Name: gene knock-in by crispr/cas9 and cell sorting in macrophage and t cell lines
Uploaded: 2021-11-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Gene Knock-in by CRISPR/Cas9 and Cell Sorting in Macrophage and T Cell Lines at JoVE.com

Agradecemos a la instalación central de citometría de flujo de la Universidad Médica de Xinxiang. El desarrollo de dicha tecnología ha sido apoyado por las subvenciones de NSFC 81601360 a LZ, 81471595 y 32070898 a YL. El trabajo también cuenta con el apoyo del Comité Educativo de la Fundación de Henan No. 21IRTSTHN030.

1. Diseño y construcción de plásmidos de sgRNAs dirigidos al locus Rosa26
<ol><li>Guía de diseño de ARN alrededor del sitio de inserción deseado
	<ol>
<li>Asegúrese de que el sitio de inserción para los experimentos de knock-in del ratón Rosa26 (en adelante designado como mRosa26)se encuentra en el primer intrón de mRosa26; este sitio ha sido utilizado en estudios previos28,29. Para...

En nuestros experimentos, demostramos cómo realizar la edición en cadena en células inmunes desde el diseño de la construcción hasta la detección y validación de células en cadena utilizando células T Jurkat humanas y macrófagos murinos RAW264.7 como ejemplos. Tanto las líneas celulares de células T como las de macrófagos son resistentes a la transfección36,37; sin embargo, el problema de la baja eficiencia de la entrega de CRISPR / Cas9 se puede su...

Las células inmunes son críticas para la defensa contra los patógenos. Tanto la inmunidad innata como la adaptativa son necesarias para el aclaramiento de los infecciosos y el mantenimiento de la homeostasis tisular1,2. Los modelos de líneas celulares son herramientas esenciales para comprender los fundamentos moleculares del sistema inmune de los mamíferos; se utilizan en ensayos funcionales in vitro, como los que modelan la activación de células T humanas, y en la determinación de la función de los factores genéticos en la activación o amortiguación de las respuestas inmunes3,4. Es importante tener en cuenta que el sistema inmune de los mamíferos es enormemente heterogéneo y, lo que es igualmente importante, un gran número de moléculas controlan la diferenciación, la migración y la función de una célula determinada de tipo5,6.
Las herramientas de edición del genoma Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/Cas9 permiten la manipulación genética de tipos celulares específicos, lo que facilita la anotación funcional de genes de manera precisa7,8. Varios protocolos publicados han descrito la entrega de CRISPR/Cas9 en forma de complejos de ARN guía Cas9 conocidos como ribonucleoproteínas (RNPs) en células HEK293, líneas celulares Jurkat, células T primarias9,10,macrófagos11,12,13,células madre14,y otras15,16. En estos protocolos, el etiquetado genético se suele conseguir fusionando una etiqueta fluorescente con proteínas endógenas17,18. Sin embargo, se han hecho pocos intentos de utilizar reporteros fluorescentes duales, que son compatibles con la clasificación de una sola célula, para facilitar los experimentos de knock-in19,20, particularmente en células inmunes.
Los análisis mecanicistas en profundidad destinados a comprender las funciones de un nuevo factor genético en las células inmunes generalmente requieren la eliminación específica del tipo celular de un gen, experimentos de rescate genético e idealmente la identificación de sus interactores. A pesar de que se han publicado métodos para la optimización de la deleción genética de genes en células inmunes9,15,21,se han reportado muchos menos métodos para introducir alelos en cadena con funciones versátiles para comprender la respuesta inmune. Por lo tanto, en este protocolo pretendemos describir en detalle un protocolo eficiente y altamente reproducible para expresar una proteína de interés (POI) en el locus de puerto seguro Rosa26 en líneas celulares inmunes humanas y murinas. Diseñamos un sistema reportero de dos colores para enriquecer las células transfectadas con plásmidos que expresan CRISPR/Cas9 (DsRed2) y una plantilla de ADN recombinante (EBFP2), que se puede aislar mediante clasificación celular. Siguiendo este protocolo, obtuvimos múltiples líneas knock-in de la línea de células T humanas Jurkat y el macrófago murino RAW264.7 para análisis funcionales de proteínas poco estudiadas.
A modo de ejemplo, mostramos en este protocolo cómo obtener macrófagos RAW264.7 que expresan de forma estable ace2 humana (un receptor del SARS-Cov-2)22. Debido a que las células inmunes innatas están involucradas en la patogénesis deCovid-19 23,24 y la ACE2 humana se considera un receptor importante requerido para la entrada viral en las células antes de la replicación, los macrófagos con knock-in de ACE2 humano pueden servir como una herramienta útil para estudios mecanicistas de multiplicación viral dentro de los macrófagos. Paralelamente, también presentamos un ejemplo de knock-in de un gen en el locus humano ROSA26 para expresar la proteína RASGRP1, que se fusionó en su extremo amino con una afinidad Twin-Strep-tag (OST). Las células T son células diana clave en las terapias inmunitarias, y un número creciente de estudios se han centrado en la manipulación de su capacidad de respuesta al cáncer25,26. Como se sabe que Rasgrp1 es una molécula de señalización clave aguas abajo del receptor de células T y sus interactores no están bien dilucidados27, el modelo de knock-in OST-RASGRP1 proporciona la base para identificar interactores que regulan la respuesta de las células T a los tumores y la infección. En conjunto, estas herramientas se pueden utilizar para estudios de Covid-19 y el descubrimiento de nuevas moléculas que interactúan con Rasgrp1.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amersham Imager 600</td>
			<td>Ge Healthcare</td>
			<td></td>
			<td>imaging of chemiluminescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin, sodium salt</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>194526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>7074</td>
			<td>at 1/5000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-RasGRP1 antibody, clone 10.1</td>
			<td>Merck</td>
			<td>MABS146</td>
			<td>1.0 &#956;g/mL of working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AscI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0558S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Actin (D6A8) Rabbit mAb</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>8457</td>
			<td>at 1/1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BamHI-HF</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3136S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BbsI-HF</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3539S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellometer Mini Automated Cell Counter</td>
			<td>Nexcelom Bioscience</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.coli DH5&#945; Competent Cells</td>
			<td>Takara</td>
			<td>9057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO (Dimethyl Sulfoxide)</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>196055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNeasy Blood &#38; Tissue Kits</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69506</td>
			<td>cell culture reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (10X), no calcium, no magnesium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14200075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) with high glucose</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30022.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRI-HF</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3101S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSAria&#8482; Fusion</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>equipped with biosafety cabinet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Canto flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 5 ml polystyrene round bottom test tube</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10099141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo version 10.7</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH (D16H11) XP&#160;Rabbit mAb</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>5174</td>
			<td>at 1/1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>31430</td>
			<td>at 1/5000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon ECL Ultra Western HRP Substrate</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>WBKLS0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon-PSQ PVDF Membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ISEQ00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jurkat</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB-152</td>
			<td>https://www.atcc.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin sulfate</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>194531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB agar powder</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>22700041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-channel Pipette (30-300 &#956;L)</td>
			<td>Eppendorf, or similar</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MPK5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System, 10 &#956;L kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MPK1096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 15 mL Conical Sterile Centrifuge Tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>339651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OneTaq&#174; Hot Start Quick-Load&#174; 2X Master Mix</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>(M0489)</td>
			<td>for high GC% template</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>26616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip 0.1-20&#181;l</td>
			<td>Eppendorf, or similar</td>
			<td>0030 075.005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip 2-200&#181;l</td>
			<td>Eppendorf, or similar</td>
			<td>0030 075.021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip 50-1000&#181;l</td>
			<td>Eppendorf, or similar</td>
			<td>0030 075.064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pX458-DsRed2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>112219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td>purify plasmid from restriction digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0494S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RAW264.7</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB-71</td>
			<td>https://www.atcc.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Anti-ACE2 antibody [EPR4435(2)]</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab108252</td>
			<td>at 1/1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30027.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strep-Tactin Sepharose beads</td>
			<td>IBA Lifesciences</td>
			<td>2-1201-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTOX&#8482; Red Dead Cell Stain, for 633 or 635 nm excitation</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S34859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Polynucleotide Kinase</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution (0.25%), with phenol red</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZOE Fluorescent Cell Imager</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microtubes, PCR-clean</td>
			<td>Eppendorf, or similar</td>
			<td>0030 125.215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Clear Flat Bottom Polystyrene TC-treated Microplates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Clear Round Bottom TC-treated Microplate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3799</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

gene knock-in by crispr/cas9 and cell sorting in macrophage and t cell lines

Los estudios de genómica funcional del sistema inmune requieren manipulaciones genéticas que impliquen tanto la eliminación de genes diana como la adición de elementos a proteínas de interés. La identificación de las funciones génicas en modelos de líneas celulares es importante para el descubrimiento de genes y la exploración de los mecanismos intrínsecos de las células. Sin embargo, las manipulaciones genéticas de células inmunes como las células T y las líneas celulares de macrófagos utilizando knock-in mediado por CRISPR / Cas9 son difíciles debido a la baja eficiencia de transfección de estas células, especialmente en un estado de reposo. Para modificar los genes en las células inmunes, la selección de resistencia a los medicamentos y los vectores virales se utilizan típicamente para enriquecer a las células que expresan el sistema CRIPSR / Cas9, lo que inevitablemente resulta en una intervención indeseable de las células. En un estudio anterior, diseñamos reporteros fluorescentes duales acoplados a CRISPR / Cas9 que se expresaron transitoriamente después de la electroporación. Esta solución técnica conduce a la rápida deleción de genes en las células inmunes; sin embargo, la eliminación de genes en células inmunes como las células T y los macrófagos sin el uso de la selección de resistencia a los medicamentos o vectores virales es aún más desafiante. En este artículo, mostramos que mediante el uso de la clasificación celular para ayudar a la selección de células que expresan transitoriamente construcciones CRISPR / Cas9 dirigidas al locus Rosa26 en combinación con un plásmido donante, se puede lograr un knock-in de genes tanto en células T como en macrófagos sin enriquecimiento de resistencia a los medicamentos. Como ejemplo, mostramos cómo expresar ACE2 humano, un receptor del SARS-Cov-2, que es responsable de la actual pandemia de Covid-19, en macrófagos RAW264.7 mediante la realización de experimentos en cadena. Tales células de knock-in de genes pueden ser ampliamente utilizadas para estudios mecanicistas.

Siguiendo el protocolo descrito anteriormente para realizar experimentos knock-in en el locus mRosa26 utilizando macrófagos murinos RAW264.7, diseñamos un vector dirigido para expresar ACE2 humano, un receptor para el virus SARS-Cov-2(Figura 2A). Usando un diseño similar, generamos células T Jurkat humanas con la entrada de la proteína de fusión RASGRP1 marcada con OST(Figura 2C). Después de la transfección de tres plásmidos, dos de los cuales ...

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Gene Knock-in by CRISPR/Cas9 and Cell Sorting in Macrophage and T Cell Lines

Este protocolo utiliza reporteros fluorescentes y clasificación celular para simplificar los experimentos en cadena en líneas de macrófagos y células T. Se utilizan dos plásmidos para estos experimentos simplificados de knock-in, a saber, un plásmido que expresa CRISPR / Cas9 y DsRed2 y un plásmido donante de recombinación homóloga que expresa EBFP2, que se integra permanentemente en el locus Rosa26 en las células inmunes.

Knock-in de genes por CRISPR/Cas9 y clasificación celular en líneas de macrófagos y células T

Functional genomics studies of the immune system require genetic manipulations that involve both deletion of target genes and addition of elements to ...

El objetivo de este protocolo es simplificar el experimento knock-in mediado por CRISPR / Cas9 en líneas de macrófagos y células T, con la ayuda de reporteros fluorescentes y afectar la clasificación celular. ROSA26 Locus es conocido como un sitio de puerto seguro genómico para la inserción de transgenes. Es habitual expresar proteína de interés con o sin ataque en el mundo del ratón de 26 locus, o en el registro orto ortopédico humano.Parte 1: Diseño y construcción de plásmidos de sgRNAs dirigidos a Rosa26 Locus. Primero, diseñe sgRNAs del locus Rosa26 del ratón, utilizando secuencias de la informática del genoma del ratón, y Ensemble Genome Browser, luego descargue la secuencia genómica del gen Rosa26 del ratón. Vaya a la herramienta web en línea, CRISPOR, pegue 100 pares de bases de la secuencia de entrada del Rosa26 Locus.Luego seleccione un genoma, por ejemplo, Mus musculus-mouse reference genome 2011. A continuación, seleccione el tipo de PAM. Utilice el motivo NGG"PAM de 20 pb, reconocido por spCas9.Haga clic en Enviar. Elija una guía con un puntaje de alta especificidad, un puntaje de rendimiento alto y un menor número de objetivos. Deben evitarse las guías indicadas como ineficientes.En particular, se prefiere seleccionar dos guías con secuencias superpuestas, lo que puede aumentar la eficiencia de knock-in como se informó. Para la secuencia de cena caliente, sintetizar un avance ilegal y un reverso ilegal, que recocido fosforado y listo para clonación a factor. Preparar la disminución linealizada por Vactor a la que podría expresar es que tengo que reportero por BBS una digestión, como obtener el Neal, los legales al vector linealizado para generar el constructo final, que expresa simultáneamente el ARN guía y el cas nueve núcleo enlazado en con un DSRIP dos reportero fluorescente.Segunda parte: Construcción del vector de destino como plantilla de recombinación homóloga. Para la expresión de la proteína de interés. Por ejemplo, el humano duró.Desea sintetizar la secuencia de ADNc por fuente comercial y la etiqueta OST de afinidad u otro ataque comúnmente utilizado para la purificación de proteínas que se puede fusionar con la secuencia de ADNc. Recuerde incluir la secuencia de consenso kazaja antes del inicio del ADNc. Digerido por la enzima de restricción Asc1, y como obtener el CD y el inserto en la columna vertebral.Vactor, es decir, pKhR26-IBFP IBP que produce el objetivo final concentra el contenedor, cada uno, KB de cinco brazos homólogos primos y tres primos. El conjunto de reparto de expresiones incluye un promotor de CG, el restaurante UST, si desea que la región de Koonin esté vinculada a un Iris, si vfD reporter y un poly AC financia. Finalmente, en el horizonte apuntando al vector utilizando enzimas cortadoras únicas, como EcoR1 o BamH1, los resúmenes y el producto se purifican en una tienda que menos 20 grados en notas de electroporación.Se recomienda obtener una alta concentración de ADN vectorial linealizado. Tercera parte: La electroporación de macrófagos y líneas de células T prepara el cultivo celular después de la separación para las células geritalk. La densidad celular óptima fue de aproximadamente 0,5 millones de células por ML en el momento de la transfección.La electroporación completa en diez formatos macro de punta de moda nuclear prepara una placa de 24 pocillos que contiene 500 microlitros de crecimiento completo, medio sin antibióticos en cada pozo. Precalencier las placas en humidificado 37 grados, cubriendo al 5% esa incubadora de fracóster. Baje los parámetros de electroporación de entrada del sistema de operación eléctrica para jet cat o Rosales.Prepare los seguimientos de la mezcla de ADN celular o la operación de recolección de células de pollo. Curchin 25 centímetros cuadrados matraz de transferencia de células en los 15 animales. Desde que sonda, entonces Phillip las células por centrofugación a 90 veces G durante ocho minutos a temperatura ambiente, pídalo, los sobrenadantes.Para el lavado, vuelva a colocar las células con los cinco ML PBS, luego gire la suspensión celular por centrifugación utilizando la misma condición que el paso anterior. Quite los DPP. Y resuspend las almohadas celulares usando dos ML de DBS.Se queda micro pequeña suspensión de celdas y se mezcla con el mismo volumen de 0.2% Trepan Ballou para estimar el recuento de celdas de la muestra de carga en términos de ranura de conteo inserte la diapositiva Denie en la celda automatizada Connor y vea la imagen ellos mismos. A continuación, obtenga un resultado de recuento de celdas. Calcule 2 millones de células encontrará reputaciones de electroporación por experimento de golpeo transferir el número de células a 1.5 ML.Centrifugar dos células de pellets por centrifugación.Para ahorrar tiempo, se puede preparar una mezcla de electroporación durante la centrifugación que agrega 2.5 microgramos de cada uno de CRISPR CAS nueve vector 2.4 microgramos de arroz Belinda, vector hablador y re suspension Buffalo. Nuestro volumen total total de 55 macro camada en un nuevo tubo centrifugado de 1,5 ML suavemente vértice y. Brevemente de pie para mezclar bien.Deje la mezcla de presión Luxor y la temperatura ambiente antes de usar. Después de girar aspart, el DTB es esencialmente este fusible durante 30 segundos adicionales, retire la mayor cantidad posible de celdas de re-suspensión agregando la pipeta de mezcla de electroporación preparada hacia arriba y hacia abajo suavemente. La electroporación pidió el mezclador de electroporación de celda utilizando 10 micro pequeñas puntas de facción nuclear fue importante.Evite las burbujas de aire durante las caricias pi, costará una falla en la galvanoplastia. Pulse Inicio. después de lo cual la operación transfiere la muestra en un tiempo.El pozo de 24, las placas de pozo con una pre-advertencia del medio bruto realizan la misma presión eléctrica y los mismos procedimientos que los anteriores en las cuatro muestras replicadas restantes, sacuden suavemente la placa para asegurar una distribución uniforme de las células. Incubar las células en una incubadora de 37 grados durante 48 a 72 horas. Antes de los hechos, la clasificación celular a las 24 horas después de la transfección, examinar la expresión de la interrupción dos para el reportero del restaurante utilizando la microscopía fluorescente separada del representante para nosotros mismos indica que la electroporación está funcionando correctamente.Parte 4: clasificación de células para aislar las células putativas en cadena. Antes de preparar la clasificación celular, en 96 placas de pozo con 150 micro de medio bruto específico de tipo celular por pozo use un micro lugar inferior incorrecto para el cultivo y para sí mismo y el micro lugar de fondo plano para todas las células transfiera células a un FACS estéril para mantener el tubo en hielo y poner la caja en el camino a través de la ventana, conectándose a la sala de clasificación celular cuando corresponda, establezca el clasificador de células con boquilla de 85 micro metros y bajo caudal para la clasificación de células inmunes para lograr una evaluabilidad y supervivencia celular óptimas, tome muestras del vértice de la ventana de paso brevemente y cargue la muestra en las adquisiciones. Champer configuró el patinaje de hechos para la clasificación de células primero definió los embudos de ventas para la dispersión de Ford y la dispersión lateral, luego definió las células de vida obteniendo el conjunto de células rojas negativas.A continuación, encuentran una sola célula viva mediante una sola apertura de singlete utilizando el FSC H frente a FSE, un bloque multivariante. Finalmente, establezca una puerta para los DSR deseados dos y B si la subpoblación positiva de Volvo, lo que indica que las células se transfectaron con éxito con el vector CRISPR y el vector de bolsillo. Así que 10 células individuales en cada pozo de la placa de pozo 96 complementada con el precalentamiento, el medio de crecimiento completo utilizando el modo de período o el modo de célula única después de la clasificación incuban las placas de 96 pozos en la incubadora de cultivo celular para la expansión celular.Quinta parte: cribado de elevación de células knock-in positivas Después de aproximadamente dos semanas de expansión celular más allá de la supervivencia, las células en la placa de 48 pozos evalúan la expresión de BFP o citometría de flujo utilizando una pequeña proporción de células de proliferación utilizando las células tipo pared como poblaciones celulares de control negativas, que poseen un mayor porcentaje de células BFP positivas se mantienen para cumplir con la validación del extracto del ADN genómico de las células que debemos expresar. BFP pasa el ADN genómico aislado por PCR con cebadores que abarcan cada lado de los brazos homólogos, es decir, un primario localizado en la secuencia genómica, exterior al vector objetivo. El lado visto de hablar con el vector en este experimento, el tamaño predicho del producto de PCR amplificado con el primario es de 1.2 KV. Y con F dos y R dos es 1.2 KB resultados de secuenciación de Sanger. Así, los productos de PCR muestran las secuencias de cada unión de integración demostrando la posición correcta y de golpeo en el Rosa 26 Lucas.Digo como immuno blotting permite la validación de golpes correctos a nivel de proteína parte seis resultados representativos. Como ejemplo, publicado en un estudio anterior, expresamos que se consiguen 45 moléculas de adherencia que el inter con una etiqueta OSD, y hubo un locus de 26 en las células T de checkout posteriormente USD tacto. Obtengo 45 e incidentes directores o derribados por afinidad purificación y un sujeto a espectrometría de masas.Los datos proteómicos revelaron la interacción de las células T. Por lo tanto, este grupo de productos ha facilitado en gran medida la búsqueda de nuevos intercaladores para dilucidar la función de una proteína dada. Esta presentación técnica mostró que por expreso transitorio aumentó por línea de fundición RFP con el vector parlante co-expresado y BFP para rosa 26 locus.Generamos líneas celulares knocking con expresión génica permanente tanto en células T como en macrófagos, que son difíciles de realizar en manipulaciones genéticas. Estos métodos y recomendaciones son aplicables a Chris permitidos en afirmaciones de gran segmento de ADN para estudios mecanicistas de células inmunes, como para la identificación de proteínas, estudio de interacción de proteínas.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

La purificación de la población de células específicas de clasificación celular activado por fluorescencia (FACS)

Experimental and clinical studies often require highly purified cell populations.  FACS is a technique of choice to purify cell populations of known ...

Investigación

Inmunología e Infección

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

Transducción retroviral de receptores de células T en ratones las células T

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

Derivación de linfoma tímico líneas de células T de Atm - / -</sup Y P53 - / -</sup Ratones

Established cell lines are a critical research tool that can reduce the use of laboratory animals in research. Certain strains of genetically modified ...

Methods to Assess Beta Cell Death Mediated by Cytotoxic T Lymphocytes

Métodos para evaluar la Beta mediada por la muerte celular por linfocitos T citotóxicos

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease.  During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin ...

Generation of Multivirus-specific T Cells to Prevent/treat Viral Infections after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplant

Generación de células T Multivirus específicos para prevenir / tratar las infecciones virales después de trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully ...

Expanding Cytotoxic T Lymphocytes from Umbilical Cord Blood that Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr Virus, and Adenovirus

La expansión de los linfocitos T citotóxicos sangre del cordón umbilical que Citomegalovirus Target, Virus de Epstein-Barr, adenovirus y

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposón modificación del sistema de células T humanas primarias

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Mouse NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Ratón Naïve CD4<sup&gt; +</sup&gt; Aislamiento de células T y<em&gt; In vitro</em&gt; Diferenciación en subconjuntos de células T

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Analyzing the Functions of Mast Cells In Vivo Using 'Mast Cell Knock-in' Mice

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Análisis De Las Funciones De Los MastOcitos In Vivo Usando ' MastCell Knock-in' Ratones

Mast cells (MCs) are hematopoietic cells which reside in various tissues, and are especially abundant at sites exposed to the external environment, such ...

An Efficient and Simple Method to Establish NK and T Cell Lines from Patients with Chronic Active Epstein-Barr Virus Infection

Un método eficiente y Simple para establecer líneas de células T de pacientes con infección crónica activa Virus Epstein - Barr y NK

A number of methods have been described to establish NK/T cell lines from patients with lymphoma or lymphoproliferative syndrome. These methods employed ...