Name: gene knock-in by crispr/cas9 and cell sorting in macrophage and t cell lines
Uploaded: 2021-11-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Gene Knock-in by CRISPR/Cas9 and Cell Sorting in Macrophage and T Cell Lines at JoVE.com

Мы благодарим центр проточной цитометрии Медицинского университета Синьсян. Развитие такой технологии поддерживается грантами NSFC, 81601360 LZ, 81471595 и 32070898 YL. Работа также поддерживается Фондом Образовательного комитета Хэнань No 21IRTSTHN030.

1. Проектирование и плазмидная конструкция sgRNAs, нацеленных на Локус Rosa26
<ol><li>Руководство по проектированию РНК вокруг желаемого места вставки
	<ol>
<li>Убедитесь, что место вставки для мыши Rosa26 (далее обозначается как mRosa26)для экспериментов с выбиванием рас...

В наших экспериментах мы продемонстрировали, как выполнять редактирование в иммунных клетках от конструкции до скрининга и валидации клеток с использованием человеческих Т-клеток Jurkat и мышиных макрофагов RAW264.7 в качестве примеров. Как Т-клеточные, так и макрофаговы клеточные линии уст...

Иммунные клетки имеют решающее значение для защиты от патогенов. Как врожденный, так и адаптивный иммунитет необходимы для клиренса инфекционных веществ и поддержания тканевого гомеостаза1,2. Модели клеточных линий являются важными инструментами для понимания молекулярных основ иммунной системы млекопитающих; они используются в функциональных анализах in vitro, таких как те, которые моделируют активацию Т-клеток человека, и в определении функции генетических факторов в активации или ослаблении иммунных реакций3,4. Важно отметить, что иммунная система млекопитающих чрезвычайно неоднородна и, что не менее важно, огромное количество молекул контролирует дифференцировку, миграцию и функцию данной клетки типа5,6.
Кластеризованные регулярно интерширидные короткие палиндромные повторы (CRISPR) / Cas9 инструменты редактирования генома позволяют проводить генетические манипуляции с конкретными типами клеток, что облегчает функциональную аннотацию генов точным образом7,8. Несколько опубликованных протоколов описали доставку CRISPR/Cas9 в виде Cas9-направляющих комплексов РНК, известных как рибонуклеопротеины (РНК) в клетках HEK293, клеточных линиях Юрката, первичных Т-клетках9,10,макрофагах11,12,13,стволовых клетках14и других15,16. В этих протоколах маркировка генов обычно достигается путем слияния флуоресцентной метки с эндогенными белками17,18. Однако было предпринято несколько попыток использовать двойные флуоресцентные репортеры, которые совместимы с сортировкой одиночных клеток, для облегчения экспериментов19,20,особенно в иммунных клетках.
Углубленный механистический анализ, направленный на понимание функций нового генетического фактора в иммунных клетках, обычно требует специфической делеции гена клеточного типа, генетических спасательных экспериментов и, в идеале, идентификации его интеракторов. Несмотря нато,что методы оптимизации генетической делеции генов в иммунных клетках были опубликованы9,15,21,было зарегистрировано гораздо меньше методов введения аллелей с универсальными функциями для понимания иммунного ответа. Поэтому в этом протоколе мы стремимся подробно описать эффективный и высоко воспроизводимый протокол для экспрессии интересующего белка (POI) в локусе безопасной гавани Rosa26 как в человеческих, так и в мышиных иммунных клеточных линиях. Мы разработали двухцветную репортерную систему для обогащения клеток, трансфектерированных плазмидами, экспрессирующими CRISPR/Cas9 (DsRed2) и рекомбинантным шаблоном ДНК (EBFP2), который может быть выделен путем сортировки клеток. Следуя этому протоколу, мы получили несколько линий Т-клеточной линии человека Jurkat и мышиного макрофага RAW264.7 для функционального анализа плохо изученных белков.
В качестве примера мы покажем в этом протоколе, как получить детонирующие макрофаги RAW264.7, стабильно экспрессирующие ACE2 человека (рецептор SARS-Cov-2)22. Поскольку врожденные иммунные клетки участвуют в патогенезе Covid-1923,24 и ace2 человека рассматривается как основной рецептор, необходимый для проникновения вируса в клетки перед репликацией, макрофаги с подделкой ACE2 человека могут служить полезным инструментом для механистических исследований размножения вируса внутри макрофагов. Параллельно мы также представляем пример выбивания гена в локусе ROSA26 человека для экспрессии белка RASGRP1, который был слит на его аминоце с аффинным Twin-Strep-tag (OST). Т-клетки являются ключевыми клетками-мишенями в иммунной терапии, и все большее число исследований сосредоточено на манипулировании их реакцией на рак25,26. Поскольку Rasgrp1, как известно, является ключевой сигнальной молекулой после рецептора Т-клеток, а его интеракторы недостаточно хорошо выяснены27,модель ОСТ-RASGRP1 обеспечивает основу для идентификации интеракторов, регулирующих реакцию Т-клеток на опухоли и инфекцию. Взятые вместе, эти инструменты могут быть использованы для исследований Covid-19 и открытия новых молекул, взаимодействующих с Rasgrp1.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amersham Imager 600</td>
			<td>Ge Healthcare</td>
			<td></td>
			<td>imaging of chemiluminescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin, sodium salt</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>194526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>7074</td>
			<td>at 1/5000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-RasGRP1 antibody, clone 10.1</td>
			<td>Merck</td>
			<td>MABS146</td>
			<td>1.0 &#956;g/mL of working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AscI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0558S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Actin (D6A8) Rabbit mAb</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>8457</td>
			<td>at 1/1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BamHI-HF</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3136S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BbsI-HF</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3539S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellometer Mini Automated Cell Counter</td>
			<td>Nexcelom Bioscience</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.coli DH5&#945; Competent Cells</td>
			<td>Takara</td>
			<td>9057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO (Dimethyl Sulfoxide)</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>196055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNeasy Blood &#38; Tissue Kits</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69506</td>
			<td>cell culture reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (10X), no calcium, no magnesium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14200075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) with high glucose</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30022.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRI-HF</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3101S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSAria&#8482; Fusion</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>equipped with biosafety cabinet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Canto flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 5 ml polystyrene round bottom test tube</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10099141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo version 10.7</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH (D16H11) XP&#160;Rabbit mAb</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>5174</td>
			<td>at 1/1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>31430</td>
			<td>at 1/5000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon ECL Ultra Western HRP Substrate</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>WBKLS0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon-PSQ PVDF Membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ISEQ00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jurkat</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB-152</td>
			<td>https://www.atcc.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin sulfate</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>194531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB agar powder</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>22700041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-channel Pipette (30-300 &#956;L)</td>
			<td>Eppendorf, or similar</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MPK5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System, 10 &#956;L kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MPK1096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 15 mL Conical Sterile Centrifuge Tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>339651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OneTaq&#174; Hot Start Quick-Load&#174; 2X Master Mix</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>(M0489)</td>
			<td>for high GC% template</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>26616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip 0.1-20&#181;l</td>
			<td>Eppendorf, or similar</td>
			<td>0030 075.005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip 2-200&#181;l</td>
			<td>Eppendorf, or similar</td>
			<td>0030 075.021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip 50-1000&#181;l</td>
			<td>Eppendorf, or similar</td>
			<td>0030 075.064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pX458-DsRed2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>112219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td>purify plasmid from restriction digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0494S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RAW264.7</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB-71</td>
			<td>https://www.atcc.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Anti-ACE2 antibody [EPR4435(2)]</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab108252</td>
			<td>at 1/1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30027.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strep-Tactin Sepharose beads</td>
			<td>IBA Lifesciences</td>
			<td>2-1201-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTOX&#8482; Red Dead Cell Stain, for 633 or 635 nm excitation</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S34859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Polynucleotide Kinase</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution (0.25%), with phenol red</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZOE Fluorescent Cell Imager</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microtubes, PCR-clean</td>
			<td>Eppendorf, or similar</td>
			<td>0030 125.215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Clear Flat Bottom Polystyrene TC-treated Microplates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Clear Round Bottom TC-treated Microplate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3799</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

gene knock-in by crispr/cas9 and cell sorting in macrophage and t cell lines

Исследования функциональной геномики иммунной системы требуют генетических манипуляций, которые включают как делецию генов-мишеней, так и добавление элементов к белкам, представляющим интерес. Идентификация функций генов в моделях клеточных линий важна для открытия генов и исследования клеточных механизмов. Тем не менее, генетические манипуляции с иммунными клетками, такими как Т-клетки и клеточные линии макрофагов, с использованием CRISPR / Cas9-опосредованного knock-in, затруднены из-за низкой эффективности трансфекции этих клеток, особенно в состоянии покоя. Для модификации генов в иммунных клетках отбор лекарственной устойчивости и вирусные векторы обычно используются для обогащения клеток, экспрессирующих систему CRIPSR / Cas9, что неизбежно приводит к нежелательному вмешательству клеток. В предыдущем исследовании мы разработали двойные флуоресцентные репортеры, соединенные с CRISPR / Cas9, которые были временно выражены после электропорации. Это техническое решение приводит к быстрой делеции генов в иммунных клетках; однако выбивание генов в иммунных клетках, таких как Т-клетки и макрофаги, без использования селекции лекарственной устойчивости или вирусных векторов является еще более сложной задачей. В этой статье мы показываем, что, используя сортировку клеток для облегчения отбора клеток, временно экспрессирующих конструкции CRISPR / Cas9, нацеленные на локус Rosa26 в сочетании с донорской плазмидой, выбивание гена может быть достигнуто как в Т-клетках, так и в макрофагах без обогащения лекарственной устойчивостью. В качестве примера мы показываем, как экспрессировать человеческий ACE2, рецептор SARS-Cov-2, который отвечает за текущую пандемию Covid-19, в макрофагах RAW264.7, проводя эксперименты. Такие генные клетки могут быть широко использованы для механистических исследований.

Следуя описанному выше протоколу для проведения экспериментов в локусе mRosa26 с использованием мышиных макрофагов RAW264.7, мы разработали вектор нацеливания для экспрессии человеческого ACE2, рецептора для вируса SARS-Cov-2(рисунок 2A). Используя аналогичную конструкцию, мы с...

Watch this Scientific Journal Video about Gene Knock-in by CRISPR/Cas9 and Cell Sorting in Macrophage and T Cell Lines at JoVE.com

Gene Knock-in by CRISPR/Cas9 and Cell Sorting in Macrophage and T Cell Lines

Этот протокол использует флуоресцентные репортеры и сортировку клеток для упрощения экспериментов с подделкой в макрофагах и Т-клеточных линиях. Для этих упрощенных экспериментов используются две плазмиды, а именно CRISPR/Cas9- и DsRed2-экспрессивная плазмида и гомологичная рекомбинационная донорская плазмида, экспрессирующая EBFP2, которая постоянно интегрируется в локус Rosa26 в иммунных клетках.

Подделка генов с помощью CRISPR/Cas9 и сортировка клеток в макрофагах и Т-клеточных линиях

Functional genomics studies of the immune system require genetic manipulations that involve both deletion of target genes and addition of elements to ...

Целью этого протокола является упрощение эксперимента с опосредованным CRISPR/Cas9 в макрофагах и Т-клеточных линиях с помощью флуоресцентных репортеров и влиять на сортировку клеток. ROSA26 Locus известен как геномная безопасная гавань для вставки трансгенов. Обычно экспрессируется интересующих белок с атакой или без нее в мышином мире 26 локусов или в ортологе человека.Часть 1: Проектирование и плазмидная конструкция sgRNAs, нацеленных на Локус Rosa26. Сначала разработайте sgRNAs из локуса Rosa26 мыши, используя последовательности из информатики генома мыши, и Ensemble Genome Browser, а затем загрузите геномную последовательность гена Rosa26 мыши. Перейдите к онлайн-инструменту CRISPOR, вставьте 100 пар оснований входной последовательности из Rosa26 Locus.Затем выберите геном, например, Mus musculus-mouse reference genome 2011. Затем выберите тип PAM. Используйте мотив 20bp NGG"PAM, распознаваемый spCas9.Нажмите кнопку Отправить. Выберите руководство с высоким показателем специфичности, высоким баллом выполнения и меньшим количеством не-мишеней. Следует избегать руководств, указанных как неэффективные.Примечательно, что предпочтительно выбирать два направляющих с перекрывающимися последовательностями, что может увеличить эффективность выбивания, как сообщается. Для теплой последовательности обеда синтезируют форвардный нелегал и обратный нелегал, который отжигается фосфорированным и готовым к клонированию на фактор. Подготовьте линеаризированное снижение по Vactor, к которому я мог бы выразить то, что я должен репортерировать BBS одно пищеварение, как получить Нила, легальные к линеарализованному вектору для генерации окончательной конструкции, которая одновременно экспрессирует направляющую РНК и девять ядер CAS, связанных с DSRIP двумя флуоресцентными репортерами.Часть вторая:Построение вектора таргетинга как гомологичного шаблона рекомбинации. Для экспрессии интересуемого белка. Например, человек продержался.Вы хотите синтезировать последовательность кДНК коммерческим источником, и аффинная метка OST или другая широко используемая атака для очистки белка может быть слита с последовательностью кДНК. Не забудьте включить последовательность консенсуса Казака перед инициацией кДНК. Переваривается ферментом рестрикции Asc1, и как бы получает CD и вставку в позвоночник.Вактор, а именно пХР26-ИБФП ИБП, дающий конечный таргетный концентрат контейнера, каждый из которых, КБ из пяти простых и трех простых гомологичных ветвей. Набор выражений включает в себя промоутера CG, ресторан UST, если вы хотите, чтобы регион Кунин был связан с Iris, если репортер VFD и поли AC финансирует. Наконец, на горизонте нацеливая вектор с использованием уникальных ферментов реза, таких как EcoR1 или BamH1, дигесты и продукт очищаются в хранилище, которое минус 20 градусов на электропорационные ноты.Рекомендуется получать высокую концентрацию линеаризированной векторной ДНК. Часть третья: Электропорация линий макрофагов и Т-клеток готовит клеточную культуру с последующим разделением для клеток Geritalk. Оптимальная плотность клеток составляла примерно 0,5 млн клеток на МЛ на момент трансфекции.Полная электропорация в десяти макро-маленьких ядерных форматах наконечника готовит 24-луночную пластину, содержащую 500 микролитров полного роста, среду без антибиотиков в каждой лунке. Предварительно прогреть пластины в увлажненном 37 градусе, на 5% покрывая эту установку инкубатора. Отключите входные параметры электропорации системы электропорации для струйной кошки или Rosales.Подготовьте последующую смесь клеточной ДНК или пройдите операцию по сбору куриных клеток. Курчин 25 квадратных сантиметров колбы передают клетки у 15 животных. Так как вы трубку, то Филлип клеток путем центрофугирования в 90 раз G в течение восьми минут при комнатной температуре, попросите его, супернатанты.Для промывки повторно суспендирует клетки с пятью ML PBS, затем вращайте клеточную суспензию центрифугированием, используя то же условие, что и на предыдущем этапе. Удалите DSP. И повторно суспендировали клеточные подушки, используя два ML DBS.Вы остаетесь микро маленькой суспензией ячейки и смешиваете с равным объемом 0,2% Трепан Баллу, чтобы оценить количество ячеек нагрузки образца в терминах подсчета слота вставки Конни слайд в автоматизированной ячейке Коннора и просмотра самого изображения. Затем получите результат подсчета ячеек. Расчет 2 млн ячеек позволит найти репутацию электропорации за эксперимент по выбиванию, перевести количество ячеек в 1,5 мл.Центрифугировать две пеллетные ячейки методом центробежной центробежной.Для экономии времени во время центробежизации можно приготовить электропорационную смесь, которая добавит по 2,5 мкг к каждому из CRISPR CAS девяти векторных 2,4 мкг риса Белинда, разговорчивого вектора и ре суспензии Буффало. Наш общий объем 55 макропометов в новой центрифугированной трубке объемом 1,5 мл мягко вершина и. Ненадолго встаньте, чтобы хорошо перемешать.Перед использованием оставьте луксорную смесь давления и комнатной температуры. После вращения аспарта, DTB это по существу предохранитель в течение дополнительных 30 секунд, удаляет как можно больше супернатанта повторно подвешивающих ячеек, добавляя приготовленную электропорационную смесь пипетки вверх и вниз осторожно. Электропорация попросила ячейку электропорационного смесителя с использованием 10 микро маленьких ядерных фракций наконечника, была важна пипетки.Избегайте пузырьков воздуха во время питтинга, это будет стоить отказа гальвана. Нажмите кнопку Пуск. после чего операция переносит образец через некоторое время.Колодец из 24, пластины скважины с предварительным предупреждением о грубой среде выполняют то же электрическое давление и процедуры, что и выше на оставшихся четырех реплицированных образцах, осторожно раскачивая пластину, чтобы обеспечить равномерное распределение ячеек. Инкубируют клетки в инкубаторе 37 градусов в течение 48-72 часов. До того, как сортировка клеток Через 24 часа после трансфекции, исследуйте экспрессию нарушения двух для ресторанного репортера с помощью флуоресцентной микроскопии, отделенной от представителя для нас самих, показывает, что электропорация работает должным образом.Часть 4: сортировка клеток для изоляции мнимых выбивающихся клеток. Перед приготовлением клеточной сортировки в 96 пластинах скважины со 150 мкм специфической грубой среды клеточного типа на скважину используют неправильное нижнее микро место для культуры и себя и плоское нижнее микро место для всех клеток переносят ячейки в стерильный FACS, чтобы держать трубку на льду и поместить коробку в путь через окно, подключение к камере сортировки ячеек, когда применимо установить сортировщик клеток с соплом 85 микрометров и низкой скоростью потока для сортировки иммунных клеток для достижения оптимальной оценки и выживаемости клеток, взять образцы из вершины сквозного окна ненадолго и загрузить образец в приобретения. Чампер настроил катание фактов для сортировки клеток, сначала определил воронки продаж для рассеяния Форда и бокового рассеяния, а затем определил жизненные ячейки, получив набор разговоров красных отрицательных клеток.Затем они находят живые одиночные клетки с помощью одиночного синглетного гаширования с использованием FSC H против FSE многомиллионного блока. Наконец, установите ворота для желаемых DSR два и B, если Volvo положительная субпопуляция, которая указывает на то, что клетки успешно ко трансфекционированы вектором CRISPR и вектором карманирования. Таким образом, 10 одиночных клеток в каждой скважине из 96, хорошо заполненной пластиной, дополненной дожимом, полной средой роста с использованием режима периода или режима одной клетки после сортировки инкубируют 96, колодезные пластины в инкубаторе клеточной культуры для расширения клеток.Часть пятая: скрининг повышения положительных клеток после примерно двух недель клеточного расширения после выживания клетки в 48-хорошей пластине оценивают экспрессию BFP или проточной цитометрии, используя небольшую долю пролиферата, используя клетки типа стенки в качестве отрицательных популяций контрольных клеток, обладающих более высоким процентом положительных клеток BFP, сохраняются для выполнения валидации экстракта геномной ДНК из клеток, которые мы должны экспрессировать BFP пропускают изолированную геномную ДНК с помощью ПЦР с праймерами, охватывающими каждую сторону гомологичных рукавов, а именно один первичный находится в геномной последовательности, внешне к вектору нацеливания. Видимая сторона разговора с вектором в этом эксперименте, предсказанный размер продукта ПЦР, амплифицированного с первичным, составляет 1,2 кВ. А с F два и R два — 1,2 КБ результатов секвенирования Сэнгера. Таким образом, продукты ПЦР показывают последовательности каждого интеграционного перехода, демонстрируя правильное и стучающее положение в Rosa 26 Lucas.Я говорю, что иммуноблоттинг позволяет проверить правильное стук на уровне белка часть шести репрезентативных результатов. В качестве примера, опубликованного в предыдущем исследовании, мы выразили, что получают 45 молекул, которые прилипают к интеру с osd-меткой, и было 26 локусов в проверке Т-клеток впоследствии USD такта. Я получаю 45 и падающие директора или стянутые вниз аффинной очисткой и предмет масс-спектрометрии.В их протеомических данных выявлено взаимодействие Т-клеток. Поэтому этот пул продуктов значительно облегчил поиск новых интеркаляторов для выяснения функции данного белка. Эта техническая презентация показала, что путем переходно выраженного увеличения на линию литья RFP с говорящим вектором ко-экспрессированного и BFP для локуса Rosa 26.Мы создали выбивающие клеточные линии с постоянной экспрессией генов как в Т-клетках, так и в макрофагах, которые трудно выполнять при генетических манипуляциях. Эти методы и рекомендации применимы к Крису, разрешенные в утверждениях о большом сегменте ДНК для механистических исследований иммунных клеток, таких как для идентификации белка, исследования белкового взаимодействия.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

Очистка Конкретные популяции клеток путем флуоресцентной Активированный Сортировка Cell (FACS)

Experimental and clinical studies often require highly purified cell populations.  FACS is a technique of choice to purify cell populations of known ...

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

Ретровирусные трансдукция Т-клеточных рецепторов в мышь Т-клеток

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

Вывод тимуса лимфомы Т-клеточных линий из Atm - / -</sup И Р53 - / -</sup Мыши

Established cell lines are a critical research tool that can reduce the use of laboratory animals in research. Certain strains of genetically modified ...

Methods to Assess Beta Cell Death Mediated by Cytotoxic T Lymphocytes

Методы оценки бета опосредованная гибель клеток от цитотоксических Т-лимфоцитов

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease.  During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin ...

Generation of Multivirus-specific T Cells to Prevent/treat Viral Infections after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplant

Генерация Multivirus конкретным Т-клеток по предотвращению / лечения вирусных инфекций после аллогенной трансплантации стволовых клеток

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully ...

Expanding Cytotoxic T Lymphocytes from Umbilical Cord Blood that Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr Virus, and Adenovirus

Расширение цитотоксических Т-лимфоцитов из пуповинной крови, что целевая цитомегаловирус, вирус Эпштейна-Барр Вирус, и аденовирус

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

PiggyBac транспозонов модификации системы первичной Т-клетках человека

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Cell-based Flow Cytometry Assay to Measure Cytotoxic Activity

Клеточная проточной цитометрии измерить цитотоксическую активность

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Mouse NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Мышь наивного CD4<sup&gt; +</sup&gt; Т-клеток Выделение и<em&gt; В пробирке</em&gt; Дифференциация в Т-клеточных подмножеств

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Analyzing the Functions of Mast Cells In Vivo Using 'Mast Cell Knock-in' Mice

Analyzing the Functions of Mast Cells In Vivo Using 'Mast Cell Knock-in' Mice

Анализ функций тучных клеток In Vivo с использованием 'Mast Cell Knock-in'Mice

Mast cells (MCs) are hematopoietic cells which reside in various tissues, and are especially abundant at sites exposed to the external environment, such ...