Name: gene knock-in by crispr/cas9 and cell sorting in macrophage and t cell lines
Uploaded: 2021-11-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Gene Knock-in by CRISPR/Cas9 and Cell Sorting in Macrophage and T Cell Lines at JoVE.com

Agradecemos a instalação do núcleo de citometria de fluxo da Universidade Médica de Xinxiang. O desenvolvimento dessa tecnologia tem sido apoiado por subvenções da NSFC 81601360 à LZ, 81471595 e 32070898 à YL. O trabalho também conta com o apoio da Fundação do Comitê Educacional henan nº 21IRTSTHN030.

1. Projeto e Construção Plasmid de sgRNAs visando Rosa26 Locus
<ol><li>Guia de design RNAs em torno do local de inserção desejado
	<ol>
<li>Certifique-se de que o local de inserção do mouse Rosa26 (doravante designado como mRosa26) esteja localizado no primeiro intron de mRosa26; este site foi utilizado em estudos anteriores28,29. Para experimentos em células humanas, certifique-se de ...

Em nossos experimentos, demonstramos como realizar a edição em células imunes desde o projeto de construção até a triagem e validação celular knock-in usando células toscos humanos e macrófagos murine RAW264.7 como exemplos. As linhas de células T e macrófagos são resistentes à transfecção36,37; no entanto, o problema da baixa eficiência da entrega do CRISPR/Cas9 pode ser superado com o auxílio de repórteres fluorescentes aliados à classifica?...

Células imunes são críticas para a defesa contra patógenos. Imunidade inata e adaptativa são necessárias para liberação de infectantes e manutenção da homeostasetecidual 1,2. Modelos de linha celular são ferramentas essenciais para a compreensão dos fundamentos moleculares do sistema imunológico dos mamíferos; são utilizados em ensaios funcionais in vitro, como aqueles modelando a ativação de células T humanas, e na determinação da função de fatores genéticos na ativação ou amortecimento das respostas imunes3,4. É importante notar que o sistema imunológico dos mamíferos é extremamente heterogêneo e, igualmente importante, um enorme número de moléculas controla a diferenciação, migração e função de uma determinada célula tipo5,6.
As ferramentas de edição de genomas curtas econsetos interespaçadas regularmente (CRISPR)/Cas9 permitem a manipulação genética de tipos de células específicas, o que facilita a anotação funcional de genes de forma precisa7,8. Vários protocolos publicados descreveram a entrega de CRISPR/Cas9 na forma de complexos de RNA de guia Cas9 conhecidos como ribonucleoproteínas (RNPs) em células HEK293, linhas celulares Jurkat, células T primárias9,10,macrófagos11,12,13, células-tronco14, e outras15,16. Nesses protocolos, a marcação genética geralmente é alcançada fundindo uma tag fluorescente às proteínas endógenas17,18. No entanto, poucas tentativas foram feitas para usar repórteres fluorescentes duplos, que são compatíveis com a classificação de células únicas, para facilitar experimentos de knock-in19,20, particularmente em células imunes.
Análises mecanicistas aprofundadas destinadas a entender as funções de um novo fator genético em células imunes geralmente requerem a exclusão específica do tipo celular de um gene, experimentos de resgate genético e ideal identificação de seus interagirores. Embora métodos de otimização da exclusão genética de genes em células imunes tenham sido publicados9,15,21, muito menos métodos foram relatados para introduzir alelos knock-in com funções versáteis para entender a resposta imune. Portanto, neste protocolo pretendemos descrever em detalhes um protocolo eficiente e altamente reprodutível para expressar uma proteína de interesse (POI) no lócus do porto seguro Rosa26 em linhas de células imunes humanas e murinas. Projetamos um sistema de repórter de duas cores para enriquecer para células transfeinadas com plasmídeos expressando CRISPR/Cas9 (DsRed2) e um modelo de DNA recombinante (EBFP2), que pode ser isolado por classificação celular. Seguindo este protocolo, obtivemos múltiplas linhas de knock-in da linha celular T humana Jurkat e macrófago murina RAW264.7 para análises funcionais de proteínas mal estudadas.
Como exemplo, mostramos neste protocolo como obter macrófagos RAW264.7 expressando compunção ace2 humano (receptor de SARS-Cov-2)22. Como as células imunes inatas estão envolvidas na patogênese do Covid-1923,24 e o ACE2 humano é considerado um receptor importante necessário para a entrada viral nas células antes da replicação, macrófagos com knock-in do ACE2 humano podem servir como uma ferramenta útil para estudos mecanicistas de multiplicação viral dentro de macrófagos. Em paralelo, também apresentamos um exemplo de knock-in de um gene no lócus ROSA26 humano para expressar a proteína RASGRP1, que foi fundida em seu amino terminus com uma afinidade Twin-Strep-tag (OST). As células T são células-alvo-chave em terapias imunológicas, e um número crescente de estudos tem se concentrado na manipulação de sua capacidade de resposta ao câncer25,26. Como rasgrp1 é conhecido por ser uma molécula-chave de sinalização a jusante do receptor de células T e seus interagirres não são bem elucidados27, o modelo de knock-in OST-RASGRP1 fornece a base para identificar interactores que regulam a resposta das células T a tumores e infecções. Juntas, essas ferramentas podem ser usadas para estudos covid-19 e a descoberta de novas moléculas interagindo com Rasgrp1.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amersham Imager 600</td>
			<td>Ge Healthcare</td>
			<td></td>
			<td>imaging of chemiluminescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin, sodium salt</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>194526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>7074</td>
			<td>at 1/5000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-RasGRP1 antibody, clone 10.1</td>
			<td>Merck</td>
			<td>MABS146</td>
			<td>1.0 &#956;g/mL of working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AscI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0558S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Actin (D6A8) Rabbit mAb</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>8457</td>
			<td>at 1/1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BamHI-HF</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3136S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BbsI-HF</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3539S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellometer Mini Automated Cell Counter</td>
			<td>Nexcelom Bioscience</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.coli DH5&#945; Competent Cells</td>
			<td>Takara</td>
			<td>9057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO (Dimethyl Sulfoxide)</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>196055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNeasy Blood &#38; Tissue Kits</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69506</td>
			<td>cell culture reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (10X), no calcium, no magnesium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14200075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) with high glucose</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30022.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRI-HF</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3101S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSAria&#8482; Fusion</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>equipped with biosafety cabinet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Canto flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 5 ml polystyrene round bottom test tube</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10099141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo version 10.7</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH (D16H11) XP&#160;Rabbit mAb</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>5174</td>
			<td>at 1/1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>31430</td>
			<td>at 1/5000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon ECL Ultra Western HRP Substrate</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>WBKLS0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon-PSQ PVDF Membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ISEQ00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jurkat</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB-152</td>
			<td>https://www.atcc.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin sulfate</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>194531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB agar powder</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>22700041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-channel Pipette (30-300 &#956;L)</td>
			<td>Eppendorf, or similar</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MPK5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System, 10 &#956;L kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MPK1096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 15 mL Conical Sterile Centrifuge Tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>339651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OneTaq&#174; Hot Start Quick-Load&#174; 2X Master Mix</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>(M0489)</td>
			<td>for high GC% template</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>26616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip 0.1-20&#181;l</td>
			<td>Eppendorf, or similar</td>
			<td>0030 075.005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip 2-200&#181;l</td>
			<td>Eppendorf, or similar</td>
			<td>0030 075.021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip 50-1000&#181;l</td>
			<td>Eppendorf, or similar</td>
			<td>0030 075.064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pX458-DsRed2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>112219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td>purify plasmid from restriction digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0494S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RAW264.7</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB-71</td>
			<td>https://www.atcc.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Anti-ACE2 antibody [EPR4435(2)]</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab108252</td>
			<td>at 1/1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30027.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strep-Tactin Sepharose beads</td>
			<td>IBA Lifesciences</td>
			<td>2-1201-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTOX&#8482; Red Dead Cell Stain, for 633 or 635 nm excitation</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S34859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Polynucleotide Kinase</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution (0.25%), with phenol red</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZOE Fluorescent Cell Imager</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microtubes, PCR-clean</td>
			<td>Eppendorf, or similar</td>
			<td>0030 125.215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Clear Flat Bottom Polystyrene TC-treated Microplates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Clear Round Bottom TC-treated Microplate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3799</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

gene knock-in by crispr/cas9 and cell sorting in macrophage and t cell lines

Estudos de genômica funcional do sistema imunológico requerem manipulações genéticas que envolvem tanto a exclusão de genes-alvo quanto a adição de elementos a proteínas de interesse. A identificação de funções genéticas em modelos de linha celular é importante para a descoberta genética e exploração de mecanismos intrínsecos. No entanto, as manipulações genéticas de células imunes, como células T e linhas de células macrófagos usando knock-in mediada por CRISPR/Cas9, são difíceis devido à baixa eficiência de transfecção dessas células, especialmente em um estado quiescente. Para modificar genes em células imunes, a seleção de resistência a drogas e vetores virais são tipicamente usados para enriquecer para células que expressam o sistema CRIPSR/Cas9, o que inevitavelmente resulta em intervenção indesejável das células. Em um estudo anterior, projetamos repórteres fluorescentes duplos acoplados ao CRISPR/Cas9 que foram transitoriamente expressos após a eletroporação. Esta solução técnica leva à rápida exclusão genética em células imunes; no entanto, o impacto genético em células imunes, como células T e macrófagos sem o uso de seleção de resistência a drogas ou vetores virais, é ainda mais desafiador. Neste artigo, mostramos que, usando a triagem celular para auxiliar a seleção de células que expressam transitoriamente as construções CRISPR/Cas9 visando o lócus Rosa26 em combinação com um plasmídeo doador, o knock-in genético pode ser alcançado tanto em células T quanto em macrófagos sem enriquecimento de resistência a drogas. Como exemplo, mostramos como expressar o ACE2 humano, um receptor de SARS-Cov-2, que é responsável pela atual pandemia Covid-19, em macrófagos RAW264.7 realizando experimentos knock-in. Tais células de impacto genéticos podem ser amplamente utilizadas para estudos mecanicistas.

Seguindo o protocolo descrito acima para realizar experimentos de knock-in no lócus mRosa26 usando macrófagos murine RAW264.7, projetamos um vetor direcionado para expressar ace2 humano, um receptor para o vírus SARS-Cov-2(Figura 2A). Usando um design semelhante, geramos células Tockat T humanas com knock-in da proteína de fusão RASGRP1 marcada pelo OST(Figura 2C). Após a transfecção de três plasmídeos, dois dos quais foram usados para expres...

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Gene Knock-in by CRISPR/Cas9 and Cell Sorting in Macrophage and T Cell Lines

Este protocolo usa repórteres fluorescentes e classificação celular para simplificar experimentos de knock-in em linhas de células macrófagos e t. Dois plasmídeos são usados para esses experimentos simplificados de knock-in, ou seja, um plasmídeo de expressão CRISPR/Cas9 e DsRed2 e um plasmídeo de recombinação homólogo que expressa EBFP2, que está permanentemente integrado no lócus Rosa26 em células imunes.

Gene Knock-in por CRISPR/Cas9 e Classificação celular em linhas de células macrófagos e t

Functional genomics studies of the immune system require genetic manipulations that involve both deletion of target genes and addition of elements to ...

O objetivo deste protocolo é simplificar o experimento de knock-in mediado do CRISPR/Cas9 em linhas de macrófago e células T, com o auxílio de repórteres fluorescentes e afetar a classificação celular. ROSA26 Locus é conhecido como um local de porto seguro genômico para inserção de transgenes. É comum expressar proteína de interesse com ou sem ataque no mundo do rato de 26 lócus, ou no tronco ortográfico humano.Parte 1:Projeto e a Construção Plasmid de sgRNAs visando Rosa26 Locus. Primeiro, projete sgRNAs do mouse Rosa26 locus, usando sequências de informática do genoma do mouse, e Ensemble Genome Browser, em seguida, baixe a sequência genômica do gene do mouse Rosa26. Vá para a ferramenta web online, CRISPOR, cole 100 pares base da sequência de entrada do Lócus Rosa26.Em seguida, selecione um genoma, por exemplo, mus musculus-mouse referência genoma 2011. Em seguida, selecione o tipo de PAM. Use o motivo 20bp NGG"PAM, reconhecido por spCas9.Clique em Enviar. Escolha guia com uma pontuação de alta especificidade, pontuação alta e menos fora dos alvos. As guias indicadas como ineficientes devem ser evitadas.Notavelmente, é preferível selecionar dois guias com sequências sobrepostas, o que pode aumentar a eficiência do knock-in conforme relatado. Para uma sequência de jantar quente, sintetize um avanço ilegal e uma reversão ilegal, que resmou fosforated e pronto para a clonagem para fatorar. Prepare a diminuição linearizada por Vactor a que poderia expressar é que eu tenho que repórter por BBS uma digestão, como obter o Neal, os legais para o vetor linearizado para gerar o construto final, que simultaneamente expressa guia RNA e o núcleo CAS nove ligados a um DSRIP dois repórter fluorescente.Parte Dois:Construção do Vetor de Alvo como Modelo de Recombinação Homologos. Para a expressão da proteína do interesse. Por exemplo, o humano durou até.Você quer sintetizar a sequência cDNA por fonte comercial e afinidade A tag OST ou outro ataque comumente usado para purificação de proteínas pode ser fundido à sequência cDNA. Lembre-se de incluir a sequência de consenso kazak antes do início do cDNA. Digerido pela enzima de restrição Asc1, e como obter o CD e a inserção na espinha dorsal.Vactor, ou seja, pKhR26-IBFP IBP cedendo o último foco de mira do recipiente, cada um, KB de cinco braços primos e três principais homólogos. O conjunto de expressões inclui um promotor de CG, o restaurante UST, se você quiser a região koonin ligada a uma Iris, se o repórter VFD e um fundo poli AC. Finalmente no horizonte visando vetor usando enzimas de cortador únicas, como EcoR1 ou BamH1, os digestos e o produto são purificados em uma loja que menos 20 graus em notas de eletroporação.Recomenda-se obter alta concentração de DNA vetorial linearizado. Parte três: Eletroporação de linhas macrófagos e t-cell preparam a cultura celular seguida de separação para células Geritalk. A densidade celular ideal foi de aproximadamente 0,5 milhões de células por ML no momento da transfecção.Eletroporação completa em dez formatos de ponta de moda nuclear macro prepara uma placa de 24 poços contendo 500 microliteres de crescimento completo, médio sem antibióticos em cada poço. Pré-aquecimento das placas em 37 graus umidificados, 5% cobrindo essa incubadora de ajuste. Abaixe os parâmetros de eletroporação de entrada do sistema de operação elétrica para jet cat ou Rosales.Prepare os acompanhamentos da mistura de DNA celular ou a operação de coleta de células de frango. Curchin 25 centímetros quadrados de células de transferência de frasco nos 15 animais. Desde o tubo do you, então Phillip as células por centrofugação a 90 vezes G por oito minutos em temperatura ambiente, peça por ele, os supernantes.Para lavar, resuspenco as células com o PBS de cinco ML e gire a suspensão celular por centrifugação usando a mesma condição da etapa anterior. Remova os DPPs. E resuspense os travesseiros de célula usando dois ML de DBS.Você permanece micro pequena suspensão celular e mistura com o volume igual de 0,2% Trepan Ballou para estimar a amostra de carga de contagem de células em termos de contagem de slot inserir connie slide na célula automatizada Connor e ver a imagem em si. Então obtenha um resultado de contagem de células. Calcule 2 milhões de células encontrarão reputações de eletroporação por experimento de batida transferir o número de células para 1,5 ML.Centrifuge duas células de pelotização por centrifugação.Para economizar tempo, a mistura de eletroporação pode ser preparada durante a centrifugação que adiciona 2,5 microgramas de cada um dos nove vetores CRISPR CAS 2.4 de arroz Belinda, vetor falante e re suspensão buffalo. Nosso volume total de 55 macro lixo em um novo tubo centrifusado de 1,5 ML suavemente vértice e. Por pouco tempo, pode misturar bem.Deixe a mistura de pressão Luxor e temperatura ambiente antes de usar. Depois de girar aspart, o DTB é este essencialmente fusível por mais 30 segundos, remover o máximo de supernasce possível re suspendir células adicionando a mistura de eletroporação preparada pipeta para cima e para baixo suavemente. A eletroporação pedida para o misturador de eletroporação celular usando 10 micro pequenas pontas de facção nuclear foi importante.Evite bolhas de ar durante o acariciamento pi, custará falha de eletroplacar. Comece a pressionar. após a qual a operação transfira a amostra em um tempo.Bem, de 24, placas de poço com pré-aviso o meio bruto realizam a mesma pressão elétrica e procedimentos acima nas quatro amostras replicadas restantes, balançam suavemente a placa para garantir a distribuição uniforme das células. Incubar as células na incubadora de 37 graus por 48 a 72 horas. Antes da ocorrência, a triagem celular Às 24 horas após a transfecção, examine a expressão de disruptão dois para repórter de restaurante usando microscopia florescente separada do próprio representante para nós mesmos indica que a eletroporação está funcionando corretamente.Parte 4:classificação celular para isolar células putativas. Antes de preparar a triagem celular, em 96 placas de poço com 150 micro pequenos do tipo celular médio bruto específico por bem use micro lugar inferior errado para cultura e si mesmo e o micro lugar fundo plano para todas as células transferir células em um FACS estéril para manter o tubo no gelo e colocar a caixa no caminho através da janela, conexão com a sala de triagem celular quando aplicável definir o classificador celular com 85 micrometros de bocal e baixa taxa de fluxo para classificação de células imunes para alcançar a melhor evalubilidade celular e sobrevivência colher amostras do vértice da janela de passagem brevemente, e carregar a amostra nas aquisições. Champer criou a patinação de fatos para a classificação celular primeiro funis de vendas definidos para a dispersão ford e dispersão lateral, em seguida, definir as células de vida, ganhando o conjunto fala células vermelhas negativas.Em seguida, eles encontram uma célula única ao vivo por um único singlet gating usando o FSC H versus FSE um bloco multivariou. Finalmente defina um portão para os DSRs desejados dois e B se a subpopulação positiva do Volvo, que indica células co transinfetadas com sucesso com vetor CRISPR e vetor de bolso. Assim, 10 células únicas em cada poço do 96, placa bem suplementada com o pré-aquecimento, o meio de crescimento completo usando modo de período ou modo de célula única após a triagem incubar as placas de 96, poços na incubadora de cultura celular para expansão celular.Parte cinco: triagem da elevação de células positivas após aproximadamente duas semanas de expansão celular após a sobrevivência, as células da placa de 48 poços avaliam a expressão de BFP ou citometria de fluxo usando uma pequena proporção de proliferação usando as células do tipo parede como uma célula de controle negativo populações, possuindo maior porcentagem de células positivas de BFP são mantidas para cumprir o extrato de validação do DNA genômico das células que devemos expressar BFP passar o DNA genômico isolado por PCR com primers abrangendo cada lado dos braços homólogos, ou seja, um local primário na sequência genômica, exterior ao vetor de alvo. O lado visto para falar com o vetor neste experimento, o tamanho previsto do produto PCR amplificado com o principal é de 1,2 KV. E com F 2 e R dois é 1.2 KB Sanger resultados de sequenciamento. Assim, os produtos PCR mostram as sequências de cada junção de integração demonstrando a posição correta e batendo no Rosa 26 Lucas.Eu digo que a mancha imuno permite a validação da batida correta no nível de proteína parte seis resultados representativos. Como exemplo, publicado em estudo anterior, expressamos que obter 45 moléculas tack que o inter com uma tag OSD, e havia um 26 locus em checkout T-cells subsequentemente USD tato. Eu recebo 45 diretores de incidentes ou puxado para baixo por purificação de afinidade e um sujeito à espectrometria de massa.Os dados de proteômica revelaram interação das células T. Portanto, esta piscina de produtos facilitou muito a busca de novos intercaladores para elucidar a função de uma determinada proteína. Esta apresentação técnica mostrou que por transitos expressas aumento por linha de elenco RFP com o vetor falante co-expresso e BFP para lócus Rosa 26.Geramos linhas celulares batendo com expressão genética permanente em células T e macrófagos, que são difíceis de executar em manipulações genéticas. Esses métodos e recomendações são aplicáveis a Chris permitidos em afirmações de grande segmento de DNA para estudos mecanicistas de células imunes, como para identificação de proteínas, estudo de interação proteica.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

Purificação da população de células específicas de separação de células de fluorescência Ativado (FACS)

Experimental and clinical studies often require highly purified cell populations.  FACS is a technique of choice to purify cell populations of known ...

Imunologia e Infecção

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

Transdução retroviral de receptor de células T no rato células T

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

Derivação de Tímico linfoma de células T Linhas de Atm - / -</sup E<emP53> - / -</sup Ratos

Established cell lines are a critical research tool that can reduce the use of laboratory animals in research. Certain strains of genetically modified ...

Methods to Assess Beta Cell Death Mediated by Cytotoxic T Lymphocytes

Métodos para avaliar Mediated Beta Morte celular por linfócitos T citotóxicos

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease.  During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin ...

Generation of Multivirus-specific T Cells to Prevent/treat Viral Infections after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplant

Geração de células T específicas Multivirus para Prevenir / tratar infecções virais após transplante de células-tronco hematopoéticas alogênico

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully ...

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Expandindo linfócitos T citotóxicos do sangue do cordão umbilical que citomegalovírus Target, vírus de Epstein-Barr, e Adenovirus

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where ...

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piggyBac modificação do sistema Transposon de células T primárias Humanos

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