Name: gene knock-in by crispr/cas9 and cell sorting in macrophage and t cell lines
Uploaded: 2021-11-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Gene Knock-in by CRISPR/Cas9 and Cell Sorting in Macrophage and T Cell Lines at JoVE.com

Xinxiang Tıp Üniversitesi'nin akış sitometri çekirdek tesisine teşekkür ederiz. Bu teknolojinin geliştirilmesi, NSFC'nin LZ, 81471595 ve 32070898 YL'ye 81601360 vermesiyle desteklenmiştir. Çalışma ayrıca 21IRTSTHN030 sayılı Henan Eğitim Komitesi Vakfı tarafından da desteklenmektedir.

1. Rosa26 Locus'u Hedefleyen sgRNA'ların Tasarımı ve Plazmid İnşaatı
<ol><li>İstenilen ekleme sitesinin etrafında tasarım kılavuzu RNA'ları
	<ol>
<li>Fare Rosa26 için ekleme sitesinin (bundan böyle mRosa26olarak belirlenmiştir) çalma deneylerinin mRosa26'nınilk intronunda bulunduğundan emin olun; bu site önceki çalışmalarda kullanılmıştır28,29. İnsan hücrelerinde da...

Deneylerimizde, örnek olarak insan Jurkat T hücreleri ve murine RAW264.7 makrofajlarını kullanarak yapı tasarımından knock-in hücre taramasına ve doğrulamasına kadar bağışıklık hücrelerinde nasıl knock-in düzenlemenin gerçekleştirildiğini gösterdik. Hem T hücresi hem de makrofaj hücre hatları transfection36,37'yekarşı dirençlidir; bununla birlikte, CRISPR/Cas9 teslimatının düşük verimlilik sorunu, hücre sıralama ile birlikte fl...

Bağışıklık hücreleri patojenlere karşı savunma için kritik öneme sahiptir. Enfekte edicilerin temizlenmesi ve doku homeostazının bakımı için hem doğuştan gelen hem de uyarlanabilir bağışıklık gereklidir1,2. Hücre hattı modelleri, memeli bağışıklık sisteminin moleküler temellerini anlamak için temel araçlardır; insan T hücre aktivasyonunu modellemek gibi in vitro fonksiyonel tahlillerde ve immün yanıtların etkinleştirilmesinde veya sönümlemesinde genetik faktörlerin işlevinin belirlenmesinde kullanılırlar3,4. Memeli bağışıklık sisteminin son derece heterojen olduğunu ve aynı derecede önemli olan çok sayıda molekülün belirli bir hücre tipinin farklılaşmasını, göçlerini ve işlevini kontrol ettiğini belirtmek önemlidir5,6.
Kümelenmiş Düzenli Aralıklı Kısa Palindromik Tekrarlar (CRISPR)/Cas9 genom düzenleme araçları, genlerin kesin bir şekilde fonksiyonel ek açıklamalarını kolaylaştıran belirli hücre türlerinin genetik manipülasyonuna izin verir7,8. Yayınlanan birkaç protokol, CRISPR/Cas9'un HEK293 hücrelerinde ribonükleoproteinler (RNP' ler) olarak bilinen Cas9 kılavuzlu RNA kompleksleri, Jurkat hücre hatları, birincil T hücreleri9,10,makrofajlar11 , 12,13,kök hücreler 14 ve diğerleri15,16şeklinde teslimini tanımlamıştır. Bu protokollerde, gen etiketleme genellikle bir floresan etiketin endojen proteinlere kaynaştırılmasıyla elde edilir17,18. Bununla birlikte, özellikle bağışıklık hücrelerinde19,20darbeli deneyleri kolaylaştırmak için tek hücre sıralama ile uyumlu çift floresan muhabir kullanmak için çok az girişimde bulunulmuştır.
Yeni bir genetik faktörün bağışıklık hücrelerindeki işlevlerini anlamayı amaçlayan derinlemesine mekanistik analizler genellikle bir genin hücre tipi spesifik silinmesini, genetik kurtarma deneylerini ve etkileşimcilerinin ideal olarak tanımlanmasını gerektirir. İmmün hücrelerdeki genlerin genetik olarak silinmesinin optimizasyonu için yöntemler yayınlanmış olsa da, bağışıklık yanıtını anlamak için çok yönlü işlevlere sahip darbe alellerinin tanıtılması için9, 15,21, çok daha az yöntem bildirilmiştir. Bu nedenle, bu protokolde, hem insan hem de murine bağışıklık hücresi hatlarında güvenli liman locus Rosa26'da bir ilgi proteinini (POI) ifade etmek için verimli ve yüksek oranda tekrarlanabilir bir protokolü ayrıntılı olarak tanımlamayı amaçlıyoruz. CRISPR/Cas9 (DsRed2) ifade eden plazmidlerle enfekte olmuş hücreler için zenginleştirmek için iki renkli bir muhabir sistemi ve hücre sıralama ile izole edilebilen bir rekombinant DNA şablonu (EBFP2) tasarladık. Bu protokolün ardından, kötü çalışılmış proteinlerin fonksiyonel analizleri için insan T hücre hattı Jurkat ve murine makrofaj RAW264.7'nin birden fazla darbe hattını elde ettik.
Örnek olarak, bu protokolde insan ACE2 'yi (SARS-Cov-2 reseptörü) 22'yi kasten ifade edenRAW264.7 makrofajlarının nasıl elde edeceğimizi gösteriyoruz. Doğuştan gelen bağışıklık hücreleri Covid-19 23 ,24 patogenezinde yer aldığı ve insan ACE2'nin replikasyondan önce hücrelere viral giriş için gerekli olan önemli bir reseptör olarak kabul edildiği için, insan ACE2'nin darbe aldığı makrofajlar, makrofajların içindeki viral çarpmanın mekanistik çalışmaları için yararlı bir araç olarak hizmet edebilir. Buna paralel olarak, amino terminusunda Twin-Strep-tag (OST) benzeşimi ile kaynaşmış rasgrp1 proteinini ifade etmek için insan ROSA26 lokusunda bir genin çalınmasının bir örneğini de sunuyoruz. T hücreleri immün tedavilerde temel hedef hücrelerdir ve giderek artan sayıda çalışma kansere yanıt vermelerinin manipülasyonu üzerine odaklanmıştır25,26. Rasgrp1'in T hücre reseptörünün aşağı doğru önemli bir sinyal molekülü olduğu bilindiğinden ve etkileşimcileri iyi aydınlatılmamıştır27, OST-RASGRP1 knock-in modeli, T hücrelerinin tümörlere ve enfeksiyona tepkisini düzenleyen etkileşimcileri tanımlamak için temel sağlar. Birlikte ele alındığında, bu araçlar Covid-19 çalışmaları ve Rasgrp1 ile etkileşime giren yeni moleküllerin keşfi için kullanılabilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amersham Imager 600</td>
			<td>Ge Healthcare</td>
			<td></td>
			<td>imaging of chemiluminescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin, sodium salt</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>194526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>7074</td>
			<td>at 1/5000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-RasGRP1 antibody, clone 10.1</td>
			<td>Merck</td>
			<td>MABS146</td>
			<td>1.0 &#956;g/mL of working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AscI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0558S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Actin (D6A8) Rabbit mAb</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>8457</td>
			<td>at 1/1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BamHI-HF</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3136S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BbsI-HF</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3539S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellometer Mini Automated Cell Counter</td>
			<td>Nexcelom Bioscience</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.coli DH5&#945; Competent Cells</td>
			<td>Takara</td>
			<td>9057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO (Dimethyl Sulfoxide)</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>196055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNeasy Blood &#38; Tissue Kits</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69506</td>
			<td>cell culture reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (10X), no calcium, no magnesium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14200075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) with high glucose</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30022.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRI-HF</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3101S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSAria&#8482; Fusion</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>equipped with biosafety cabinet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Canto flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 5 ml polystyrene round bottom test tube</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10099141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo version 10.7</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH (D16H11) XP&#160;Rabbit mAb</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>5174</td>
			<td>at 1/1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>31430</td>
			<td>at 1/5000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon ECL Ultra Western HRP Substrate</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>WBKLS0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon-PSQ PVDF Membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ISEQ00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jurkat</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB-152</td>
			<td>https://www.atcc.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin sulfate</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>194531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB agar powder</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>22700041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-channel Pipette (30-300 &#956;L)</td>
			<td>Eppendorf, or similar</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MPK5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System, 10 &#956;L kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MPK1096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 15 mL Conical Sterile Centrifuge Tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>339651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OneTaq&#174; Hot Start Quick-Load&#174; 2X Master Mix</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>(M0489)</td>
			<td>for high GC% template</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>26616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip 0.1-20&#181;l</td>
			<td>Eppendorf, or similar</td>
			<td>0030 075.005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip 2-200&#181;l</td>
			<td>Eppendorf, or similar</td>
			<td>0030 075.021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip 50-1000&#181;l</td>
			<td>Eppendorf, or similar</td>
			<td>0030 075.064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pX458-DsRed2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>112219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td>purify plasmid from restriction digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0494S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RAW264.7</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB-71</td>
			<td>https://www.atcc.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Anti-ACE2 antibody [EPR4435(2)]</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab108252</td>
			<td>at 1/1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30027.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strep-Tactin Sepharose beads</td>
			<td>IBA Lifesciences</td>
			<td>2-1201-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTOX&#8482; Red Dead Cell Stain, for 633 or 635 nm excitation</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S34859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Polynucleotide Kinase</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution (0.25%), with phenol red</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZOE Fluorescent Cell Imager</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microtubes, PCR-clean</td>
			<td>Eppendorf, or similar</td>
			<td>0030 125.215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Clear Flat Bottom Polystyrene TC-treated Microplates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Clear Round Bottom TC-treated Microplate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3799</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

gene knock-in by crispr/cas9 and cell sorting in macrophage and t cell lines

Bağışıklık sisteminin fonksiyonel genomik çalışmaları, hem hedef genlerin silinmesini hem de elementlerin ilgi çekici proteinlere eklenmesini içeren genetik manipülasyonlar gerektirir. Hücre hattı modellerinde gen fonksiyonlarının tanımlanması, gen keşfi ve hücre içi mekanizmaların araştırılması için önemlidir. Bununla birlikte, CRISPR/Cas9 aracılı darbe kullanan T hücreleri ve makrofaj hücre hatları gibi bağışıklık hücrelerinin genetik manipülasyonları, özellikle sessiz bir durumda, bu hücrelerin düşük transfeksiyon verimliliği nedeniyle zordur. Bağışıklık hücrelerindeki genleri değiştirmek için, ilaç direnci seçimi ve viral vektörler tipik olarak CRIPSR/Cas9 sistemini ifade eden hücreler için zenginleştirmek için kullanılır ve bu da kaçınılmaz olarak hücrelerin istenmeyen müdahalesiyle sonuçlanır. Daha önceki bir çalışmada, CRISPR/Cas9 ile birleştiğinde elektroporasyondan sonra geçici olarak ifade edilen çift floresan muhabir tasarladık. Bu teknik çözüm bağışıklık hücrelerinde hızlı gen silinmesine yol açar; bununla birlikte, T hücreleri ve makrofajlar gibi bağışıklık hücrelerinde ilaç direnci seçimi veya viral vektörler kullanmadan gen darbesi daha da zordur. Bu yazıda, Rosa26 lokusunu hedef alan CRISPR/Cas9 yapılarını donör plazmid ile birlikte geçici olarak ifade eden hücrelerin seçimine yardımcı olmak için hücre sıralamasını kullanarak, ilaç direnci zenginleştirmesi olmadan hem T hücrelerinde hem de makrofajlarda gen darbesi elde edilebileceğini gösteriyoruz. Örnek olarak, mevcut Covid-19 salgınından sorumlu sars-Cov-2'nin bir reseptörü olan insan ACE2'nin RAW264.7 makrofajlarında nasıl ifade edilebilir olduğunu, darbe deneyleri yaparak gösteriyoruz. Bu tür gen darbeli hücreler mekanistik çalışmalar için yaygın olarak kullanılabilir.

Yukarıda açıklanan protokolün ardından murine RAW264.7 makrofajlarını kullanarak mRosa26 lokusunda darbe deneyleri yapmak için SARS-Cov-2 virüsü için bir reseptör olan insan ACE2'yi ifade etmek için bir hedefleme vektörü tasarladık (Şekil 2A). Benzer bir tasarım kullanarak, OST etiketli RASGRP1 füzyon proteininin(Şekil 2C)çalınmasıyla insan Jurkat T hücreleri oluşturduk. crispr/cas9 (DsRed2; pDsR-mR26-sg1 ve mRosa26 kno...

Watch this Scientific Journal Video about Gene Knock-in by CRISPR/Cas9 and Cell Sorting in Macrophage and T Cell Lines at JoVE.com

Gene Knock-in by CRISPR/Cas9 and Cell Sorting in Macrophage and T Cell Lines

Bu protokol, makrofaj ve T hücre satırlarındaki darbe denemelerini basitleştirmek için floresan muhabirleri ve hücre sıralamasını kullanır. Bu basitleştirilmiş knock-in deneyleri için iki plazmid kullanılır, yani CRISPR / Cas9- ve DsRed2 ifade eden plazmid ve bağışıklık hücrelerindeki Rosa26 lokusunda kalıcı olarak entegre edilen EBFP2'yi ifade eden homolog bir rekombinasyon donör plazmid.

MACROPHAGE ve T Hücre Hatlarında CRISPR/Cas9 ve Hücre Sıralama tarafından Gen Knock-in

Functional genomics studies of the immune system require genetic manipulations that involve both deletion of target genes and addition of elements to ...

Bu protokolün amacı, floresan muhabirlerin yardımıyla makrofaj ve T hücre hatlarında CRISPR/Cas9 aracılı çalma deneyini basitleştirmek ve hücre sıralamasını etkilemektir. ROSA26 Locus, transgenes yerleştirilmesi için genomik güvenli liman bölgesi olarak bilinir. 26 çekirgenin fare dünyasında veya insan orto kütüğünde saldırı olsun ya da olmasın ilgi proteinini ifade etmek olağandır.Bölüm 1: Rosa26 Locus'u Hedefleyen sgRNA'ların Tasarımı ve Plasmid İnşaatı. İlk olarak, fare genom bilişiminden diziler kullanarak fare Rosa26 lokusundan sgRNA'lar tasarlayın ve Ensemble Genom Tarayıcısı, ardından fare Rosa26 geninin genomik dizisini indirin. Çevrimiçi web aracı CRISPOR'a gidin, Rosa26 Locus'tan giriş sırasının 100 baz çiftini yapıştırın.Ardından bir genom seçin, örneğin, Mus kas-fare referans genomu 2011. Ardından, PAM türünü seçin.Gönder'i tıklatın. Yüksek özgüllük puanı, yüksek yapma puanı ve daha az off hedefi olan kılavuzu seçin. Verimsiz olarak belirtilen kılavuzlardan kaçınılmalıdır.Özellikle, rapor edildiği gibi darbe verimliliğini artırabilecek çakışan sıralara sahip iki kılavuz seçmek tercih edilir. Sıcak yemek dizisi için, fosforlu tavlanmış ve faktöre klonlamaya hazır bir ileri yasadışı ve ters bir yasadışı sentezle. Vactor başına doğrusal düşüşü hazırlayın, bbs bir sindirim tarafından muhabirlik yapmak zorunda, Neal almak gibi, son yapıyı oluşturmak için doğrusal vektörün yasalları, aynı anda kılavuz RNA ve CAS dokuz çekirdeğini bir DSRIP iki floresan muhabiri ile bağlantılı olarak ifade eder.İkinci Bölüm:Homolog Rekombinasyon Şablonu Olarak Hedefleme Vektörü İnşaatı. İlgi proteininin ifadesi için. Örneğin, insan dayandı.CDNA dizisini ticari kaynak ve benzeşim OST etiketi veya proteinin saflaştırılması için yaygın olarak kullanılan diğer saldırılara göre sentezlemek istiyorsanız, cDNA dizisine kaynaştırılabilir. cDNA'nın başlatılmasından önce Kazak konsensüs sırasını eklemeyi unutmayın. Asc1 kısıtlama enzimi tarafından sindirilir ve CD'yi ve kesici ucu omurgaya sokun.Vactor, yani pKhR26-IBFP IBP son hedefleme konsantresi kabı, her biri, kb beş asal ve üç asal homolog kol. İfade döküm seti, Koonin bölgesinin bir Iris'e bağlanmasını istiyorsanız, VFD muhabiri ve poli AC fonları varsa, bir CG organizatörü, UST restoranı içerir. Son olarak, EcoR1 veya BamH1 gibi benzersiz kesici enzimler kullanılarak ufuk hedefleme vektörü, sindirmeler ve ürün elektroporasyon notları üzerine eksi 20 derecelik bir mağazada saflaştırılır.Yüksek konsantrasyonda doğrusal vektör DNA'sı elde etmek önerilir. Üçüncü bölüm:Makrofaj ve T hücre çizgilerinin elektroporasyon, Geritalk hücreleri için izlenen hücre kültürünü hazırlar. Optimal hücre yoğunluğu transfeksiyon sırasında ML başına yaklaşık 0,5 milyon hücre idi.On makro küçük nükleer moda uç formatında tam elektroporasyon, her kuyuda antibiyotik içermeyen 500 mikroliter tam büyüme içeren 24 kuyu plakası hazırlar. Plakaları nemlendirilmiş 37 derece olarak önceden ısıt, %5'i bu ayar inkübatörü kaplıyor. Jet cat veya Rosales için elektrik çalışma sistemi giriş elektroporasyon parametrelerini kısın.Hücre DNA karışımı takipleri hazırlayın veya operasyon tavuk hücrelerini toplayın. Curchin 15 hayvanda 25 santimetrekare şişe transfer hücreleri. Tüp kullandığına göre, oda sıcaklığında sekiz dakika boyunca 90 kat G'de centrofugation ile hücreleri Phillip, bunu iste, süpernatantlar.Yıkama için, hücreleri beş ML PBS ile yeniden biriktirin, ardından hücre süspansiyonunu önceki adımla aynı durumu kullanarak santrifüjleme ile döndürün. DPP'leri kaldırın. Ve iki ML DBS kullanarak hücre yastıklarını yeniden kullan.Mikro küçük hücre süspansiyonu kalırsınız ve hücre sayısı yük örneğini sayma yuvası olarak tahmin etmek için% 0.2 Trepan Ballou eşit hacmiyle karıştırırsınız, otomatik hücre Connor'a Connie slaytı yerleştirin ve görüntünün kendilerini görüntüleyin. O zaman bir hücre sayısı sonucu alın. 2 milyon hücre hesaplayın, vurma deneyi başına elektroporasyon ününü bulacak, hücre sayısını santrifüjleme ile iki pelet hücresine 1,5 ML.Santrifüjüne aktarın.Zaman kazanmak için, CRISPR CAS dokuz vektör 2.4 mikrogram Belinda pirinci, konuşkan vektör ve yeniden süspansiyon Buffalo'nun her birinin 2,5 mikrogramını ekleyen santrifüjizasyon sırasında elektroporasyon karışımı hazırlanabilir. Yeni bir 1,5 ML santrifüjlü tüpte toplam 55 makro çöp hacmimiz hafifçe tepe noktası ve. Kısa bir süre iyice karıştırmak için durun.Kullanmadan önce Luxor basınç karışımını ve oda sıcaklığını bırakın. Aspart döndükten sonra, DTB esasen 30 saniye daha kaynaşır, hazırlanan elektroporasyon karışımı pipeti yavaşça yukarı ve aşağı ekleyerek hücreleri mümkün olduğunca fazla yeniden askıya alın. Elektroporasyon 10 mikro küçük nükleer fraksiyon ucu kullanarak hücre elektroporasyon mikserini istedi pipetler önemliydi.Pi petting sırasında hava kabarcıklarından kaçının, elektroliz arızasına mal olur. Başlangı çatır.'a basın. daha sonra işlem örneği bir süre içinde aktarır.24 kuyu, brüt ortam ön uyarı ile kuyu plakalar kalan dört çoğaltılmış numune üzerinde yukarıdaki gibi aynı elektrik basıncını ve prosedürlerini gerçekleştirmek, hücrelerin eşit dağılımını sağlamak için plakayı hafifçe sallayın. Hücreleri 37 derecelik inkübatörde 48 ila 72 saat kuluçkaya yatırın. Aslında, hücre sıralama Transfeksiyondan 24 saat sonra, bizim için temsilciden ayrılmış floresan mikroskopi kullanarak restoran muhabiri için disrupt two ifadesini incelemek, elektroporasyonun düzgün çalıştığını gösterir.Bölüm 4: putatif knock-in hücrelerini izole etmek için hücre sıralama. Hücre sıralama hazırlamadan önce, 150 mikro az hücre tipine özgü brüt ortama sahip 96 kuyu plakasında, kültür ve kendisi için yanlış alt mikro yer kullanın ve tüm hücreler için düz alt mikro yer, tüpü buzda tutmak ve kutuyu pencereden yola koymak için hücreleri steril bir FACS'a aktarır, uygulanabilir olduğunda hücre sıralama odasına bağlanmak, en uygun hücre evamizliğini ve sağkalımını elde etmek için bağışıklık hücresi sıralama için 85 mikro metre nozul ve düşük akış hızına sahip hücre sıralayıcısı, doğrudan pencere köşesinden kısa bir süre numune alın ve örneği alımlara yükleyin. Champer, hücre sıralama için olgu pateni kurdu, önce Ford saçılım ve yan dağılım için satış hunilerini tanımladı, ardından set konuşmalarını kırmızı negatif hücreler kazanarak yaşam hücrelerini tanımladı.Daha sonra, FSC H ve FSE'yi çok çeşitli bir blok kullanarak tekli gating ile canlı bir tek hücre bulurlar. Son olarak, hücrelerin CRISPR vektörü ve cep vektörü ile başarılı bir şekilde enfekte olduğunu gösteren Volvo pozitif alt nüfus ise, istenen DSR iki ve B için bir kapı ayarlayın. Yani 96'nın her kuyusunda 10 tek hücre, ön ısıtma ile desteklenmiş kuyu plakası, 96'yı kuluçkaya yatırdıktan sonra dönem modu veya tek hücre modunu kullanarak tam büyüme ortamı, hücre genişlemesi için hücre kültürü inkübatöründeki kuyu plakaları.Bölüm beş:pozitif darbe hücrelerinin yükselmesinin taranması Hayatta kalanları yaklaşık iki hafta boyunca hücre genişlemesinden sonra, 48 kuyu plakasındaki hücreler, duvar tipi hücreleri negatif kontrol hücresi popülasyonları olarak kullanarak küçük bir çoğalma oranı kullanarak BFP veya akış sitometrisinin ekspresyonunu değerlendirir, BFP pozitif hücrelerinin daha yüksek yüzdesine sahip olmak, genomik DNA'yı ifade etmemiz gereken hücrelerden doğrulamak için tutulur. BFP, izole edilmiş genomik DNA'yı PCR ile homolog kolların her iki tarafına yayılan astarlarla, yani genomik dizideki bir birincil konumla, hedefleme vektörüne dıştan geçirir. Bu deneyde vektörle konuşmanın görülen tarafı, birincil ile yükseltilen PCR ürününün tahmini boyutu 1,2 KV'dir. Ve F iki ve R iki ile 1.2 KB Sanger sıralama sonuçlarıdır. Yani PCR ürünleri, Rosa 26 Lucas'a doğru ve darbe pozisyonunu gösteren her entegrasyon kavşağının dizilerini gösterir.İmmün şişkinlik gibi protein seviyesi bölüm altı temsili sonuçlarda doğru vurma doğrulama sağlar diyorum. Örnek olarak, önceki çalışmada yayınlanan, 45 molekülün bir OSD etiketi ile inter'i tutturduğunu ve ödeme T hücrelerinde 26 lokus olduğunu ve daha sonra USD tact olduğunu ifade ettik. 45 ve olay yönetmeni alıyorum ya da yakınlık arınması ve kütle spektrometresine maruz kaldığım için aşağı çekiliyorum.Verileri proteomik olarak T hücrelerinin etkileşimini ortaya çıkardı. Bu nedenle bu ürün havuzu, belirli bir proteinin işlevini aydınlatmak için yeni interkalatörlerin aranmasını büyük ölçüde kolaylaştırmıştır. Bu teknik sunum, geçici olarak ifade edilen, konuşan vektör ile birlikte ifade edilen dökme hat RFP başına arttığını ve Rosa 26 locus için BFP olduğunu göstermiştir.Hem T hücrelerinde hem de makrofajlarda kalıcı gen ekspresy ekspresyonlu, genetik manipülasyonlarda gerçekleştirilmesi zor olan darbeli hücre çizgileri oluşturduk. Bu yöntemler ve öneriler, proteinin tanımlanması, protein etkileşimi çalışması gibi bağışıklık hücrelerinin mekanistik çalışmaları için büyük DNA segmentinin iddialarında izin verilen Chris için geçerlidir.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

Floresan Aktive Hücre Ayırma (FACS) Özgül Hücre Nüfus Arıtma

Experimental and clinical studies often require highly purified cell populations.  FACS is a technique of choice to purify cell populations of known ...

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

Fare T-hücrelerinin, T-hücre reseptörleri retroviral İletimi

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

Timik Lenfoma T-hücre Hatları türetilmesi Atm - / -</sup Ve P53 - / -</sup Fare

Established cell lines are a critical research tool that can reduce the use of laboratory animals in research. Certain strains of genetically modified ...

Methods to Assess Beta Cell Death Mediated by Cytotoxic T Lymphocytes

Sitotoksik T Lenfositler Beta Hücre Ölümü aracılığı ile değerlendirin yöntemleri

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease.  During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin ...

Generation of Multivirus-specific T Cells to Prevent/treat Viral Infections after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplant

Multivirus-spesifik T hücrelerinin üretilmesi Allojenik Hematopoetik Kök Hücre Nakli sonra Viral Enfeksiyonlar önleme / tedavi etmek için

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully ...

Expanding Cytotoxic T Lymphocytes from Umbilical Cord Blood that Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr Virus, and Adenovirus

Kordon Kanı adlı Sitotoksik T lenfositler genişletilmesi olduğunu Hedef Sitomegalovirüs, Epstein-Barr Virus ve Adenovirüs

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

Primer insan T hücrelerinin piggyBac Transposon Sistem Modifikasyon

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Mouse NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Fare Naif CD4<sup&gt; +</sup&gt; T Hücre İzolasyonu ve<em&gt; In vitro</em&gt; T hücre alt içine Farklılaşma

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Analyzing the Functions of Mast Cells In Vivo Using 'Mast Cell Knock-in' Mice

Analyzing the Functions of Mast Cells In Vivo Using 'Mast Cell Knock-in' Mice

' MastCell Knock-in'Fareleri Kullanarak Mast Hücrelerinin İşlevlerini Analiz Etme

Mast cells (MCs) are hematopoietic cells which reside in various tissues, and are especially abundant at sites exposed to the external environment, such ...

An Efficient and Simple Method to Establish NK and T Cell Lines from Patients with Chronic Active Epstein-Barr Virus Infection

NK ve kronik aktif Epstein - Barr virüsü enfeksiyonu olan hastalarda T hücre satırlarından kurmak için etkili ve basit bir yöntem

A number of methods have been described to establish NK/T cell lines from patients with lymphoma or lymphoproliferative syndrome. These methods employed ...