Name: culture methods to study apical-specific interactions using intestinal organoid models
Uploaded: 2021-03-23T14:30:00
Duration: 7 min 49 s
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Cette recherche a été financée par la subvention Horizon 2020 OrganoVIR 812673 sur le projet Organoids for Virus Research - An innovative training-ITN programme.

Le dérivation des cultures organoïdes intestinales humaines a été réalisée comme décrit ailleurs23. Les organoïdes ont été maintenus en culture comme décrit dans la fiche d’information sur le produit (PIS) pour le milieu d’expansion organoïde intestinal (voir la table des matériaux).
1. Inversion de la polarité organoïde intestinale
REMARQUE: Cette section décrira le protocole pour inverser la polarité des organoïdes intestinaux 3D. Ce protocole fournit une procédure détaillée pour l’établissement d’organoïdes polarisés avec une surface apicale exposée en suspension dans une plaque de culture. Ce protocole est conçu comme un test final, bien que les organoïdes puissent être maintenus dans cette conformation pendant plus de 2 semaines et maintenir une petite population de cellules souches qui leur permet de rétablir les organoïdes apicaux lors du passage.
<ol><li>Revêtement d’articles de culture et de tubes avec une solution anti-adhérente REMARQUE: Pour maximiser le nombre d’organoïdes intestinaux apicaux et prévenir la fixation indésirable à l’article de culture, un pré-enrobage des articles de culture est généralement nécessaire. La section décrite ci-dessous décrit le revêtement de culture et de plastique avec une solution anti-adhérente.<ol>
<li>Plaques de culture de revêtement à utiliser dans la partie suspension du protocole comme suit.<ol>
<li>Ajouter 0,5 mL de solution anti-adhérente à chaque puits d’une plaque de culture tissulaire de 24 puits.</li>
			<li>Faire pivoter la plaque pour répartir la solution uniformément sur la surface et les parois des puits.</li>
			<li>Centrifuger la plaque à 1 300 x g pendant 10 min.</li>
			<li>Retirer la solution anti-adhérente de chaque puits à l’aide d’un aspirateur ou d’une pipette de 1 mL.</li>
			<li>Laver les puits avec 1 mL de DMEM/F-12 avec 15mM HEPES (DMEM/F12).</li>
			<li>Remplissez bien chaque puits lavé avec 0,5 mL de DMEM/F-12 et conservez la plaque à 37 °C et 5 % deCO2 jusqu’à utilisation. REMARQUE: Si elles ne sont pas utilisées immédiatement, les plaques revêtues peuvent être conservées dans l’incubateur pendant au moins 1 semaine.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Enrobez les tubes coniques de 15 mL utilisés dans ce protocole comme suit.<ol>
<li>Ajouter 4 mL de solution anti-adhérente au tube conique de 15 mL.</li>
			<li>Faire pivoter le tube pour répartir la solution uniformément sur la surface des parois.</li>
			<li>Centrifuger le tube à 1 300 x g pendant 10 min.</li>
			<li>Retirez la solution anti-adhérente du tube.</li>
			<li>Laver le tube 1x avec 5 mL de DMEM/F-12 et aspirer le DMEM/F-12. Les tubes sont maintenant prêts à l’emploi. REMARQUE: Si vous n’utilisez pas immédiatement, ajouter 5 ml de DMEM/F12 et conserver à 4 °C. Les tubes enduits peuvent être maintenus à 4 °C pendant au moins une semaine.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Inversion de polarité des organoïdes intestinaux par culture en suspension REMARQUE: Les étapes ci-dessous décrivent l’inversion d’organoïdes intestinaux précédemment cultivés dans des conditions de dôme ECM standard. Les procédures décrites ici sont pour un puits d’une plaque de 24 puits. Si vous utilisez un autre matériel de culture, ajustez les volumes en conséquence.<ol>
<li>Retirez et jetez soigneusement le milieu de chaque puits contenant des organoïdes sans perturber le dôme de la matrice extracellulaire de la membrane sous-sol. Assurez-vous que la taille des organoïdes est de 150 à 250 μm de diamètre (généralement au jour 3-5) avant de commencer le protocole d’inversion.</li>
		<li>Ajouter 1 mL de solution de dissociation glacée dans chaque puits.</li>
		<li>Incuber à température ambiante (15-25 °C) pendant 1 min.</li>
		<li>Ajouter au moins 2 mL de solution anti-adhérente à un tube de 15 mL à utiliser pour le revêtement des pointes en plastique.</li>
		<li>Ajouter au moins 2 mL de DMEM/F-12 à un tube de 15 mL à utiliser pour laver les pointes en plastique rincées avec une solution anti-adhérente.</li>
		<li>Enduire une pointe de pipette de 1 mL avec une solution anti-adhérente, piper 1 mL de solution trois fois dans le tube avec une solution anti-adhérente de l’étape 1.2.4.</li>
		<li>Laver la pointe dans du DMEM/F-12 froid, en piper 1 mL de solution trois fois dans le tube avec du DMEM/F-12 de l’étape 1.2.5.</li>
		<li>À l’aide de la pointe enduite, délogez soigneusement les dômes en pipetant lentement. Veillez à ne pas perturber ou fragmenter les organoïdes.</li>
		<li>Transigeon de la suspension organoïde sur une plaque traitée avec une solution anti-adhérente (à partir de l’étape 1.1.1).</li>
		<li>Placer la plaque sur un agitateur à 4 °C pendant 30 min. Un gyro shaker peut être utilisé à 70 tr / min. REMARQUE: Évitez les secousses sévères, telles que le vortex de l’échantillon, car cela peut entraîner une fragmentation organoïde. La formation de bulles et de mousse peut indiquer des secousses sévères.</li>
		<li>Après 30 min, retirez la plaque. À l’aide d’une pointe de pipette de 1 mL recouverte d’une solution anti-adhérente, pipetter doucement la solution de haut en bas.</li>
		<li>Placer la plaque sur un agitateur à 4 °C pendant 15 min. Un gyro shaker peut être utilisé à 70 tr / min.</li>
		<li>Retirer la plaque et laisser les organoïdes se déposer par gravité (1-2 min à température ambiante). Observez la plaque au microscope pour vérifier la sédimentation organoïde. REMARQUE: Évitez une agitation importante de la plaque car elle peut provoquer la remise en suspension des organoïdes réglés.</li>
		<li>Une fois les organoïdes installés, retirer autant que possible la solution de dissociation et laver en ajoutant 1,5 mL de DMEM/F-12.</li>
		<li>Laisser les organoïdes sédimenter et éliminer autant de surnageant que possible. Répétez l’étape de lavage une fois de plus. NOTA : Observer la plaque au microscope pour vérifier la sédimentation organoïde avant d’effectuer toute étape de lavage.</li>
		<li>Retirez autant que possible le DMEM/F-12 et ajoutez 0,5 mL de milieu d’expansion organoïde intestinal. Incuber à 37 °C et 5 % deCO2.</li>
		<li>Le lendemain, effectuez un changement partiel de milieu en inclinant la plaque sur un angle de 25 à 30 degrés et en enlevant le milieu le long de la paroi du puits. Enlever 0,4 mL de milieu en prenant soin de ne pas enlever les organoïdes en suspension.</li>
		<li>Ajouter 0,4 mL de milieu d’expansion organoïde intestinale. Incuber à 37 °C et 5 % deCO2 pendant 3 jours. REMARQUE: Après 3 jours, la plupart des organoïdes devraient avoir une polarité apicale, mais de grands agrégats peuvent s’être formés.</li>
		<li>Si des granulats se sont formés, utiliser une pipette de 1 mL avec une pointe recouverte d’une solution anti-adhérente (comme décrit aux étapes 1.2.6 et 1.2.7) pour ciselé les granulats en pipent 20 fois de haut en bas tout en appuyant sur l’extrémité de la pointe dans le fond de la plaque.</li>
		<li>Placer la plaque à 37 °C et 5 % deCO2 et effectuer un changement complet du milieu le lendemain avec le milieu d’expansion organoïde intestinale (tel que décrit à la section 1.2.17).</li>
		<li>Après 2 jours (jour 5 en suspension), les organoïdes intestinaux apicaux peuvent être utilisés dans les essais en aval.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Établissement de cultures monocouches 2D de cellules intestinales et d’interface air-liquide (ALI) dérivées d’organoïdes intestinaux 3D
REMARQUE: Cette section décrira le protocole pour générer des cultures monocouches 2D à partir d’organoïdes intestinaux. Cette technique offre l’avantage d’établir une culture monocouche confluente et polarisée avec une surface apicale exposée dans une plaque de culture tissulaire contenant un insert de membrane de culture cellulaire. Bien que la monocouche commence à se différencier dans le format monocouche submergé, une différenciation supplémentaire de la monocouche peut être obtenue en passant à une culture ALI après qu’elle ait atteint la confluence. Les protocoles monocouche et ALI ultérieurs sont conçus comme des tests finaux et bien que la culture monocouche maintienne une petite population de cellules souches, ni l’un ni l’autre ne peut être efficacement divisé et passé après son établissement.
<ol><li>Préparation de milieux et de plaques pour la culture monocouche intestinale<ol>
<li>Préparer le milieu de différenciation organoïde intestinal tel que décrit par le fabricant pour la culture monocouche (voir la liste des matériaux). Ajouter le Y-27632 uniquement à un volume de milieu qui sera utilisé dans un délai de 1 semaine à une concentration finale de 10 μM. S’il n’est pas utilisé immédiatement, conserver à 4 °C.</li>
		<li>Trypsine préchauffée EDTA (0,05 %) à 37 °C.</li>
		<li>Au moins 2 h avant l’ensemencement des cultures monocouches, préparer une solution de revêtement ECM à 2% comme suit.<ol>
<li>Décongeler l’ECM sur la glace et ajouter 1:50 au PBS froid et stérile pour préparer une solution à 2 %. Préparer des quantités suffisantes pour ajouter 100 μL au puits supérieur de chaque insert de membrane de culture cellulaire de 6,5 mm(0,33 cm 2)à utiliser. Ajustez le volume de manière appropriée pour les cultures plus grandes ou plus petites.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Ajouter 100 μL à chaque puits et incuber chaque plaque à 37 °C et 5 % deCO2 jusqu’à ce qu’elle soit nécessaire (au moins 2 h avant l’ensemencement).</li>
	</ol></li>
	<li>Organoïdes intestinaux dissociants pour la génération et la culture de monocouches<ol>
<li>Retirer un nombre approprié de puits de culture organoïde de l’incubateur. Veuillez consulter le tableau 1 pour obtenir le nombre recommandé de puits à récolter pour divers articles de culture.</li>
		<li>Aspirer tout le milieu des cultures organoïdes sans perturber le dôme ECM.</li>
		<li>Ajouter 1 mL de solution de dissociation à chaque puits.</li>
		<li>Incuber à température ambiante (15-25 °C) pendant au moins 1 min.</li>
		<li>À l’aide d’une pipette de 1 mL, pipetter vigoureusement de haut en bas pour perturber le dôme et libérer les organoïdes.</li>
		<li>Regrouper les organoïdes suspendus de chaque puits dans un tube conique de 15 mL. Incuber à température ambiante pendant 10 min avec une agitation douce ou un balancement. Les organoïdes pour l’ensemencement de plusieurs puits peuvent être regroupés à cette étape, jusqu’à 10 mL de volume dans chaque tube.</li>
		<li>Centrifuger à 200 x g pendant 5 min à 4 °C.</li>
		<li>Retirez et jetez le surnageant. Ajouter 5 mL de DMEM/F-12 glacé aux organoïdes de remise en suspension.</li>
		<li>Mélanger et centrifuger à nouveau à 200 x g pendant 5 min à 4 °C.</li>
		<li>Aspirez le surnageant, en enlevant autant que possible, en faisant attention à ne pas déranger le granulé. NOTA : Une partie de l’ECM résiduel peut rester dans la pastille; cependant, cela ne devrait pas affecter de manière significative la dissociation des organoïdes.</li>
		<li>Ajouter 1 mL de trypsine-EDTA préchauffé (37 °C) (0,05 %) aux organoïdes de remise en suspension. Bien mélanger pour assurer une suspension uniforme. Ajoutez jusqu’à 1 mL supplémentaire de Trypsine-EDTA pour un grand nombre de cellules, ou s’il reste une quantité importante d’ECM.</li>
		<li>Incuber à 37 °C pendant 5-10 min.</li>
		<li>Bien mélanger avec une pipette de 1 mL pour perturber autant que possible les organoïdes. Les organoïdes doivent être complètement dissociés en cellules simples ou en petits fragments. S’il reste des fragments plus gros ou des organoïdes entiers après un pipetage approfondi, poursuivre l’incubation avec de la trypsine-EDTA à 37 °C pendant encore 3 à 5 minutes. REMARQUE: Ne pas incuber avec la trypsine-EDTA pendant plus de 20 minutes, car cela peut entraîner une perte accrue de viabilité cellulaire.</li>
		<li>Une fois que les organoïdes sont suffisamment dissociés, ajouter un volume égal de DMEM/F-12 (p. ex. 1 mL de DMEM/F-12 par mL de trypsine-EDTA) et pipeter de haut en bas pour bien mélanger. Désactivez trypsine-EDTA en ajoutant 10% fbs au DMEM/F-12 dans cette étape.</li>
		<li>Fragments de centrifugeuse à 200 x g pendant 5 min à 2-8 °C.</li>
		<li>Si les organoïdes dissociés ne parviennent pas à granuler, ceci est commun et peut être dû à une accumulation de mucus libéré par les cellules dissociées. Dans ce cas, mélangez soigneusement les cellules en les pipetant de haut en bas et centrifugez à nouveau à 200 x g pendant 5 min à 2-8 °C.</li>
		<li>Retirez soigneusement autant de surnageant que possible, en ne laissant que la pastille cellulaire.</li>
		<li>Ressusciter les cellules dans 100 μL de milieu de différenciation organoïde intestinale (avec 10 μM Y-27632) pour chaque puits à ensemencer. Ajustez le volume de manière appropriée pour les puits plus grands ou plus petits.</li>
		<li>Retirez les plaques revêtues de l’incubateur (préparées à l’étape 3.1.4) et retirez l’excès d’ECM de chaque puits.</li>
		<li>Ajouter 100 μL de la suspension cellulaire au puits supérieur de chaque insert de culture cellulaire.</li>
		<li>Ajouter 500 μL de milieu de différenciation organoïde intestinale au puits inférieur de chaque insert de culture cellulaire.</li>
		<li>Incuber à 37 °C et 5 % de CO2.</li>
		<li>Remplacez le milieu dans les puits supérieurs et inférieurs tous les 2 à 3 jours. Les cultures monocouches doivent atteindre la confluence dans les 7 jours et atteignent souvent la confluence dans les 2-3 jours.</li>
	</ol></li>
	<li>Établissement d’une culture d’interface air-liquide (ALI) REMARQUE: Si vous le souhaitez, une différenciation supplémentaire d’une culture monocouche intestinale submergée peut être accomplie en faisant passer la culture monocouche submergée à une culture ALI. Cette méthode de culture permettra une augmentation du nombre de types cellulaires différenciés, en particulier les cellules de la lignée sécrétoire, telles que les cellules gobelines et entéréno-endocrines.<ol>
<li>Établir une culture monocouche dans un insert de culture cellulaire comme décrit ci-dessus aux étapes 2.2.1-2.2.23 et maintenir cette culture à 100% de confluence pendant au moins 4 jours.</li>
		<li>Pour établir une culture ALI, retirez le milieu des puits supérieurs et inférieurs. Ajouter un milieu frais de différenciation organoïde intestinale (avec Y-27632) au puits inférieur, en laissant le puits supérieur vide.</li>
		<li>Incuber à 37 °C et 5 % deCO2.</li>
		<li>Remplacez le milieu dans le puits inférieur tous les 2-3 jours et laissez la monocouche se différencier pendant au moins 1 semaine.</li>
		<li>Rincez bien la partie supérieure avec du PBS stérile pour éliminer l’accumulation excessive de mucus, si nécessaire. Dans ces conditions, la culture ALI peut être maintenue pendant au moins 2-3 semaines.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
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D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+platform+for+stem+cell+niche+co-cultures+and+downstream+gene+expression+analysis.">A high-throughput platform for stem cell niche co-cultures and downstream gene expression analysis.</a> Nature Cell Biology. 17 (3), 340-349 (2015).</li><li>Gunasekara, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+arrayed+colonic+organoids+for+screening+of+secretagogues+associated+with+enterotoxins.">Development of arrayed colonic organoids for screening of secretagogues associated with enterotoxins.</a> Analytical Chemistry. 90 (3), 1941-1950 (2018).</li><li>Shin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+gradient+and+instability+of+Wnt+induce+heterogeneous+growth+and+differentiation+of+human+intestinal+organoids.">Spatiotemporal gradient and instability of Wnt induce heterogeneous growth and differentiation of human intestinal organoids.</a> iScience. 23 (8), 101372 (2020).</li></ol>

G. S., W.C. et S. S. sont des employés de STEMCELL Technologies Ltd., Cambridge (Royaume-Uni). M. S., F. E., S. L., A. E. et R. K.C. sont des employés de STEMCELL Technologies Inc., Vancouver (Canada).

Les modèles organoïdes épithéliaux sont devenus de puissantes plateformes qui peuvent être utilisées pour modéliser l’organisation des tissus, la progression de la maladie et identifier les traitements23,28,29. La microinjection organoïde a ajouté de la valeur à la capacité des organoïdes de modéliser les maladies infectieuses car elle permet l’interaction pathogène avec la face apicale de l’épithélium hôte. Les progrès récents des techniques de microinjection ont optimisé la vitesse d’injection dans les organoïdes et ont atteint un taux allant jusqu’à 90 organoïdes injectés par heure. La fonction barrière dans les organoïdes injectés a été préservée, et la faible concentration en oxygène à l’intérieur de la lumière a permis la survie des bactéries injectées obligatoirement-anaérobies30. Cependant, des études ont noté la présence d’hétérogénéité dans les populations organoïdes au sein d’un même puits. Ces différences ont été observées dans la taille et la forme31,les niveaux d’expression des gènes clés32,ainsi que les taux de prolifération33. Des réponses différentielles au sein d’une même population organoïde à des composés tels que la forskoline et la PGE2, ou à la toxine du choléra, ont également été décrites28,33. Ces résultats soulignent la nécessité d’un nombre élevé d’organoïdes dans les études et limitent l’utilisation de l’injection luminale.
La culture organoïde conventionnelle est basée sur l’encapsulation et la propagation d’organoïdes dans un hydrogel. Cependant, les hydrogels peuvent poser des limites à la diffusion et introduire des gradients de concentration, ce qui peut augmenter l’hétérogénéité34. De plus, une grande variabilité a été documentée, non seulement entre les cultures et les donneurs, mais aussi dans des conditions expérimentales individuelles. La source donneuse, les propriétés biochimiques de l’hydrogel et l’hétérogénéité intrinsèque de l’organoïde en tant que système de culture sont des facteurs importants qui peuvent augmenter la variabilité expérimentale et limiter la reproductibilité des résultats obtenus dans les applications en aval. Les deux méthodes décrites ici fournissent un moyen simple d’exposer la face apicale de l’épithélium, permettant la modélisation de composés et d’agents pathogènes d’intérêt en les ajoutant directement au milieu de culture. La réduction de l’utilisation des hydrogels peut limiter la variabilité expérimentale provenant de sources techniques d’erreur.
Les organoïdes intestinaux apicaux conservent les caractéristiques clés du système de modèle organoïde et leur évolutivité les rend plus sensibles aux tests à haut débit, par rapport à la monocouche 2D. Cependant, comme les organoïdes conservent leur structure 3D, l’accessibilité du côté basal est limitée et peut entraver les études nécessitant un accès simultané aux deux côtés.
Nous avons démontré que l’inversion de polarité des organoïdes intestinaux repose sur l’élimination efficace et absolue de l’ECM, tout en préservant la structure intacte des organoïdes. L’utilisation de la solution de dissociation pour éliminer l’ECM et de la solution anti-adhérente pour empêcher l’adhésion des organoïdes à la vaisselle a contribué à améliorer l’efficacité globale du protocole publié par Co, J. Y. et ses collègues22,en particulier en ce qui concerne le nombre d’organoïdes apicaux produits pour des applications en aval.
En outre, nous avons observé que notre protocole prend en charge une inversion plus efficace des organoïdes inférieurs à 250 μm et que l’utilisation d’organoïdes plus gros peut entraîner une réduction de la production d’organoïdes, en raison de la fragmentation causée par le pipetage. Les pointes à alésage large, telles que celles indiquées dans la table des matériaux,peuvent permettre l’utilisation d’organoïdes plus gros. Cependant, les pointes à alésage large sont moins efficaces dans la dissociation ECM par rapport aux pointes standard en raison de la force mécanique appliquée plus faible. Par conséquent, il peut être nécessaire de répéter les étapes 1.2.9 à 1.2.11 pour perturber suffisamment et éliminer complètement tous les restes du MEC lorsque l’on travaille avec des organoïdes plus gros.
Les organoïdes en suspension peuvent survivre pendant au moins 2 semaines. Après cette période de temps, nous avons observé des changements de morphologie et un plus grand nombre de mort cellulaire. La présence de cellules proliférantes dans les organoïdesapicaux 22 permet le rétablissement de cultures organoïdes intestinales apicales. Ceci peut être réalisé en dissociant les organoïdes apicaux en cellules individuelles et en les intégrant dans l’ECM avec le milieu d’expansion organoïde intestinal.
Une limitation fréquemment rencontrée dans les protocoles décrivant l’établissement d’organoïdes intestinaux dans les cultures en suspension est la génération de grands agrégats. Cela affecte plusieurs variables telles que l’efficacité, la reproductibilité des caractéristiques morphologiques, la perméabilité aux composés et la signalisation paracrine. Semblable au protocole publié par Co, J. Y. et collègues, ici nous confirmons avoir obtenu l’inversion de polarité d’au moins 97% de tous les organoïdes suspendus sans cisaillement après 3 jours en suspension. Cependant, contrairement à la publication, nous avons introduit une étape de dissociation mécanique afin de réduire la formation de grands agrégats et d’augmenter le rendement. Puisque ce procédé peut endommager l’épithélium des organoïdes, nous avons prolongé la période d’incubation d’organoïdes pendant 2 jours supplémentaires pour permettre la récupération complète d’épithélium et assurer des cultures de haute qualité pour des applications en aval. L’introduction d’une agitation constante avec l’utilisation d’un agitateur d’incubateur ou d’une fiole de fileuse pourrait potentiellement réduire les événements de fusion, minimiser la fragmentation et augmenter l’oxygénation. Ces approches alternatives peuvent maintenir les cultures pendant de plus longues durées, réduire la mort cellulaire et permettre une différenciation plus poussée des organoïdes intestinaux apicaux.
L’établissement d’une monocouche 2D dérivée d’organoïdes offre plusieurs avantages et inconvénients par rapport aux organoïdes de polarité inversée. Le protocole décrit ici permet l’établissement rapide d’une culture monocouche confluente, typiquement, en moins de 7 jours et l’option de maintien à long terme des cultures pendant une période prolongée (jusqu’à 10 semaines). Le protocole et les milieux utilisés ici permettent également la différenciation efficace d’un nombre significatif de cellules, que l’on ne retrouve pas toujours dans d’autres cultures monocouches dérivées d’organoïdes16. L’établissement d’une monocouche sur une membrane d’insertion de culture cellulaire permet un accès simultané aux côtés apical et basolatéral de l’épithélium, ce qui les rend idéaux pour les études sur l’intégrité de la barrière et le transport épithélial. Cet accès simplifié les rend également plus susceptibles de faire l’objet d’études sur les infections et le traitement de la toxicomanie. En outre, ces cultures maintiennent bon nombre des caractéristiques propres au donneur, maintenant leur pertinence pour les études spécifiques au patient. La méthode de culture ALI facilite également la différenciation d’un épithélium plus fonctionnel composé de types de cellules sécrétoires et absorbives, ce qui le rend plus représentatif de l’épithélium intestinal humain. La stabilité relative de ces cultures permet également de les maintenir pendant une période prolongée, offrant la possibilité d’études à long terme. Cependant, les limites de cette approche sont le nombre élevé de cellules requises pour établir une monocouche confluente et la nécessité de maintenir une confluence complète pour avoir une séparation fonctionnelle entre les chambres apicales et basolatérales. L’architecture caractéristique de la crypte, qui peut être modélisée dans les cultures organoïdes 3D, est également perdue lors de l’établissement d’une culture monocouche. Néanmoins, le format expérimentalement convivial de la culture et la facilité d’accès aux côtés apicaux et basolatéraux de l’épithélium en font un outil puissant pour l’étude de la physiologie intestinale.

L’épithélium intestinal est le deuxième plus grand épithélium du corps humain et se compose d’une couche cellulaire polarisée qui facilite l’absorption des nutriments et agit comme une barrière contre les insultesenvironnementales 1. Cette distinction entre les côtés apical et basolatéral permet aux cellules de l’épithélium de remplir leurs diverses fonctions. Le compartiment apical est exposé à la lumière et négocie les interactions épithéliales avec les stimuli environnementaux et les micro-organismes, tout en facilitant l’absorption des nutriments. La surface basolatérale abrite des jonctions intercellulaires et des adhérences cellule-matrice, tout en s’interfançant avec des cellules du système immunitaire et d’autres tissus2. Ces jonctions génèrent une monocouche imperméable attachée à la membrane basale, qui agit comme une barrière et fournit les nutriments absorbés au tissu corporel environnant.
La mise en place de systèmes de culture capables de récapituler ces fonctions intestinales in vitro a été difficile3. Les modèles in vitro conventionnels utilisent des lignées cellulaires humaines transformées de cancer colorectal, telles que Caco-2, pour générer des cultures monocouches 2D. Bien qu’ils soient capables de modéliser de multiples fonctions du compartiment absorbant, ces modèles ne peuvent pas récapituler complètement la composition et la fonction intestinales de l’épithélium, ce qui limite les caractéristiques fonctionnelles clés et les applications4,5.
L’émergence d’organoïdes en tant que système de culture 3D avancé généré à partir de cellules souches qui peuvent s’auto-organiser et se différencier de types de cellules spécifiques à un organe, a été une percée dans l’étude in vitro de l’épithélium intestinal6. Les organoïdes intestinaux sont incorporés dans une matrice extracellulaire (ECM) qui ressemble à la lame basale et forment des jonctions cellule-matrice qui permettent à ces cultures de conserver la polarité apicobasale de l’épithélium. Les organoïdes présentent une architecture fermée dans laquelle la face apicale est exposée au compartiment luminal, imitant ainsi la structure de l’intestin. Bien que cette organisation fermée offre la possibilité d’étudier des fonctions spécifiques à l’orientation, elle limite les investigations qui nécessitent l’accès à la face apicale de l’épithélium. Différentes approches ont été adoptées pour surmonter ces limitations en 2D et 3D, y compris la fragmentation organoïde, la microinjection organoïde et la génération de cultures monocouches7. La fragmentation organoïde provoque la perte de l’organisation structurelle et la destruction des jonctions cellulaires, ce qui permet l’exposition de la surface apicale de l’épithélium au milieu. Cette technique tire parti de la capacité de régénération des fragments pour reformer les organoïdes lorsqu’ils sont ensemencés dans une matrice extracellulaire et a été utilisée pour modéliser les interactions entre les maladies infectieuses et l’hôte et l’agent pathogène8,9. Cependant, l’accès simultané à la surface apicale et basique peut également obtenir des réponses non spécifiques à l’infection.
Une approche alternative qui permet l’accès à la surface apicale et préserve à la fois l’architecture structurelle et les jonctions cellulaires est représentée par la microinjection de facteurs dans la lumière des organoïdes. Cette méthode a été largement utilisée pour étudier les interactions hôte-pathogène et modéliser les effets de Cryptosporidium10, H. pylori11et C. difficile12 sur l’épithélium gastro-intestinal in vitro. En utilisant des techniques similaires, le potentiel mutagène de la souche pks+ de E. coli sur l’épithélium intestinal a été déterminé13. Bien qu’efficace, la microinjection organoïde est une tâche laborieuse et inefficace compte tenu du nombre élevé d’organoïdes qui doivent être injectés pour obtenir des effets mesurables et limite donc son application pour les essais à haut débit.
Les progrès récents avec les organoïdes intestinaux ont également fourni des méthodes pour l’établissement de cultures organoïdes monocouches 2D, exposant ainsi leur surface apicale14,15,16,17. Ces monocouches dérivées d’organoïdes récapitulent les principales propriétés in vivo de l’épithélium intestinal. Ils présentent une composition cellulaire physiologiquement pertinente, contenant à la fois des populations de cellules différenciées et des populations de cellules souches et modélisent la diversité à travers l’axe crypte-villosité. Au fur et à mesure que la polarité apicobasale est conservée, les propriétés monocouches inhérentes permettent un accès facile aux côtés apical et basolatéral et les échanges de médias peuvent imiter l’écoulement intestinal et l’élimination des déchets, ce qui permet une culture à long terme. Ces caractéristiques rendent les monocouches dérivées d’organoïdes propices aux études axées sur les interactions luminales et fournissent un modèle supérieur pour l’intégrité et la perméabilité de la barrière épithéliale18,19.
Des études ont montré que la polarité des cellules épithéliales est étroitement régulée par les protéines ECM dans les sphéroïdes MDCK20,21 et récemment dans les organoïdes intestinaux humains22. L’élimination des composants ECM ou l’inhibition du récepteur de l’intégrine qui médie les jonctions cellule-matrice entraîne une inversion de polarité des organoïdes intestinaux et l’exposition de la face apicale de l’épithélium au milieu22. Cette approche a suscité l’intérêt des chercheurs travaillant sur les maladies infectieuses car elle permet un accès facile à la face apicale en 3D et la rend facile à des tests à haut débit. Ici, nous décrivons un protocole modifié basé sur les travaux récents du laboratoire Amieva22, qui facilite la génération d’organoïdes intestinaux 3D qui exposent facilement leur côté apical. Nous décrivons également un protocole qui peut générer efficacement et reproductiblement des monocouches 2D intestinales dérivées d’organoïdes intestinaux.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-Adherence Rinsing Solution</td>
			<td>STEMCELL Technologies Inc.</td>
			<td>7010</td>
			<td>For coating cultureware. Referred as anti-adherent solution into the main text.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes, 15 mL</td>
			<td>STEMCELL Technologies Inc.</td>
			<td>38009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Matrigel Matrix, Growth Factor Reduced (GFR), Phenol Red-Free</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td>Extracellular matrix (ECM) for maintenance and establishment of organoid lines.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar 6.5 mm or 12 mm Transwell inserts</td>
			<td>STEMCELL Technologies Inc.</td>
			<td>38023/38024</td>
			<td>For 2D Monolayer culture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar 24 Well&#160; Flat-Bottom, Tissue culture-treated plate</td>
			<td>STEMCELL Technologies Inc.</td>
			<td>38017</td>
			<td>For maintenance and establishment of organoid lines.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS (Without Ca++ and Mg++)</td>
			<td>STEMCELL Technologies Inc.</td>
			<td>37350</td>
			<td>For washing&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td>Reconstitution of small molecules</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12 with 15 mM HEPES</td>
			<td>STEMCELL Technologies Inc.</td>
			<td>36254</td>
			<td>For washing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentle Cell Dissociation Reagent (GCDR)</td>
			<td>STEMCELL Technologies Inc.</td>
			<td>7174</td>
			<td>For Matrigel removal. Referred as dissociation reagent into the main text.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IntestiCult Organoid Growth Medium (Human)</td>
			<td>STEMCELL Technologies Inc.</td>
			<td>6010</td>
			<td>For expansion of organoid lines prior to differentiation. Referred as Intestinal Organoid Expansion Medium into the main text.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IntestiCult Organoid Differentiation Medium (Human)</td>
			<td>STEMCELL Technologies Inc.</td>
			<td>100-0214</td>
			<td>For establishment of monolayers and 3D differentiation. Referred as Intestinal Organoid Differentiation Medium into the main text.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%)</td>
			<td>STEMCELL Technologies Inc.</td>
			<td>7910</td>
			<td>For 2D Monolayer establishment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>STEMCELL Technologies Inc.</td>
			<td>72302</td>
			<td>RHO/ROCK pathway inhibitor, Inhibits ROCK1 and ROCK2. Used for 2D monolayer establishment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide bore tips</td>
			<td>Corning</td>
			<td>#TF-1005-WB-R-S</td>
			<td>Organoids handling</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culture methods to study apical-specific interactions using intestinal organoid models

La muqueuse de l’épithélium intestinal est constituée d’une simple couche de cellules épithéliales spécialisées qui exposent leur côté apical à la lumière et répondent aux indices externes. L’optimisation récente des conditions de culture in vitro permet la recréation de la niche des cellules souches intestinales et le développement de systèmes de culture avancés en 3 dimensions (3D) qui récapitulent la composition cellulaire et l’organisation de l’épithélium. Les organoïdes intestinaux incorporés dans une matrice extracellulaire (ECM) peuvent être maintenus à long terme et s’auto-organiser pour générer un épithélium bien défini et polarisé qui englobe une lumière interne et un côté basal exposé externe. Cette nature restrictive des organoïdes intestinaux présente des défis dans l’accès à la surface apicale de l’épithélium in vitro et limite l’étude des mécanismes biologiques tels que l’absorption des nutriments et les interactions hôte-microbiote/hôte-pathogène. Ici, nous décrivons deux méthodes qui facilitent l’accès au côté apical de l’épithélium organoïde et soutenons la différenciation des types intestinaux spécifiques de cellules. Tout d’abord, nous montrons comment l’élimination de l’ECM induit une inversion de la polarité des cellules épithéliales et permet la génération d’organoïdes 3D apicaux. Deuxièmement, nous décrivons comment générer des monocouches à 2 dimensions (2D) à partir de suspensions unicellulaires dérivées d’organoïdes intestinaux, composées de types cellulaires matures et différenciés. Ces techniques fournissent de nouveaux outils pour étudier les interactions apicales spécifiques de l’épithélium avec des indices externes in vitro et promouvoir l’utilisation d’organoïdes comme plate-forme pour faciliter la médecine de précision.

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Culture Methods to Study Apical-Specific Interactions using Intestinal Organoid Models

Nous présentons ici deux protocoles qui permettent la modélisation des interactions apicales-spécifiques intestinales. Les monocouches intestinales organoïdes-dérivées et les cultures d’interface air-liquide (ALI) facilitent la génération d’épithélium bien différencié accessible des côtés luminal et basolatéral, tandis que les organoïdes intestinaux inversés à polarité exposent leur côté apical et se présentent à des analyses à haut débit.

Méthodes de culture pour étudier les interactions spécifiques aux apicales à l’aide de modèles organoïdes intestinaux

The lining of the gut epithelium is made up of a simple layer of specialized epithelial cells that expose their apical side to the lumen and respond to ...

Ces études visent à fournir des systèmes modèles robustes et reproductibles pour effectuer des études spécifiques à l’orientation de l’épithélium intestinal. Les organoïdes apicaux peuvent être générés en grand nombre et sont prometteurs pour le criblage à haut débit. Les monocouches sont plus faciles à manipuler et offrent un accès aux signes apicaux et basaux.Assurez-vous que la taille des organoïdes est de 150 à 250 micromètres de diamètre avant de commencer le protocole d’inversion. Retirez et jetez soigneusement le milieu de chaque puits contenant des organoïdes sans perturber le dôme ECM. Ajouter un millilitre de solution de dissociation glacée à chaque puits et incuber la plaque à température ambiante pendant une minute.Délogez soigneusement les dômes en pipetant lentement avec une pointe enduite, en prenant soin de ne pas perturber et fragmenter les organoïdes. Transférer la suspension organoïde sur une plaque traitée avec une solution anti-adhérence et placer la plaque sur un agitateur à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes. Après 30 minutes, retirez la plaque et pipettez doucement la solution de haut en bas à l’aide d’une pointe de pipette d’un millilitre recouverte d’une solution anti-adhérence.Placez la plaque sur le shaker à quatre degrés Celsius pendant encore 30 minutes. Retirer la plaque et laisser les organoïdes se déposer par gravité pendant une à deux minutes à température ambiante. Une fois les organoïdes installés, retirez autant que possible la solution de dissociation et lavez-les en ajoutant 1,5 millilitres de DMEM F-12.Laisser les organoïdes sédimenter et éliminer le surnageant. Répétez ensuite le lavage. Retirez autant que possible le DMEM F-12 et ajoutez 0,5 millilitres de milieu d’expansion organoïde intestinal.Incuber pendant la nuit à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Le lendemain effectuer un changement partiel de milieu en inclinant la plaque à un angle de 25 à 30 degrés et en enlevant le milieu le long de la paroi du puits en prenant soin de ne pas éliminer les organoïdes en suspension. Ajouter 0,4 millilitres de milieu d’expansion organoïde intestinale et incuber à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant trois jours.Si des granulats se sont formés, utilisez une pointe de pipette d’un millilitre recouverte d’une solution anti-adhérente pour ciselé les granulats en pipetant 20 fois de haut en bas tout en appuyant sur l’extrémité de la pointe au fond de la plaque. Ajouter un millilitre de Trypsine-EDTA préchauffé à 0,05 % pour ressusciter les organoïdes. Et bien mélanger pour assurer une suspension uniforme.Ajoutez jusqu’à un millilitre supplémentaire de Trypsine-EDTA pour un grand nombre de cellules, ou s’il reste une quantité importante d’ECM. Incuber à 37 degrés Celsius pendant cinq à 10 minutes, puis bien mélanger avec une pipette d’un millilitre pour perturber les organoïdes afin qu’ils soient complètement dissociés en cellules simples ou petits fragments. Pour dissocier complètement des fragments ou des organoïdes entiers, poursuivez l’incubation avec la trypsine-EDTA à 37 degrés Celsius pendant encore trois à cinq minutes.Une fois que les organoïdes sont suffisamment dissociés, ajoutez un volume égal de DMEM F-12 et pipettez de haut en bas pour bien mélanger. Inactivez la Trypsine-EDTA en ajoutant 10% FBS aux cellules. Fragments de centrifugeuse à 200 fois G pendant cinq minutes à deux à huit degrés Celsius.Si les organoïdes dissociés n’ont pas réussi à granuler les cellules, mélangez soigneusement les cellules en les pipetant de haut en bas et en les centrifugant à nouveau. Retirez soigneusement autant de surnageant que possible. ne laissant que la pastille cellulaire.Ressusciter les cellules dans 100 microlitres de milieu de différenciation organoïde intestinal pour chaque puits à ensemencer. Ajuster le volume de manière appropriée pour les tailles de puits plus grandes ou plus petites. Retirez les plaques revêtues de l’incubateur et retirez l’excès de solution de matrice de membrane de sous-sol de chaque puits.Ajouter 100 microlitres de la suspension cellulaire au puits supérieur de chaque insert de culture cellulaire et 500 microlitres du milieu organoïde intestinal au puits inférieur. Incuber ensuite à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Remplacez le milieu dans les puits supérieurs et inférieurs tous les deux ou trois jours.Pour établir une culture ALI, enlever le milieu des puits supérieurs et inférieurs, et ajouter un milieu de différenciation organoïde intestinal frais au puits inférieur en laissant le puits supérieur vide. Les organoids intestinaux cultivés avec le milieu intestinal d’expansion organoïde ont montré une morphologie cystique. Lorsque l’ECM est éliminé, certains organoïdes ont tendance à s’agréger au cours des trois premiers jours et doivent être purs pour augmenter le nombre d’organoïdes.Les organoïdes intestinaux cultivés dans l’ECM ont continué à se développer et à montrer la formation spontanée des structures de bourgeonnement secondaires. Organoids maintenu pendant cinq jours en l’absence de la matrice extracellulaire a montré les formes allongées, cystiques, et irrégulières. L’expression des marqueurs atypiques, tels que le villin et le ZO-1 a été détectée le côté externe de l’épithélium qui a été exposé au milieu.L’ECM a incorporé des organoids souillés pour des noyaux, villin, et ZO-1 démontrant une polarité basale apicale où le côté apical faisait face au lumen de l’organoid. Une fois que la monocouche a été établie, les cellules ont formé des jonctions serrées et une couche confluente. La couche confluente oriente également sa bordure de brosse contenant de la villine vers la face apicale de l’épithélium, formant des complexes multiprotéiques ZO-1 entre les cellules.La transition vers une culture d’ALI a induit une différenciation supplémentaire avec des cellules de gobelet plus proéminentes qui ont été visualisées par coloration pour la protéine de mucine sécrétée MUC2 Pour induire l’inversion de polarité, il est crucial d’éliminer tout l’ECM sans perturber ou fragmenter les organoïdes. Les changements de support doivent également être effectués avec soin afin d’éviter d’éliminer l’un des organoïdes suspendus. S’assurer qu’il y a suffisamment de cellules individuelles pour l’établissement de la culture monocouche est un déterminant majeur de sa qualité.Les fonctions spécifiques à l’apicale telles que l’absorption des nutriments ou les interactions avec les agents pathogènes de l’hôte peuvent maintenant être étudiées dans des systèmes pertinents qui répondent aux besoins des chercheurs.

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