Name: circulating tumor cell lines: an innovative tool for fundamental and translational research
Uploaded: 2021-12-25T14:00:00
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Dieses Forschungsprojekt im Pannequin-Labor wurde durch ein Forschungsstipendium des SIRIC unterstützt: Grant « INCa-DGOS-Inserm 6045 ». Die Doktorarbeiten von Guillaume Belthier und Zeinab Homayed wurden von der Anti-Krebs-Liga/Ligue contre le Cancer unterstützt. Das Gehalt von Céline Bouclier wurde von der "Region Okzitanien" finanziert. Danke an Julian Venables für die englische Bearbeitung.

Alle In-vivo-Protokolle wurden von den Tierethikbehörden genehmigt.
1. CTC-Amplifikation unter 3D-Kulturbedingungen
<ol><li>Um CTCs in Suspension zu kultivieren, säen sie zuerst CTCs in Vertiefungen einer Ultra-Low Attachment (ULA) 24-Well-Platte bei der maximalen Konzentration von 5 Zellen / μL und in 1 ml M12-Medium (dh fortgeschrittenes DMEM-F12, ergänzt mit 2 mM l-Glutamin, 100 Einheit / ml Penicillin und Streptomycin, N2-Ergänzung, 20 ng / ml epidermalem Wachstumsf...

<ol>
	<li>Wittekind, C., Neid, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+invasion+and+metastasis.">Cancer invasion and metastasis.</a> Oncology. 69, 14-16 (2005).</li><li>Eger, A., Mikulits, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+epithelial-mesenchymal+transition.">Models of epithelial-mesenchymal transition.</a> Drug Discovery Today: Disease Models. 2, 57-63 (2005).</li><li>Palmirotta, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+biopsy+of+cancer:+a+multimodal+diagnostic+tool+in+clinical+oncology.">Liquid biopsy of cancer: a multimodal diagnostic tool in clinical oncology.</a> Therapeutic Advances in Medical Oncology. 10, (2018).</li><li>Hong, B., Zu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+circulating+tumor+cells:+current+challenges+and+new+trends.">Detecting circulating tumor cells: current challenges and new trends.</a> Theranostics. 3, 377-394 (2013).</li><li>vander Toom, E. E., Verdone, J. E., Gorin, M. A., Pienta, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technical+challenges+in+the+isolation+and+analysis+of+circulating+tumor+cells.">Technical challenges in the isolation and analysis of circulating tumor cells.</a> Oncotarget. 7, 62754-62766 (2016).</li><li>Jin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+diagnostic+value+of+circulating+tumor+cells+with+CytoSorter&#174;+CTC+capture+system+in+patients+with+breast+cancer.">Evaluation of the diagnostic value of circulating tumor cells with CytoSorter&#174; CTC capture system in patients with breast cancer.</a> Cancer Medicine. 9, 1638-1647 (2020).</li><li>Huang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+circulating+tumor+cells+and+tumor+response+in+colorectal+cancer+patients+treated+with+chemotherapy:+a+meta-analysis.">Relationship between circulating tumor cells and tumor response in colorectal cancer patients treated with chemotherapy: a meta-analysis.</a> BMC Cancer. 14, 976 (2014).</li><li>Yu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+culture+of+circulating+breast+tumor+cells+for+individualized+testing+of+drug+susceptibility.">Ex vivo culture of circulating breast tumor cells for individualized testing of drug susceptibility.</a> Science. 345, 216-220 (2014).</li><li>Aceto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+Tumor+Cell+Clusters+are+Oligoclonal+Precursors+of+Breast+Cancer+Metastasis.">Circulating Tumor Cell Clusters are Oligoclonal Precursors of Breast Cancer Metastasis.</a> Cell. 158, 1110-1122 (2014).</li><li>Grillet, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumour+cells+from+patients+with+colorectal+cancer+have+cancer+stem+cell+hallmarks+in+ex+vivo+culture.">Circulating tumour cells from patients with colorectal cancer have cancer stem cell hallmarks in ex vivo culture.</a> Gut. 66, 1802-1810 (2017).</li><li>Lee, W. Y., Hong, H. K., Ham, S. K., Kim, C. I., Cho, Y. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Colorectal+Cancer+in+Differentially+Established+Liver+Metastasis+Models.">Comparison of Colorectal Cancer in Differentially Established Liver Metastasis Models.</a> Anticancer Research. 34, 3321-3328 (2014).</li><li>Giraud, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progastrin+production+transitions+from+Bmi1+/Prox1++to+Lgr5high+cells+during+early+intestinal+tumorigenesis.">Progastrin production transitions from Bmi1+/Prox1+ to Lgr5high cells during early intestinal tumorigenesis.</a> Translational Oncology. 14, (2020).</li><li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+and+Evaluation+of+a+Novel+Size+Based+Circulating+Tumor+Cell+Isolation+System.">Optimization and Evaluation of a Novel Size Based Circulating Tumor Cell Isolation System.</a> PLoS One. 10, 0138032 (2015).</li><li>Beije, N., Jager, A., Sleijfer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+cell+enumeration+by+the+CellSearch+system:+the+clinician's+guide+to+breast+cancer+treatment.">Circulating tumor cell enumeration by the CellSearch system: the clinician's guide to breast cancer treatment.</a> Cancer Treatment Reviews. 41, 144-150 (2015).</li><li>Karabacak, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic,+marker-free+isolation+of+circulating+tumor+cells+from+blood+samples.">Microfluidic, marker-free isolation of circulating tumor cells from blood samples.</a> Nature Protocols. 9, 694-710 (2014).</li><li>Ozkumur, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inertial+Focusing+for+Tumor+Antigen-Dependent+and+-Independent+Sorting+of+Rare+Circulating+Tumor+Cells.">Inertial Focusing for Tumor Antigen-Dependent and -Independent Sorting of Rare Circulating Tumor Cells.</a> Science Translational Medicine. 5, (2013).</li></ol>

Das oben beschriebene Protokoll wurde ursprünglich für die funktionelle Charakterisierung der kolorektalen CTC verwendet, kann jedoch für andere Krebsarten wie Brustkrebs verwendet und für Mausmodelle angepasst werden.
Der wirklich limitierende Faktor ist die Anzahl der in der Blutprobe vorhandenen CTCs und die Effizienz der Technik, mit der sie isoliert und expandiert werden. Mehrere CTC-Isolationstechniken wurden auf der Grundlage spezifischer CTC-Eigenschaften beschrieben, wie z.B. pars...

Trotz jüngster Verbesserungen in der Krebsfrüherkennung und in der therapeutischen Strategie sind immer noch mehr als neunzig Prozent der Krebsmorbidität auf Metastasen zurückzuführen1. Der metastatische Prozess ist eine mehrstufige Kaskade, die mit der lokalen Ablösung von Zellen aus dem Primärtumor und ihrem Eintritt in den Blutkreislauf beginnt, wo sie zu zirkulierenden Tumorzellen (CTCs) werden, um schließlich entfernte Stellen wie Leber und Lunge zu besiedeln, im Falle von Darmkrebs (CRC)2. In letzter Zeit wächst die Aufmerksamkeit für Flüssigbiopsien, die ein nicht-invasives Werkzeug sind, um INSbesondere CTCs aus Patientenblutproben zu erkennen und aufzuzählen. Intratumor genetische Heterogenität ist eine Hauptursache für Arzneimittelresistenzen; Somit stellt die Isolierung repräsentativer Zellen aus Tumormaterial ein vielversprechendes Werkzeug für die personalisierte Medizin dar3.
Trotz der geringen Häufigkeit von CTCs im Blut (1 CTC pro 106 - 107 Leukozyten)4wurden mehrere Nachweis- und Isolationstechniken entwickelt, die auf Eigenschaftsunterschieden zwischen CTCs und anderen Bestandteilen des Blutes basieren5. Allein die Anzahl der CTCs in Patientenblutproben kann Aufschluss über das Stadium der Malignität, das Ansprechen auf die Behandlung und den Krankheitsverlauf geben6,7. Daher ist die CTC-Isolierung ein entscheidendes Instrument für translationale Studien zur Beurteilung der genetischen Heterogenität oder zur Durchführung von Arzneimittelscreenings sowie für grundlegende Studien zur Charakterisierung dieser invasiven Zellen, da sie die Schlüsselakteure der metastatischen Induktion sind8,9. Im Vergleich zu kommerziell etablierten Krebszelllinien, die im Laufe der Zeit Tausende von Mutationen angesammelt haben, teilen frische CTCs die Hauptmerkmale des ursprünglichen Primärtumors, einschließlich einer starken Fähigkeit zur Metastasierung, und sie spiegeln die Krankheit besser wider. Diese Eigenschaften machen sie zu einem robusten Werkzeug für grundlegende Studien, insbesondere in Knockout-Experimenten mit vorhergesagten Schlüsselfaktoren, die an der Metastasierung beteiligt sind. Das Ergebnis dieser Experimente kann in vivoan Mäusen validiert werden, wie unten beschrieben.
Sobald CTCs isoliert sind, können sie unter nicht-adhärenten Kulturbedingungen expandiert werden und dann können sie wie jede verfügbare Krebszelllinie manipuliert werden, d.h. sie können auch unter adhärenten Bedingungen kultiviert oder in Matrigel eingebettet werden, abhängig von der wissenschaftlichen Frage10. Um beispielsweise die Expression und Lokalisation eines interessierenden Proteins zu testen, können CTC-Kugeln in Suspensionszustand gezüchtet und in Histogel eingebettet werden, um Immunfluoreszenz auf Kugelabschnitten durchzuführen. Wenn das Protein membranös ist, kann seine Expression auf lebenden Zellen durch Zytometrie gemessen werden.
Um die Rolle eines interessierenden Proteins zu testen, das bei der Besiedlung der Leber eine Rolle spielen könnte, können CTCs mit Genen, die durch shRNA oder CRISPR/Cas9 bearbeitet wurden, in die Milz von immundefizienten Mäusen injiziert werden. Dieses letztgenannte Experiment ist ein leistungsfähiges Modell zur Nachahmung der Lebermetastasenkolonisation11.
Die Fähigkeit von CTCs, Tumore zu initiieren, kann beurteilt werden, indem eine sehr kleine Anzahl von Zellen in immundefiziente Mäuse injiziert wird. Da die Tumorinitiierung ein Kennzeichen von Krebsstammzellen (CSCs) ist, zeigt dieser Assay den Prozentsatz der CSCs innerhalb der CTC-Linien an. Dieser Stammzellphänotyp macht zirkulierende Tumorzelllinien resistent gegen einige Goldstandard-Krebstherapien. Erweiterte CTCs können daher verwendet werden, um Medikamente zu screenen und die beste potenzielle effiziente Behandlung für den Patienten zu ermitteln. Das Ansprechen von CTC auf die Behandlung kann in vitro beispielsweise mit einem Lumineszenz-Lebensfähigkeitstest getestet werden.
Langfristig könnte das Arzneimittelscreening auf frisch isolierten und amplifizierten CTCs als neues Werkzeug für die personalisierte Medizin eingesetzt werden, um bei der Auswahl der effizientesten und am besten angepassten Behandlung für Patienten zu helfen.
In der vorliegenden Arbeit werden Protokolle zur Kultivierung von CTC-Linien, zur Färbung spezifischer Proteine mittels Immunfärbung und Zytometrie, zur Durchführung von Zytotoxizitätsassays sowie in vivo Xenograft-Experimenten mit CTC detailliert beschrieben.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Accumax solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F-12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12634028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G7570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar 24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates,</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histiogel Specimen Medium</td>
			<td>LabStorage</td>
			<td>HG-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human EGF, premium grade</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-097-751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human FGF-2, premium grade</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

circulating tumor cell lines: an innovative tool for fundamental and translational research

Metastasierung ist eine der Hauptursachen für Krebstod. Trotz Verbesserungen der Behandlungsstrategien hat metastasierender Krebs eine schlechte Prognose. Wir stehen daher vor der dringenden Notwendigkeit, die Mechanismen hinter der Metastasenentwicklung zu verstehen und somit effiziente Behandlungen für fortgeschrittenen Krebs vorzuschlagen. Metastasierende Krebsarten sind schwer zu behandeln, da Biopsien invasiv und unzugänglich sind. In jüngster Zeit besteht ein erhebliches Interesse an Flüssigbiopsien, die sowohl zellfreie zirkulierende Desoxyribonukleinsäure (DNA) als auch zirkulierende Tumorzellen aus peripherem Blut umfassen, und wir haben mehrere zirkulierende Tumorzelllinien von patienten mit metastasierendem Dickdarmkrebs etabliert, um an ihrer Charakterisierung teilzunehmen. Um diese seltenen und schlecht beschriebenen Zellen funktionell zu charakterisieren, besteht der entscheidende Schritt darin, sie zu erweitern. Einmal etabliert, können zirkulierende Tumorzelllinien (CTC) dann in Suspensions- oder Adhärenzbedingungen kultiviert werden. Auf molekularer Ebene können CTC-Linien weiter verwendet werden, um die Expression spezifischer Marker von Interesse (wie Differenzierungs-, Epithel- oder Krebsstammzellen) durch Immunfluoreszenz- oder Zytometrieanalyse zu bewerten. Darüber hinaus können CTC-Linien verwendet werden, um die Arzneimittelempfindlichkeit gegenüber Goldstandard-Chemotherapien sowie gegenüber zielgerichteten Therapien zu beurteilen. Die Fähigkeit von CTC-Linien, Tumore zu initiieren, kann auch durch subkutane Injektion von CTCs in immundefiziente Mäuse getestet werden.
Schließlich ist es möglich, die Rolle spezifischer Gene von Interesse zu testen, die an der Krebsverbreitung beteiligt sein könnten, indem CTC-Gene, kurzhaarige Ribonukleinsäure (shRNA) oder Crispr/Cas9 bearbeitet werden. Modifizierte CTCs können somit in immundefiziente Mausmilzen injiziert werden, um einen Teil des metastatischen Entwicklungsprozesses in vivoexperimentell nachzuahmen.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass CTC-Linien ein wertvolles Werkzeug für die zukünftige Forschung und für die personalisierte Medizin sind, wo sie eine Vorhersage der Behandlungseffizienz mit genau den Zellen ermöglichen, die ursprünglich für die Metastasierung verantwortlich sind.

Sowohl EpCAM- als auch CD26-Expressionen, die von IF(Abbildung 1A rechtes Panel)bzw. FACS(Abbildung 1B)beobachtet wurden, deuten darauf hin, dass die CTC-Linie epithelial ist und eines der CSC-Kennzeichen10aufweist. Dieses epitheliale Merkmal kann durch Färbung mit Antikörpern, die gegen andere epitheliale und mesenchymale Marker gerichtet sind, weiter charakterisiert werden. Dadurch könnte es möglich sein, ungefähr ...

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Circulating Tumor Cell Lines: an Innovative Tool for Fundamental and Translational Research

Die Kultivierung von CTCs ermöglicht eine tiefere funktionelle Charakterisierung von Krebs, unter anderem durch die Untersuchung der spezifischen Markerexpression und die Bewertung der Arzneimittelresistenz und der Fähigkeit, die Leber zu besiedeln. Insgesamt könnte die CTC-Kultur ein vielversprechendes klinisches Werkzeug für die personalisierte Medizin sein, um das Patientenergebnis zu verbessern.

Zirkulierende Tumorzelllinien: ein innovatives Werkzeug für die Grundlagen- und Translationsforschung

Metastasis is a leading cause of cancer death. Despite improvements in treatment strategies, metastatic cancer has a poor prognosis. We thus face an ...

Metastasierung ist eine der Hauptursachen für krebsbedingte Todesfälle. Dieses Phänomen tritt auf, wenn sich Krebszellen vom Primärtumor lösen, in den Blutkreislauf gelangen, um schließlich ein entferntes Zielorgan zu erreichen. Sobald diese abgelösten Zellen in das Blut gelangen, nennen wir sie sekundäre Tumorzellen.Sie stellen ein variables Material dar, weil sie einerseits der Hauptschuldige für die Metastasenbildung sind und andererseits einfacher sind als Tumorbiopsien. In der Tat können sie durch eine einfache Blutpunktion gesammelt werden. Trotz der geringen Anzahl dieser Zellen in der Blutprobe sind wir die ersten, die mehrere zirkulierende Tumorzelllinien aus dem Blut des Patienten mit größerer Besorgnis unter Verwendung der 3D-kontrollierten Bedingung herstellen.Diese Zelllinie kann an jeder kommerziellen Zelllinie für Routineexperimente verwendet werden. Zum Beispiel für das genetische Wirkstoff-Screening, für Proteine von Interesse, aber auch für In-vivo-Experimente, um die Tumorinitiierungskapazität und ihr metastatisches Potenzial zu testen. CTC, zirkulierende Tumorzelllinien, sollten unter 3D-Bedingungen bei Hypoxie kultiviert werden.Sobald CTC Kugeln gebildet hat, können wir es in das Medium geben und es für fünf Minuten bei 300 RCF zentrifugieren. Verwerfen Sie den Überstand und fügen Sie 500 Mikroliter Accumax hinzu. Wir suspendieren eine und inkubieren die Lösung 20 Minuten bei 37 Grad.Dann dissoziierte Kugeln mit PBS waschen und die Zellen pelletieren. Resuspendieren Sie das Pellet mit einem frisch ergänzten DMEM/F12 und sehen Sie die Zellen mit der Dichte von fünf Zellen pro Mikroliter in einer neuen 24 Low Attachment Platte. Zentrifugen-CTCs-Kugeln eliminieren den Überstand und waschen das Pellet zweimal mit PBS.Bei 500 Mikroliter PFE gut mischen und die Tube 20 Minuten auf Eis inkubieren. Dann zentrifugieren Sie die festen Kugeln und waschen Sie das Pellet zweimal mit PBS, wodurch das maximale Volumen von PBS eliminiert wird, und fügen Sie 20 Mikroliter gebildetes HistoGel hinzu. Nehmen Sie es zur Suspension und machen Sie einen Tropfen auf die Kulturvase, lassen Sie es für 10 Minuten trocknen und lösen Sie es mit einem Skalpell.Sie können jetzt für jedes gewünschte zu CTCs verarbeiten, die auf ein gewünschtes Protein von Interesse abzielen. Sammeln Sie CTCs und trennen Sie die Kugeln mit Accumax, wie zuvor beschrieben. Eliminieren Sie den Accumax und resuspenieren Sie das Pellet mit drei ml Blockpuffer und übertragen Sie die Suspension durch ein 14 Mikrometer großes Zellsieb, um eine Einzelzelllösung zu erhalten.Zählen Sie die Zellen und versenden Sie sie in Röhrchen und fügen Sie ein Volumen von 200.000 Zellen hinzu, zentrifugieren Sie die Röhrchen und verwerfen Sie den Überstand. Fügen Sie gemäß dem Antikörperdatenblatt in einem Röhrchen das gewünschte Volumen des Antikörpers und in einem anderen Röhrchen seinen Isotyp hinzu und setzen Sie die Schritte gemäß den Anweisungen des Herstellers fort. Das verbleibende Röhrchen wird nicht gekennzeichnet und die Verwendung eines Rentabilitätsmarktes wird in diesem Experiment dringend empfohlen.Beginnen Sie auf dem Zytometer mit der nicht markierten Röhre, um die Spannung im negativ markierten Bereich einzustellen. Platzieren Sie anschließend das Isotyp-Röhrchen. Der Isotyp würde als Negativkontrolle dienen, um zwischen dem positiven Signal und dem unspezifischen Signal zu unterscheiden.Und beenden Sie das Experiment mit den markierten Zellen mit dem Antikörper von Interesse, wo Sie eine Verschiebung im positiv markierten Tor sehen sollten, wenn das Protein von Interesse exprimiert wird. Diese suspendiert dissoziierte CTCs in ergänztem Medium bei einer Dichte von 200.000 Zellen pro ml. In einem Ultra Low Aufsatz 96, Brunnenplatte, versiegeln Sie das Volumen von 50 Mikroliter und inkubieren Sie die Platte 24 Stunden bei Hypoxie.Fügen Sie am nächsten Tag 50 Mikroliter mit unterschiedlicher Konzentration des getesteten Arzneimittels hinzu und fügen Sie das gleiche Volumen von DMEM / F12 hinzu, nur um die Basis der zellulären Lebensfähigkeit weiter zu bestimmen und die Platte für weitere 48 Stunden zu inkubieren. Am dritten Tag rekonstituieren Sie das Mittel und geben Sie 70 Mikroliter der Mischung in jede Vertiefung. Legen Sie die Platte für 20 Minuten auf einen Orbitalschüttler und messen Sie dann die Lumineszenz.Dieser Assay ist ein nützliches Werkzeug, um eine große Anzahl von Medikamenten zu testen, um ihre Auswirkungen auf das Zellwachstum von CTC zu bewerten. In Eppendorf resuspend Zellen in 100 Mikroliter PBS kneifen die Haut auf dem Rücken der Maus und führen die Nadel unter die Haut ein. Injizieren Sie langsam das gesamte Volumen an der gleichen Stelle und überwachen Sie das Tumorwachstum jeden zweiten Tag und opfern Sie die Mäuse, wenn der Tumor eine Größe von 1,5 Kubikzentimetern überschreitet.Vor der Operation subkutan ein Schmerzmittel injizieren, an der dorsalen ventralen Seite der Maus, machen Sie einen kleinen Schnitt unterhalb der 10. Rippe. Heben Sie die Milz vorsichtig heraus und legen Sie sie auf eine sterile Gaze. Injizieren Sie mit einer Insulinspritze 50 Mikroliter resuspendierte CTCs in PBS und warten Sie drei Minuten, ohne die Nadel zu entfernen.Ligat das arterielle Gefäß von einer Seite und das käufliche Gefäß von der anderen Seite. Entfernen Sie dann die Milz, indem Sie direkt über den beiden Ligaturen schneiden. Nähen Sie das Bauchperitoneum und die Haut und desinfizieren Sie den Bereich gut.Ziel dieses Experiments ist es, die Fähigkeit von CTCs von Darmkrebspatienten zu testen, die Leber durch Induktion einer sichtbaren metastatischen Voraussicht zu besiedeln. Die Isolierung und Etablierung der klinischen Tumorzelllinie ist ein emergentes Werkzeug sowohl für grundlegende als auch für translationale Studien. Zum Beispiel, wenn Sie ein Gen von Interesse haben, bei dem die In-vivo-Studien gezeigt haben, dass dieses Gen an der Migration und Invasionskapazität von Darmkrebszelllinien beteiligt ist, könnte das Ausschalten dieses Gens in zirkulierenden Tumorzelllinien vor der Injektion in die Milz von Mäusen ein gutes Werkzeug sein, um sie die Leber kolonisieren zu lassen, könnte ein gutes Werkzeug sein, um Ihr Ergebnis in vivo zu bestätigen.Für translationale Studien besteht unsere Hauptperspektive bei der Isolierung zirkulierender Tumorzelllinien darin, dieses wertvolle Material in der personalisierten Medizin zu verwenden. Aus den Blutproben des Patienten würden wir CTCs in Kultur für zwei oder drei Wochen isolieren und amplifizieren, um genügend Material zu haben, um das verfügbare Arzneimittelpanel zu screenen und seine Zytotoxizität zu bewerten, um schließlich zuzuordnen

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Capture and Release of Viable Circulating Tumor Cells from Blood

Erfassung und Veröffentlichung durchführbare zirkulierender Tumorzellen aus Blut

We demonstrate a method for size based capture of viable circulating tumor cell (CTC) from whole blood, along with the release of these cells from chip ...

Forschung

Krebsforschung

Isolation of Circulating Tumor Cells in an Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer

Isolierung von zirkulierenden Tumorzellen in einem orthotopischen Mausmodell des Darmkrebses

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, subcutaneous mouse models have severe limitations and do not accurately simulate ...

The Establishment of a Lung Colonization Assay for Circulating Tumor Cell Visualization in Lung Tissues

Die Einrichtung eines Lunge Kolonisation Assays für zirkulierenden Tumor Zelle Visualisierung im Lungengewebe

Metastasis is the major cause of cancer death. The role of circulating tumor cells (CTCs) in promoting cancer metastasis, in which lung colonization by ...

Paramyxoviruses for Tumor-targeted Immunomodulation: Design and Evaluation Ex Vivo

Paramyxoviruses für Tumor-gezielte Immunmodulation: Gestaltung und Evaluation Ex Vivo

Successful cancer immunotherapy has the potential to achieve long-term tumor control. Despite recent clinical successes, there remains an urgent need for ...

Patient-derived Orthotopic Xenograft Models for Human Urothelial Cell Carcinoma and Colorectal Cancer Tumor Growth and Spontaneous Metastasis

Patientenabgeleitete orthotopische Xenograft-Modelle für humanes Urotheliale Zellkarzinom und Kolorektalkrebs-Tumorwachstum und spontane Metastasierung

Cancer patients have poor prognoses when lymph node (LN) involvement is present in both high-grade urothelial cell carcinoma (HG-UCC) of the bladder and ...

Establishment and Characterization of Three Afatinib-resistant Lung Adenocarcinoma PC-9 Cell Lines Developed with Increasing Doses of Afatinib

Etablierung und Charakterisierung von drei Afatinib-resistenten Lungenadenokarzinom PC-9 Zelllinien entwickelt mit zunehmenden Dosen von Afatinib

Acquired resistance to molecular target inhibitors is a severe problem in cancer therapy. Lung cancer remains the leading cause of cancer-related death in ...

Micromanipulation of Circulating Tumor Cells for Downstream Molecular Analysis and Metastatic Potential Assessment

Mikromanipulation von zirkulierenden Tumorzellen für die nachgelagerte Molekulare Analyse und die metastasierende Potenzialbewertung

Blood-borne metastasis accounts for&#160;most cancer-related deaths and involves circulating tumor cells (CTCs) that are successful in establishing new ...

Detection and Monitoring of Tumor Associated Circulating DNA in Patient Biofluids

Nachweis und Überwachung von tumorassoziierter zirkulierender DNA in Biofluiden von Patienten

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

Etablierung von vom Magenkrebs abgeleiteten Xenograft-Modellen und Primärzelllinien

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Semi-automatic PD-L1 Characterization and Enumeration of Circulating Tumor Cells from Non-small Cell Lung Cancer Patients by Immunofluorescence

Halbautomatische PD-L1-Charakterisierung und Aufzählung zirkulierender Tumorzellen von nicht-kleinen Lungenkrebspatienten durch Immunfluoreszenz

Circulating tumor cells (CTCs) derived from the primary tumor are shed into the bloodstream or lymphatic system. These rare cells (1&#8722;10 cells per mL ...