner (RNPer) i HEK293-celler, Jurkat-cellelinjer, primære T-celler9,10, makrofager11,12,13, stamceller14og andre15,16. I disse protokollene oppnås genmerking vanligvis ved å fusjonere en fluorescerende tag til endogene proteiner17,18. Det er imidlertid gjort få forsøk på å bruke to fluorescerende reportere, som er kompatible med enkeltcellesortering, for å lette knock-in-eksperimenter19,20, spesielt i immunceller.
Dyptgående mekanistiske analyser som tar sikte på å forstå funksjonene til en ny genetisk faktor i immunceller, krever generelt cellespesifikk sletting av et gen, genetiske redningseksperimenter og ideelt identifisering av interaktivitetene. Selv om metoder for optimalisering av genetisk sletting av gener i immunceller har blitt publisert9,15,21, er det rapportert langt færre metoder for å introdusere knock-in alleler med allsidige funksjoner for å forstå immunresponsen. Derfor, i denne protokollen tar vi sikte på å beskrive i detalj en effektiv og svært reproduserbar protokoll for å uttrykke et protein av interesse (POI) på safe harbor locus Rosa26 i både menneskelige og murine immuncellelinjer. Vi designet et tofarget reportersystem for å berike for celler transfektert med plasmider som uttrykker CRISPR / Cas9 (DsRed2) og en rekombinant DNA-mal (EBFP2), som kan isoleres ved cellesortering. Etter denne protokollen fikk vi flere knock-in linjer av den menneskelige T-cellelinjen Jurkat og murine makrofag RAW264.7 for funksjonelle analyser av dårlig studerte proteiner.
Som et eksempel viser vi i denne protokollen hvordan du får knock-in RAW264.7 makrofager som stabilt uttrykker menneskelig ACE2 (en reseptor av SARS-Cov-2)22. Fordi medfødte immunceller er involvert i patogenesen av Covid-1923,24 og menneskelig ACE2 anses som en stor reseptor som kreves for viral oppføring i celler før replikering, kan makrofager med knock-in av menneskelig ACE2 tjene som et nyttig verktøy for mekanistiske studier av viral multiplikasjon inne i makrofager. Parallelt presenterer vi også et eksempel på knock-in av et gen ved det menneskelige ROSA26-locus for å uttrykke RASGRP1-proteinet, som ble smeltet sammen ved sin amino terminus med en affinitet Twin-Strep-tag (OST). T-celler er viktige målceller i immunterapi, og et økende antall studier har fokusert på manipulering av deres respons på kreft25,26. Siden Rasgrp1 er kjent for å være et viktig signalmolekyl nedstrøms for T-cellereseptoren og dens interagere ikke er godt belyst27, gir OST-RASGRP1 knock-in-modellen grunnlaget for å identifisere interagere som regulerer T-cellenes respons på svulster og infeksjon. Samlet sett kan disse verktøyene brukes til Covid-19-studier og oppdagelsen av nye molekyler som samhandler med Rasgrp1.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amersham Imager 600</td>
			<td>Ge Healthcare</td>
			<td></td>
			<td>imaging of chemiluminescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin, sodium salt</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>194526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>7074</td>
			<td>at 1/5000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-RasGRP1 antibody, clone 10.1</td>
			<td>Merck</td>
			<td>MABS146</td>
			<td>1.0 &#956;g/mL of working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AscI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0558S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Actin (D6A8) Rabbit mAb</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>8457</td>
			<td>at 1/1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BamHI-HF</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3136S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BbsI-HF</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3539S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellometer Mini Automated Cell Counter</td>
			<td>Nexcelom Bioscience</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.coli DH5&#945; Competent Cells</td>
			<td>Takara</td>
			<td>9057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO (Dimethyl Sulfoxide)</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>196055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNeasy Blood &#38; Tissue Kits</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69506</td>
			<td>cell culture reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (10X), no calcium, no magnesium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14200075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) with high glucose</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30022.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRI-HF</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3101S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSAria&#8482; Fusion</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>equipped with biosafety cabinet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Canto flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 5 ml polystyrene round bottom test tube</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10099141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo version 10.7</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH (D16H11) XP&#160;Rabbit mAb</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>5174</td>
			<td>at 1/1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>31430</td>
			<td>at 1/5000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon ECL Ultra Western HRP Substrate</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>WBKLS0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon-PSQ PVDF Membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ISEQ00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jurkat</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB-152</td>
			<td>https://www.atcc.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin sulfate</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>194531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB agar powder</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>22700041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-channel Pipette (30-300 &#956;L)</td>
			<td>Eppendorf, or similar</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MPK5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System, 10 &#956;L kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MPK1096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 15 mL Conical Sterile Centrifuge Tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>339651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OneTaq&#174; Hot Start Quick-Load&#174; 2X Master Mix</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>(M0489)</td>
			<td>for high GC% template</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>26616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip 0.1-20&#181;l</td>
			<td>Eppendorf, or similar</td>
			<td>0030 075.005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip 2-200&#181;l</td>
			<td>Eppendorf, or similar</td>
			<td>0030 075.021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip 50-1000&#181;l</td>
			<td>Eppendorf, or similar</td>
			<td>0030 075.064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pX458-DsRed2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>112219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td>purify plasmid from restriction digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0494S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RAW264.7</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB-71</td>
			<td>https://www.atcc.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Anti-ACE2 antibody [EPR4435(2)]</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab108252</td>
			<td>at 1/1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30027.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strep-Tactin Sepharose beads</td>
			<td>IBA Lifesciences</td>
			<td>2-1201-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTOX&#8482; Red Dead Cell Stain, for 633 or 635 nm excitation</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S34859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Polynucleotide Kinase</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution (0.25%), with phenol red</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZOE Fluorescent Cell Imager</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microtubes, PCR-clean</td>
			<td>Eppendorf, or similar</td>
			<td>0030 125.215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Clear Flat Bottom Polystyrene TC-treated Microplates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Clear Round Bottom TC-treated Microplate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3799</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

gene knock-in by crispr/cas9 and cell sorting in macrophage and t cell lines

Funksjonelle genomikkstudier av immunsystemet krever genetiske manipulasjoner som innebærer både sletting av målgener og tilsetning av elementer til proteiner av interesse. Identifisering av genfunksjoner i cellelinjemodeller er viktig for genoppdagelse og utforskning av celleintrinsiske mekanismer. Imidlertid er genetiske manipulasjoner av immunceller som T-celler og makrofagcellelinjer ved hjelp av CRISPR / Cas9-mediert knock-in vanskelig på grunn av den lave transfeksjonseffektiviteten til disse cellene, spesielt i en passiv tilstand. For å modifisere gener i immunceller, brukes valg av legemiddelresistens og virale vektorer vanligvis til å berike celler som uttrykker CRIPSR / Cas9-systemet, noe som uunngåelig resulterer i uønsket inngrep av cellene. I en tidligere studie designet vi to fluorescerende reportere koblet til CRISPR/Cas9 som ble midlertidig uttrykt etter elektroporasjon. Denne tekniske løsningen fører til rask gensletting i immunceller; Imidlertid er gen-knock-in i immunceller som T-celler og makrofager uten bruk av valg av legemiddelresistens eller virale vektorer enda mer utfordrende. I denne artikkelen viser vi at ved å bruke cellesortering for å hjelpe til med å velge celler som transient uttrykker CRISPR/Cas9-konstruksjoner rettet mot Rosa26-gresset i kombinasjon med en donorplasmid, kan gen-knock-in oppnås i både T-celler og makrofager uten berikelse av legemiddelresistens. Som et eksempel viser vi hvordan man uttrykker menneskelig ACE2, en reseptor av SARS-Cov-2, som er ansvarlig for den nåværende Covid-19-pandemien, i RAW264.7 makrofager ved å utføre knock-in-eksperimenter. Slike gen knock-in celler kan brukes mye til mekanistiske studier.

Etter protokollen beskrevet ovenfor for å utføre knock-in eksperimenter på mRosa26 locus ved hjelp av murine RAW264.7 makrofager, designet vi en målrettingsvektor for å uttrykke menneskelig ACE2, en reseptor for SARS-Cov-2-viruset (Figur 2A). Ved hjelp av en lignende design genererte vi humane Jurkat T-celler med knock-in av OST-merket RASGRP1 fusjonsprotein (Figur 2C). Etter transfeksjon av tre plasmider, hvorav to ble brukt til uttrykk for CRISPR...

Watch this Scientific Journal Video about Gene Knock-in by CRISPR/Cas9 and Cell Sorting in Macrophage and T Cell Lines at JoVE.com

Gene Knock-in by CRISPR/Cas9 and Cell Sorting in Macrophage and T Cell Lines

Denne protokollen bruker fluorescerende reportere og cellesortering for å forenkle knock-in eksperimenter i makrofag og T-cellelinjer. To plasmider brukes til disse forenklede knock-in-eksperimentene, nemlig en CRISPR /Cas9- og DsRed2-uttrykkende plasmid og en homolog rekombinasjonsdonor plasmid som uttrykker EBFP2, som er permanent integrert ved Rosa26-locus i immunceller.

Gene Knock-in fra CRISPR/Cas9 og cellesortering i makrofag og T-cellelinjer

Functional genomics studies of the immune system require genetic manipulations that involve both deletion of target genes and addition of elements to ...

Målet med denne protokollen er å forenkle CRISPR/Cas9 mediert knock-in eksperiment i makrofag og T-celle linjer, ved hjelp av fluorescerende reportere og påvirke celle sortering. ROSA26 Locus er kjent som et genomisk trygt havnested for innsetting av transgenes. Det er vanlig å uttrykke protein av interesse med eller uten angrep i museverdenen på 26 locus, eller i den menneskelige ortho-loggen.Del 1: Design og Plasmidkonstruksjon av sgRNAer rettet mot Rosa26 Locus. Først, design sgRNAs fra musen Rosa26 locus, ved hjelp av sekvenser fra mus genom informatikk, og Ensemble Genome Browser, deretter laste ned den genomiske sekvensen av musen Rosa26 genet. Gå til det elektroniske nettverktøyet CRISPOR, lim inn 100 basispar av inngangssekvensen fra Rosa26 Locus.Velg deretter et genom, for eksempel Mus musculus-mouse referansegenom 2011. Velg deretter typen PAM. Bruk 20bp NGG"PAM motiv, anerkjent av spCas9.Klikk Send. Velg guide med høy spesifisitetspoengsum, høy poengsum og færre mål. Guider som er angitt som ineffektive, bør unngås.Spesielt er det foretrukket å velge to guider med overlappende sekvenser, noe som kan øke knock-in-effektiviteten som rapportert. For varm spisesekvens, syntetisere en fremover ulovlig og en reversering ulovlig, som annealed fosforert og klar for kloning til faktor. Forbered den lineariserte nedgangen per Vactor som kan uttrykke er at jeg må reporter av BBS en fordøyelse, som få Neal, legalene til den lineariserte vektoren for å generere den endelige konstruksjonen, som samtidig uttrykker guide RNA og CAS ni kjernene knyttet til en DSRIP to fluorescerende reporter.Del to:Konstruksjon av målrettingsvektor som homolog rekombinasjonsmal. For uttrykk for protein av interesse. For eksempel varte mennesket opp.Du vil syntetisere cDNA-sekvensen etter kommersiell kilde og affinitet OST-tag eller andre ofte brukte angrep for rensing av protein kan smeltes sammen til cDNA-sekvensen. Husk å inkludere Kazak-konsensussekvensen før oppstarten av cDNA. Fordøyd av Asc1 begrensning enzym, og som få CDen og innsatsen inn i ryggraden.Vactor, nemlig pKhR26-IBFP IBP som gir den endelige målrettingen konsentrerer beholderen, hver av dem, KB på fem prime og tre prime homologe armer. Uttrykket rollebesetningssett inkluderer en CG-promotør, UST-restauranten, hvis du vil ha Koonin-regionen knyttet til en Iris, hvis VFD-reporter og et poly AC-fond. Endelig i horisonten rettet mot vektor ved hjelp av unike kutterenzymer, for eksempel EcoR1 eller BamH1, blir fordøye og produkt renset i en butikk som minus 20 grader på elektroporasjonsnotater.Det anbefales å oppnå høy konsentrasjon av linearisert vektor-DNA. Del tre:Elektroporasjon av makrofag og T-cellelinjer forbereder cellekultur etterfulgt separasjon for Geritalk-celler. Optimal celletetthet var ca. 0,5 millioner celler per ML på tidspunktet for transfeksjon.Full elektroporasjon i ti makro små kjernefysiske mote tips formater forberede en 24 brønnplate som inneholder 500 mikroliter av fullstendig vekst, medium uten antibiotika i hver brønn. Forvarm platene i fuktet 37 grader, 5% dekker den innstillingen inkubator. Skru ned elektroporasjonsparametrene for elektrisk operativsystem for jetkatt eller Rosales.Forbered celle DNA-blandingsoppfølging eller operasjon samle kyllingceller. Curchin 25 kvadratcentimeter kolbeoverføringsceller i de 15 dyrene. Siden du rører, så Phillip cellene ved sentrofugation på 90 ganger G i åtte minutter ved romtemperatur, be om det, supernatanter.For vasking, Resuspend cellene med fem ML PBS, deretter spinn cellen suspensjon ved sentrifugering ved hjelp av samme tilstand som forrige trinn. Fjern DPPene. Og resuspender celleputene ved hjelp av to ML DBS.Du forblir mikro liten celle suspensjon og blande med samme volum på 0.2%Trepan Ballou å estimere celle antall last prøve i form telle spor sette Connie lysbilde i den automatiserte cellen Connor og vise bildet selv. Deretter får du et resultat av celleantallet. Beregn 2 millioner celler vil finne omdømmet til elektroporasjon per bankende eksperiment overføre antall celler til 1,5 ML.Sentrifuge to pelletsceller ved sentrifugalisering.For å spare tid kan elektroporasjonsblandingen fremstilles under sentrifugaliseringen som tilsetter 2,5 mikrogram av hver av CRISPR CAS ni vektor 2,4 mikrogram Belinda ris, snakkesalig vektor og re-suspensjon Buffalo. Vårt totale volum på 55 makroavfall i et nytt 1,5 ML sentrifugert rør forsiktig toppunkt og. Stå kort for å blande godt.La Luxor-trykkblandingen og romtemperaturen stå før bruk. Etter å ha snurret aspart, er DTB dette i hovedsak sikring i ytterligere 30 sekunder, fjern så mye supernatant som mulig re suspendere celler ved å legge til den forberedte elektroporasjonsblandingen pipette opp og ned forsiktig. Elektroporasjon ba om celleelektroporasjonsblanderen ved hjelp av 10 mikro liten kjernefysisk fraksjonsspiss var pipetter viktige.Unngå luftbobler under pi petting det vil koste elektroplettering feil. Trykk start. deretter overfører operasjonen prøven om en stund.Brønn 24, brønnplater med forvarsel bruttomediet utfører samme elektriske trykk og prosedyrer som ovenfor på de resterende fire replikerte prøvene, rocker platen forsiktig for å sikre jevn fordeling av cellene. Inkuber cellene i 37 graders inkubator i 48 til 72 timer. Før fakta, cellesortering Ved 24 timers posttransfeksjon, undersøk uttrykket for å forstyrre to for restaurantreporter ved hjelp av florescerende mikroskopi løsrevet fra representanten for oss selv indikerer at elektroporasjonen fungerer som den skal.Del 4:cellesortering for å isolere putative knock-in-celler. Før cellesortering forberedes, i 96 brønnplater med 150 mikro lite celletype spesifikt bruttomedium per brønn, bruk feil bunnmikroplass for kultur og seg selv og det flate bunnmikrostedet for alle celler overføre celler til en steril FACS for å holde røret på is og for å sette boksen i veien gjennom vinduet, koble til cellesorteringsrom når det er aktuelt settcellesortering med 85 mikrometer dyse og lav strømningshastighet for immuncellesortering for å oppnå optimal celleevaluerbarhet og overlevelse ta prøver fra gjennomgående vindustoppunkt kort, og last prøven i oppkjøpene. Champer satte opp faktaskøyting for cellesortering først definerte salgstrakter for Ford scatter og sidespredning, og definer deretter livscellene ved å få settet til å snakke røde negative celler.Deretter finner de en levende enkeltcelle ved enkeltstående gating ved hjelp av FSC H versus FSE en multi-variert blokk. Til slutt sette en port for ønsket DSRs to og B hvis Volvo positiv subpopulation, som indikerer celler vellykket co transfected med CRISPR vektor og pocketing vektor. Så 10 enkeltceller i hver brønn på 96, brønnplate supplert med førkrigstiden, det komplette vekstmediet ved hjelp av periodemodus eller enkeltcellemodus etter sortering inkuberer 96, brønnplater i cellekulturinkubatoren for celleutvidelse.Del fem:screening av forhøyelse av positive knock-in celler Etter omtrent to uker med celleutvidelse forbi overleve, vurderer cellene i 48 brønnplaten uttrykket av BFP eller strømningscytometri ved hjelp av en liten andel av spredningen selv ved hjelp av veggtypecellene som en negativ kontrollcellepopulasjon, med høyere prosentandel av BFP-positive celler beholdes for å oppfylle valideringsekstraktet det genomiske DNA fra cellene vi bør uttrykke. BFP passerer det isolerte genomiske DNA-et av PCR med primere som spenner over hver side av de homologe armene, nemlig en primær lokalisering i den genomiske sekvensen, utvendig til målvektoren. Den sett siden til å snakke med vektoren i dette eksperimentet, den spådde størrelsen på PCR-produktet forsterket med den primære er 1,2 KV. Og med F2 og R to er 1,2 KB Sanger sekvenseringsresultater. Så PCR-produkter viser sekvensene til hvert integrasjonskryss som demonstrerer riktig og bankende posisjon i Rosa 26 Lucas.Jeg sier som immuno blotting gjør det mulig for validering av riktig banking på proteinnivå del seks representative resultater. Som et eksempel, publisert i forrige studie, uttrykte vi at får 45 molekyler tack at inter med en OSD-tag, og det var en 26 locus i kassen T-celler senere USD takt. Jeg får 45 og hendelsesdirektører eller trukket ned av affinitetsrensing og et emne for massespektrometri.De proteomikk data avslørt interaksjon av T-celler. Derfor har dette produktbassenget i stor grad tilrettelagt søket etter nye interkalatorer for å belyse funksjonen til et gitt protein. Denne tekniske presentasjonen viste at ved midlertidig uttrykt økt per støpt linje RFP med snakkende vektor co-uttrykt og BFP for Rosa 26 locus.Vi genererte bankende cellelinjer med permanent genuttrykk i både T-celler og makrofager, som er vanskelige å utføre i genetiske manipulasjoner. Disse metodene og anbefalingene gjelder chris tillatt i påstander om stort DNA-segment for mekanistiske studier av immunceller, for eksempel for identifisering av protein, proteininteraksjonsstudie.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

Experimental and clinical studies often require highly purified cell populations.  FACS is a technique of choice to purify cell populations of known ...

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

Established cell lines are a critical research tool that can reduce the use of laboratory animals in research. Certain strains of genetically modified ...

Methods to Assess Beta Cell Death Mediated by Cytotoxic T Lymphocytes

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease.  During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin ...

Generation of Multivirus-specific T Cells to Prevent/treat Viral Infections after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplant

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully ...

Expanding Cytotoxic T Lymphocytes from Umbilical Cord Blood that Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr Virus, and Adenovirus

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac transposon System Endring av primære humane T celler

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Mouse NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Mus naive CD4<sup&gt; +</sup&gt; T Cell Isolasjon og<em&gt; In vitro</em&gt; Differensiering i T cell Subsets

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Analyzing the Functions of Mast Cells In Vivo Using 'Mast Cell Knock-in' Mice

Analyzing the Functions of Mast Cells In Vivo Using 'Mast Cell Knock-in' Mice

Analysere funksjonene til mastceller In Vivo ved hjelp av 'Mast Cell Knock-in' Mus

Mast cells (MCs) are hematopoietic cells which reside in various tissues, and are especially abundant at sites exposed to the external environment, such ...

An Efficient and Simple Method to Establish NK and T Cell Lines from Patients with Chronic Active Epstein-Barr Virus Infection

En effektiv og enkel metode for å etablere NK og T cellelinjer fra pasienter med kronisk aktiv Epstein - Barr virusinfeksjon

A number of methods have been described to establish NK/T cell lines from patients with lymphoma or lymphoproliferative syndrome. These methods employed ...