Name: gene knock-in by crispr/cas9 and cell sorting in macrophage and t cell lines
Uploaded: 2021-11-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Gene Knock-in by CRISPR/Cas9 and Cell Sorting in Macrophage and T Cell Lines at JoVE.com

Vi tackar flöde cytometri kärnanläggningen vid Xinxiang Medical University. Utvecklingen av sådan teknik har fått stöd av NSFC-81601360 LZ, 81471595 och 32070898 till YL. Arbetet stöds också av Foundation of Henan Educational Committee nr 21IRTSTHN030.

1. Design och Plasmid konstruktion av sgRNAs som riktar sig till Rosa26 Locus
<ol><li>Designguide RNAs runt önskad insättningsplats
	<ol>
<li>Se till att införingsplatsen för musen Rosa26 (nedan kallad mRosa26)inknårsexperiment finns i mRosa26:s förstaintron. denna webbplats har använts i tidigare studier28,29. För inknämningsförsök i mänskliga celler, se till att införingsplatse...

I våra experiment visade vi hur man utför knock-in redigering i immunceller från konstruktionsdesign till knock-in cell screening och validering med mänskliga Jurkat T-celler och murin RAW264.7 makrofager som exempel. Både T-cells- och makrofatcelllinjer är resistenta mot transfekt36,37; Problemet med låg effektivitet med CRISPR / Cas9-leverans kan dock övervinnas med hjälp av fluorescerande reportrar i kombination med cellsortering. Detta protokoll är ...

Immunceller är kritiska för försvar mot patogener. Både medfödd och adaptiv immunitet krävs för clearance av infektionsmedel och underhåll av vävnad homeostas1,2. Cellinjemodeller är viktiga verktyg för att förstå de molekylära grunderna i däggdjurens immunsystem; De används i funktionella in vitro-analyser, såsom modellering av aktivering av mänskliga T-celler, och för att bestämma funktionen hos genetiska faktorer för att aktivera eller dämpa immunsvar3,4. Det är viktigt att notera att däggdjurens immunsystem är enormt heterogent och, lika viktigt, ett stort antal molekyler kontrollerar differentiering, migration och funktion hos en viss cell typ5,6.
Grupperade regelbundet interrymda korta palindromiska upprepningar (CRISPR)/Cas9 genomredigeringsverktyg möjliggör genetisk manipulering av specifika celltyper, vilket underlättar funktionell anteckning av gener på ett exakt sätt7,8. Flera publicerade protokoll har beskrivit leveransen av CRISPR/ Cas9 i form av Cas9-guide RNA-komplex som kallas ribonukleoproteiner (RNPs) i HEK293-celler, Jurkat-cellinjer, primäraT-celler 9,10, makrofager11,12,13, stamceller14och andra15,16. I dessa protokoll uppnås genmärkning vanligtvis genom att en fluorescerande tagg smälts till endogenaproteiner 17,18. Men få försök har gjorts att använda dubbla fluorescerande reportrar, som är kompatibla med enkelcellssortering, för att underlätta knock-in experiment19,20, särskilt i immunceller.
Djupgående mekanistiska analyser som syftar till att förstå funktionerna hos en ny genetisk faktor i immunceller kräver i allmänhet cellliknande specifik radering av en gen, genetiska räddningsexperiment och helst identifiering av dess interagerare. Även om metoder för optimering av genetisk borttagning av gener i immunceller har publicerats9,15,21, har mycket färre metoder rapporterats för att införa knock-in alleler med mångsidiga funktioner för att förstå immunsvaret. Därför, i detta protokoll syftar vi till att beskriva i detalj ett effektivt och mycket reproducerbart protokoll för att uttrycka ett protein av intresse (POI) vid safe harbor locus Rosa26 i både mänskliga och murin immun cellinjer. Vi designade ett tvåfärgs reportersystem för att berika för celler transfekterade med plasmider som uttrycker CRISPR / Cas9 (DsRed2) och en rekombinant DNA-mall (EBFP2), som kan isoleras genom cellsortering. Efter detta protokoll fick vi flera knock-in linjer av den mänskliga T cellinjen Jurkat och murin makrofag RAW264.7 för funktionella analyser av dåligt studerade proteiner.
Som ett exempel visar vi i detta protokoll hur man får knock-in RAW264.7 makrofager som stabilt uttrycker mänskliga ACE2 (en receptor av SARS-Cov-2)22. Eftersom medfödda immunceller är involverade i patogenesen vid Covid-1923,24 ochhuman ACE2 betraktas som en viktig receptor som krävs för viralt inträde i celler före replikering, makrofager med knock-in av mänskliga ACE2 kan fungera som ett användbart verktyg för mekanistiska studier av viral multiplikation inuti makrofager. Parallellt presenterar vi också ett exempel på knock-in av en gen vid den mänskliga ROSA26 locus för att uttrycka RASGRP1 proteinet, som smältes vid dess amino ändstation med en affinitet Twin-Strep-tag (OST). T-celler är viktiga målceller i immunterapier, och ett ökande antal studier har fokuserat på manipulation av deras lyhördhet för cancer25,26. Eftersom Rasgrp1 är känt för att vara en viktig signalmolekyl nedströms T-cellsreceptorn och dess interagerare inte är välklarlagd 27, ger OST-RASGRP1-in-modellen grunden för att identifiera interactorer som reglerar T-cells svar på tumörer och infektion. Sammantaget kan dessa verktyg användas för Covid-19-studier och upptäckt av nya molekyler som interagerar med Rasgrp1.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amersham Imager 600</td>
			<td>Ge Healthcare</td>
			<td></td>
			<td>imaging of chemiluminescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin, sodium salt</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>194526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>7074</td>
			<td>at 1/5000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-RasGRP1 antibody, clone 10.1</td>
			<td>Merck</td>
			<td>MABS146</td>
			<td>1.0 &#956;g/mL of working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AscI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0558S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Actin (D6A8) Rabbit mAb</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>8457</td>
			<td>at 1/1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BamHI-HF</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3136S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BbsI-HF</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3539S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellometer Mini Automated Cell Counter</td>
			<td>Nexcelom Bioscience</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.coli DH5&#945; Competent Cells</td>
			<td>Takara</td>
			<td>9057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO (Dimethyl Sulfoxide)</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>196055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNeasy Blood &#38; Tissue Kits</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69506</td>
			<td>cell culture reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (10X), no calcium, no magnesium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14200075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) with high glucose</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30022.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRI-HF</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3101S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSAria&#8482; Fusion</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>equipped with biosafety cabinet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Canto flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 5 ml polystyrene round bottom test tube</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10099141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo version 10.7</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH (D16H11) XP&#160;Rabbit mAb</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>5174</td>
			<td>at 1/1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>31430</td>
			<td>at 1/5000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon ECL Ultra Western HRP Substrate</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>WBKLS0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon-PSQ PVDF Membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ISEQ00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jurkat</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB-152</td>
			<td>https://www.atcc.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin sulfate</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>194531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB agar powder</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>22700041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-channel Pipette (30-300 &#956;L)</td>
			<td>Eppendorf, or similar</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MPK5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System, 10 &#956;L kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MPK1096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 15 mL Conical Sterile Centrifuge Tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>339651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OneTaq&#174; Hot Start Quick-Load&#174; 2X Master Mix</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>(M0489)</td>
			<td>for high GC% template</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>26616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip 0.1-20&#181;l</td>
			<td>Eppendorf, or similar</td>
			<td>0030 075.005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip 2-200&#181;l</td>
			<td>Eppendorf, or similar</td>
			<td>0030 075.021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip 50-1000&#181;l</td>
			<td>Eppendorf, or similar</td>
			<td>0030 075.064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pX458-DsRed2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>112219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td>purify plasmid from restriction digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0494S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RAW264.7</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB-71</td>
			<td>https://www.atcc.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Anti-ACE2 antibody [EPR4435(2)]</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab108252</td>
			<td>at 1/1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30027.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strep-Tactin Sepharose beads</td>
			<td>IBA Lifesciences</td>
			<td>2-1201-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTOX&#8482; Red Dead Cell Stain, for 633 or 635 nm excitation</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S34859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Polynucleotide Kinase</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution (0.25%), with phenol red</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZOE Fluorescent Cell Imager</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microtubes, PCR-clean</td>
			<td>Eppendorf, or similar</td>
			<td>0030 125.215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Clear Flat Bottom Polystyrene TC-treated Microplates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Clear Round Bottom TC-treated Microplate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3799</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

gene knock-in by crispr/cas9 and cell sorting in macrophage and t cell lines

Funktionella genomikstudier av immunsystemet kräver genetiska manipuleringar som innebär både radering av målgener och tillsats av element till proteiner av intresse. Identifiering av genfunktioner i cellinjemodeller är viktigt för genupptäckt och utforskning av cell inneboende mekanismer. Genetiska manipuleringar av immunceller som T-celler och makrofagcelllinjer med CRISPR/Cas9-medierad knock-in är dock svåra på grund av den låga transfectioneffektiviteten hos dessa celler, särskilt i ett quiescent tillstånd. För att modifiera gener i immunceller används läkemedelsresistensval och virusvektorer vanligtvis för att berika för celler som uttrycker CRIPSR / Cas9-systemet, vilket oundvikligen resulterar i oönskade ingrepp av cellerna. I en tidigare studie designade vi dubbla fluorescerande reportrar kopplade till CRISPR/Cas9 som övergående uttrycktes efter elektroporation. Denna tekniska lösning leder till snabb genborttagning i immunceller; Genknackning i immunceller som T-celler och makrofager utan användning av läkemedelsresistensval eller virusvektorer är dock ännu mer utmanande. I den här artikeln visar vi att genom att använda cellsortering för att underlätta val av celler som övergående uttrycker CRISPR / Cas9-konstruktioner riktade mot Rosa26-locus i kombination med en donatorplasmid, kan genknackning uppnås i både T-celler och makrofager utan läkemedelsresistensberikning. Som ett exempel visar vi hur man uttrycker mänskliga ACE2, en receptor av SARS-Cov-2, som är ansvarig för den nuvarande Covid-19-pandemin, i RAW264.7 makrofager genom att utföra knock-in experiment. Sådana genknackning celler kan användas i stor utsträckning för mekanistiska studier.

Efter protokollet som beskrivs ovan för att utföra knock-in experiment på mRosa26 locus med hjälp av murin RAW264.7 makrofager, utformade vi en inriktning vektor för att uttrycka mänskliga ACE2, en receptor för SARS-Cov-2 virus (Figur 2A). Med en liknande design genererade vi mänskliga Jurkat T-celler med knock-in av det OST-märkta RASGRP1 fusionsproteinet (Figur 2C). Efter transfection av tre plasmider, varav två användes för uttryck av CRI...

Watch this Scientific Journal Video about Gene Knock-in by CRISPR/Cas9 and Cell Sorting in Macrophage and T Cell Lines at JoVE.com

Gene Knock-in by CRISPR/Cas9 and Cell Sorting in Macrophage and T Cell Lines

Detta protokoll använder fluorescerande reportrar och cellsortering för att förenkla inknöjande experiment i makrofag och T-cellinjer. Två plasmider används för dessa förenklade knock-in experiment, nämligen en CRISPR/Cas9- och DsRed2-uttrycker plasmid och en homolog rekombination donatorplasmid uttrycker EBFP2, som är permanent integrerad vid Rosa26 locus i immunceller.

Genknackning av CRISPR/Cas9 och cellsortering i makrofag och T-cellinjer

Functional genomics studies of the immune system require genetic manipulations that involve both deletion of target genes and addition of elements to ...

Målet med detta protokoll är att förenkla CRISPR/Cas9-medierat knock-in-experiment i makrofag och T-cellslinjer, med hjälp av fluorescerande reportrar och påverka cellsortering. ROSA26 Locus är känd som en genomisk säker hamnplats för införande av transgener. Det är vanligt att uttrycka protein av intresse med eller utan attack i musvärlden på 26 locus, eller i den mänskliga ortopedloggen.Del 1: Design och Plasmid Construction av sgRNAs som riktar sig till Rosa26 Locus. Först designar sgRNAs från musen Rosa26 locus, med hjälp av sekvenser från musgenominformatik, och Ensemble Genome Browser, ladda sedan ner den genomiska sekvensen av musen Rosa26-genen. Gå till online webbverktyget CRISPOR, klistra in 100 baspar av inmatningssekvensen från Rosa26 Locus.Välj sedan ett genom, till exempel Mus muskulos-musreferensgenom 2011. Välj sedan typen av PAM. Använd 20bp NGG"PAM-motiv, erkänt av spCas9.Klicka på Skicka. Välj guide med hög specificitetspoäng, hög poäng och färre av mål. Riktlinjer som anges som ineffektiva bör undvikas.I synnerhet föredras att välja två guider med överlappande sekvenser, vilket kan öka knock-in-effektiviteten som rapporterats. För varm dinsekvens, syntetisera en forward olagligt och en omvändning olaglig, som glödgade fosforerad och redo för kloning att ta hänsyn till. Förbered den linjära minskningen per Vactor som jag kan uttrycka är att jag måste reporter av BBS en matsmältning, som få Neal, de juridiska till den linjäriserade vektorn för att generera den slutliga konstruktionen, som samtidigt uttrycker guide RNA och CAS nio kärnan kopplad till en DSRIP två fluorescerande reporter.Del två: Konstruktion av inriktningsvektor som homolog rekombinationsmall. För att uttrycka proteinet av intresse. Till exempel varade människan upp.Du vill syntetisera cDNA-sekvensen efter kommersiell källa och affinitet OST-tagg eller annan vanlig attack för rening av protein kan smältas till cDNA-sekvensen. Kom ihåg att inkludera Kazak konsensussekvensen innan cDNA inleds. Smält av Asc1 begränsning enzym, och som få CD och insatsen i ryggraden.Vactor, nämligen pKhR26-IBFP IBP som ger den slutliga målinriktningen koncentrerar behållaren, var och en, KB av fem främsta och tre främsta homologa armar. Uttrycket innehåller en CG-promotor, UST-restaurangen, om du vill ha Koonin-regionen kopplad till en Iris, om VFD-reporter och en poly AC-fond. Slutligen vid horisonten riktad vektor med hjälp av unika skärenzymer, såsom EcoR1 eller BamH1, smältorna och produkten renas i en butik som minus 20 grader på elektroporeringsanteckningar.Det rekommenderas att få hög koncentration av linjäriserat vektor-DNA. Del tre: Elektroporering av makrofag och T-cellslinjer förbereder cellkultur följt separation för Geritalk-celler. Optimal celldensitet var cirka 0,5 miljoner celler per ML vid tidpunkten för transfection.Full elektroporering i tio makro små nukleära modespetsformat förbereder en 24 brunnsplatta som innehåller 500 mikroliter fullständig tillväxt, medium utan antibiotika i varje brunn. Förvärm plattorna i fuktad 37 grader, 5% täcker den inställningsinkubatorn. Snuva ner de elektriska inmatningssystemens ingångselektroporeringsparametrar för jetkatt eller Rosales.Förbered cell DNA-blandningsuppföljningar eller samla kycklingceller. Curchin 25 kvadratcentimeter kolvöverföringsceller i de 15 djuren. Sedan du rör, sedan Phillip cellerna genom centrofugation vid 90 gånger G i åtta minuter vid rumstemperatur, be om det, supernatanterna.För tvättning återanvänd cellerna med de fem ML PBS och snurra sedan cellfjädringen genom centrifugering med samma tillstånd som föregående steg. Ta bort DPPs. Och återanvänd cellkuddarna med två ML DBS.Du håller dig mikro liten cell suspension och blanda med lika volym på 0,2%Trepan Ballou för att uppskatta cellantalet belastningsprovet när det gäller att räkna slot infoga Connie slide i den automatiserade cellen Connor och visa bilden själva. Få sedan ett cellräkningsresultat. Beräkna 2 miljoner celler kommer att hitta rykte om elektroporation per knackande experiment överföra antalet celler till 1,5 ML.Centrifuge två pelletsceller genom centrifugalisering.För att spara tid kan elektroporationsblandningen beredas under centrifugaliseringen som lägger till 2,5 mikrogram av var och en av CRISPR CAS nio vektor 2,4 mikrogram Belinda ris, pratsam vektor och re suspension Buffalo. Vår totala volym på 55 makroskräp i ett nytt 1,5 ML centrifugerade rör är försiktigt vertex och. Stå kort för att blanda bra.Lämna Luxors tryckblandning och rumstemperatur före användning. Efter snurrande aspart är DTB denna i huvudsak säkring i ytterligare 30 sekunder, ta bort så mycket supernatant som möjligt suspendera celler genom att tillsätta den beredda elektroporationsblandningspipetten upp och ner försiktigt. Elektroporation bad om cellelektroporationsblandaren med 10 mikro liten kärnfalangspets var pipetter viktiga.Undvik luftbubblor under pi petting det kommer att kosta elektroplätering misslyckande. Tryck på start. därefter överförs provet om ett tag.Tja av 24, väl plattor med en för varning bruttomediet utför samma elektriska tryck och procedurer som ovan på de återstående fyra replikerade proverna, vagga försiktigt plattan för att säkerställa jämn fördelning av cellerna. Inkubera cellerna i 37 graders inkubator i 48 till 72 timmar. Innan faktum, cellsortering Vid 24 timmars posttransfection, undersöka uttrycket av stör två för restaurangreporter med florescent mikroskopi fristående från rep för oss själva indikerar att elektroporationen fungerar korrekt.Del 4: cellsortering för att isolera förmodade inknårceller. Innan cellsortering förbereds, i 96 brunnsplattor med 150 mikro lite celltypspecifikt bruttomedium per brunn använd fel bottenmikroplats för kultur och sig själv och den platta bottenmikroplatsen för alla celler överföra celler till en steril FACS för att hålla röret på is och för att sätta lådan i vägen genom fönstret, ansluta till cellsorteringsrummet när det är tillämpligt ställa in cellsortering med 85 mikrometer munstycke och lågt flöde för immuncellsortering för att uppnå optimal cellevalvering och överlevnad ta prover från genomkramningsfönstrets hörn kort och ladda provet i förvärven. Champer satte upp faktaskridskoåkning för cellsortering först definierade försäljningstrattar för Ford scatter och sidospridning, och definierade sedan livscellerna genom att få uppsättningen talar röda negativa celler.Därefter hittar de en levande enstaka celler genom att single singlet gating med FSC H mot FSE ett multi-varierat block. Ställ slutligen in en grind för önskade DSR två och B om Volvo positiva subpopulation, som indikerar celler framgångsrikt co transfected med CRISPR vektor och pocketing vektor. Så 10 enstaka celler i varje brunn av 96, välplåt kompletterad med förvärmningen, det kompletta tillväxtmediet med periodläge eller encellsläge efter sortering inkuberar 96, välplattor i cellkulturen inkubator för cellexpansion.Del fem: screening av höjning av positiva knock-in celler Efter ungefär två veckors cellexpansion förbi överleva, cellerna i 48 brunnsplattan bedöma uttrycket av BFP eller flöde cytometri med hjälp av en liten andel proliferate sig själv med hjälp av väggtypcellerna som en negativ kontrollcell populationer, med högre andel BFP positiva celler hålls för att uppfylla valideringsextraktet genomiskt DNA från de celler vi bör uttrycka BFP passerar det isolerade genomiska DNA genom PCR med primers som spänner över varje sida av de homologa armarna, nämligen en primär lokaliserar i den genomiska sekvensen, exteriör till målvektorn. Den sett sidan till att prata med vektorn i detta experiment, den förväntade storleken på PCR-produkten förstärkt med den primära är 1,2 KV. Och med F två och R två är 1,2 KB Sanger sekvensering resultat. Så PCR-produkter visar sekvenserna i varje integrationskorsning som visar rätt och knackar position i Rosa 26 Lucas.Jag säger som immuno blotting möjliggör validering av korrekt knacka på proteinnivå del sex representativa resultat. Som ett exempel, publicerat i tidigare studie, uttryckte vi att få 45 molekyler tack att inter med en OSD-tagg, och det fanns en 26 locus i kassan T-celler därefter USD takt. Jag får 45 och incidentdirektörer eller dras ner av affinitetsrening och ett ämne för masspektrometri.De proteomics data visade interaktion av T-celler. Därför har denna produktpool avsevärt underlättat sökandet efter nya intercalators för att klargöra funktionen hos ett givet protein. Denna tekniska presentation visade att genom transiently uttryckt ökad per gjuten linje RFP med den talande vektorn co-uttryckt och BFP för Rosa 26 locus.Vi genererade knackande cellinjer med permanent genuttryck i både T-celler och makrofager, som är svåra att utföra i genetiska manipuleringar. Dessa metoder och rekommendationer är tillämpliga på Chris tillåtna i påståenden om stora DNA-segment för mekanistiska studier av immunceller, såsom för identifiering av protein, proteininteraktionsstudie.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

Rening av specifik cell Befolkningen efter Fluorescens Aktivt cellsortering (FACS)

Experimental and clinical studies often require highly purified cell populations.  FACS is a technique of choice to purify cell populations of known ...

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

Retroviral Transduction av T-cell receptorer i Mus T-celler

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

Härledning av thymic Lymfom T-cellinjer från Atm - / -</sup Och P53 - / -</sup Möss

Established cell lines are a critical research tool that can reduce the use of laboratory animals in research. Certain strains of genetically modified ...

Methods to Assess Beta Cell Death Mediated by Cytotoxic T Lymphocytes

Metoder för att bedöma Beta Medierad Celldöd genom Cytotoxiska T-lymfocyter

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease.  During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin ...

Generation of Multivirus-specific T Cells to Prevent/treat Viral Infections after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplant

Generering av Multivirus-specifika T-celler för att förhindra / behandla virusinfektioner efter allogen hematopoetisk stamcellstransplantation

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully ...

Expanding Cytotoxic T Lymphocytes from Umbilical Cord Blood that Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr Virus, and Adenovirus

Expanderande Cytotoxiska T-lymfocyter från navelsträngsblod att Target cytomegalovirus, Epstein-Barr-virus, och adenovirus

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac transposon System Ändring av primära humana T-celler

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Cell-based Flow Cytometry Assay to Measure Cytotoxic Activity

Cell-baserade flödescytometri analys för att mäta cytotoxisk aktivitet

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Mouse NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Mus Naiv CD4<sup&gt; +</sup&gt; T Cell Isolering och<em&gt; In vitro</em&gt; Differentiering i T cellundergrupper

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Analyzing the Functions of Mast Cells In Vivo Using 'Mast Cell Knock-in' Mice

Analyzing the Functions of Mast Cells In Vivo Using 'Mast Cell Knock-in' Mice

Analysera funktionerna hos mastceller in vivo med hjälp av' mastcell knock-in' möss

Mast cells (MCs) are hematopoietic cells which reside in various tissues, and are especially abundant at sites exposed to the external environment, such ...