Name: culture methods to study apical-specific interactions using intestinal organoid models
Uploaded: 2021-03-23T14:30:00
Duration: 7 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culture Methods to Study Apical-Specific Interactions using Intestinal Organoid Models at JoVE.com

מחקר זה מומן על ידי מענק Horizon 2020 OrganoVIR 812673 על פרויקט Organoids לחקר וירוסים - תוכנית אימון-ITN חדשנית.

נגזרת של תרביות אורגנויד מעיים אנושיות בוצעה כמתואר במקום אחר23. Organoids נשמרו בתרבות כפי שתואר על ידי גיליון מידע המוצר (PIS) עבור מדיום הרחבת אורגנויד מעיים (עיין בטבלת החומרים).
1. היפוך של קוטביות אורגנויד מעיים
הערה: סעיף זה יתווה את הפרוטוקול להיפוך הקוטביות של אורגנוידים מעיים תלת-ממדיים. פרוטוקול זה מספק הליך מפורט להקמת organoids מקוטב עם משטח apical חשוף בהשעיה בצלחת תרבות. פרוטוקול זה נועד כניסיון נקודת קצה, אם כי האורגנוידים יכולים להישמר בקונפורמציה זו במשך למעלה משבועיים ולשמור על אוכלוסיית תאי גזע קטנה המאפשרת להם להקים מחדש organoids apical-in עם המעבר.
<ol><li>ציפוי כלי תרבות וצינורות עם פתרון אנטי דבק הערה: כדי למקסם את מספר organoids מעיים apical-out ולמנוע התקשרות בלתי רצויה לכלי התרבות, precoating של כלי תרבות נדרש בדרך כלל. הסעיף המתואר להלן מתאר את ציפוי התרבות וכלי הפלסטיק עם פתרון אנטי דבק.<ol>
<li>צלחות תרבות מעיל לשימוש בחלק ההשעיה של הפרוטוקול כדלקמן.<ol>
<li>הוסף 0.5 מ"ל של פתרון אנטי דבק לכל באר של צלחת תרבית רקמות 24-well.</li>
			<li>מערבבים את הצלחת כדי להפיץ את הפתרון באופן שווה על פני השטח ואת קירות בארות.</li>
			<li>צנטריפוגה את הצלחת ב 1,300 x g במשך 10 דקות.</li>
			<li>הסר פתרון אנטי דבק מכל באר באמצעות שאיפה או פיפטה 1 מ"ל.</li>
			<li>לשטוף את בארות עם 1 מ"ל של DMEM / F-12 עם 15mM HEPES (DMEM / F12).</li>
			<li>מלא כל שטף היטב עם 0.5 מ"ל של DMEM / F-12 ולאחסן את הצלחת ב 37 °C (5% CO2 עד השימוש. הערה: אם לא נעשה שימוש מיידי, ניתן לשמור את הצלחות המצוות באינקובטור למשך שבוע לפחות.</li>
		</ol>
</li>
		<li>מעיל 15 mL צינורות חרוט המשמשים בפרוטוקול זה כדלקמן.<ol>
<li>הוסף 4 מ"ל של פתרון אנטי דבק לצינור חרוט 15 מ"ל.</li>
			<li>מערבבים את הצינור כדי להפיץ את הפתרון באופן שווה על פני השטח של הקירות.</li>
			<li>צנטריפוגה הצינור ב 1,300 x g במשך 10 דקות.</li>
			<li>הסר את הפתרון האנטי דבק מהצינור.</li>
			<li>לשטוף את הצינור 1x עם 5 מ"ל של DMEM / F-12 ולשאף DMEM / F-12. הצינורות מוכנים כעת לשימוש. הערה: אם לא נעשה שימוש מיידי, להוסיף 5 מ"ל של DMEM / F12 ולאחסן ב 4 °C (70 °F). צינורות מצופים ניתן לשמור על 4 °C (55 °F) לפחות שבוע.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>היפוך קוטביות של organoids מעיים על ידי תרבות השעיה הערה: השלבים שלהלן מתארים את ההיפוך של organoids מעיים בעבר תרובו תחת תנאי כיפת ECM סטנדרטיים. ההליכים המתוארים כאן הם עבור באר אחת של צלחת 24-well. אם אתה משתמש בכלי תרבות אחרים, התאם את עוצמת הקול בהתאם.<ol>
<li>הסר בזהירות והשלך את המדיום מכל באר המכילה organoids מבלי לשבש את כיפת מטריצה חוץ תאית קרום המרתף. ודא כי גודל האורגנוידים הוא בקוטר 150-250 מיקרומטר (בדרך כלל ביום 3-5) לפני תחילת פרוטוקול ההיפוך.</li>
		<li>הוסיפו 1 מ"ל של תמיסת דיסוציאציה קרה כקרח בכל באר.</li>
		<li>דגירה בטמפרטורת החדר (15-25 מעלות צלזיוס) למשך דקה אחת.</li>
		<li>הוסף לפחות 2 מ"ל של פתרון אנטי דבק לצינור 15 מ"ל שישמש לציפוי טיפים מפלסטיק.</li>
		<li>הוסף לפחות 2 מ"ל של DMEM / F-12 לצינור 15 מ"ל שישמש לשטיפת טיפים מפלסטיק שטופים בתמיסה אנטי דבקה.</li>
		<li>יש לכסות קצה פיפטה של 1 מ"ל עם פתרון אנטי-דבק, תוך צנרת של 1 מ"ל של פתרון שלוש פעמים לתוך הצינור עם פתרון אנטי דבקות מהשלב 1.2.4.</li>
		<li>לשטוף את הקצה DMEM קר / F-12, צינור 1 מ"ל של פתרון שלוש פעמים לתוך הצינור עם DMEM / F-12 מהשלב 1.2.5.</li>
		<li>בעזרת הקצה המצוי, יש לפנות בזהירות את הכיפות על ידי צנרת איטית. יש להקפיד לא לשבש או לפצל את האורגנוידים.</li>
		<li>מעבירים את ההשעיה האורגנוידית לצלחת שטופלה בתמיסה אנטי-דבקה (החל מהשלב 1.1.1).</li>
		<li>מניחים את הצלחת על שייקר ב 4 °C (55 °F) במשך 30 דקות. ניתן להשתמש בשייקר ג'ירו ב-70 סל"ד. הערה: הימנע רועד קשה, כגון מערבולת המדגם, כפי שהוא יכול לגרום פיצול organoid. היווצרות של בועות קצף יכול להצביע על רעידות קשות.</li>
		<li>לאחר 30 דקות, להסיר את הצלחת. בעזרת קצה פיפטה של 1 מ"ל מצופה בתמיסה אנטי-דבקה, מעבירים בעדינות את הפתרון למעלה ולמטה.</li>
		<li>מניחים את הצלחת על שייקר ב 4 °C (5 °F) במשך 15 דקות. ניתן להשתמש בשייקר ג'ירו ב-70 סל"ד.</li>
		<li>מוציאים את הצלחת ומניחים לאורגנואידים להתיישב בכוח המשיכה (1-2 דקות בטמפרטורת החדר). שים לב ללוח מתחת למיקרוסקופ כדי לאמת משקעים אורגנויד. הערה: הימנע תסיסה נרחבת של הצלחת כפי שהוא יכול לגרום organoids מיושב resuspend.</li>
		<li>לאחר organoids להתיישב, להסיר כמה שיותר של פתרון דיסוציאציה ככל האפשר לשטוף על ידי הוספת 1.5 מ"ל של DMEM / F-12.</li>
		<li>אפשר לאורגנוידים משקעים ולהסיר כמה שיותר מהסופר-טבעיים ככל האפשר. חזור על שלב הכביסה פעם נוספת. הערה: שים לב ללוח שמתחת למיקרוסקופ כדי לאמת משקעים אורגנויד לפני ביצוע כל שלב כביסה.</li>
		<li>הסר כמה שיותר DMEM / F-12 ככל האפשר ולהוסיף 0.5 מ"ל של מדיום הרחבת אורגנויד מעיים. דגירה ב 37 °C (5°F) ו 5% CO2.</li>
		<li>למחרת, בצע שינוי בינוני חלקי על ידי הטיית הצלחת בזווית של 25 עד 30 מעלות, והסרת בינוני לאורך קיר הבאר. הסר 0.4 מ"ל של בינוני דואג לא להסיר organoids מושעה.</li>
		<li>יש להוסיף מדיום להרחבת אורגנויד מעיים 0.4 מ"ל. דגירה ב 37 °C (5°F) ו 5% CO2 במשך 3 ימים. הערה: לאחר 3 ימים, רוב organoids צריך להיות קוטביות apical-out, אבל אגרגטים גדולים עשויים להיווצר.</li>
		<li>אם נוצרו אגרגטים, השתמש בפיפטה של 1 מ"ל עם קצה מצופה בתמיסה אנטי-דבקה (כמתואר בשלבים 1.2.6 ו- 1.2.7) כדי להטות את האגרגטים על ידי צנרת למעלה ולמטה 20 פעמים תוך לחיצה על קצה הקצה לתחתית הצלחת.</li>
		<li>מניחים את הצלחת על 37 °C (5% CO2 ולבצע שינוי בינוני מלא למחרת עם מדיום הרחבת אורגנויד מעיים (כמתואר בסעיף 1.2.17).</li>
		<li>לאחר יומיים (יום 5 בהשעיה), אורגנוידים במעיים apical-out ניתן להשתמש בבדיונים במורד הזרם.</li>
	</ol></li>
</ol>2. הקמת תאי מעיים 2D monolayer וממשק נוזלי אוויר (ALI) תרביות נגזר אורגנוידים מעיים 3D
הערה: סעיף זה יתווה את הפרוטוקול ליצירת תרביות מונו-שכבתיות דו-שכבתיות מאורגנואידים במעיים. טכניקה זו מספקת את היתרון של הקמת תרבות מונו-שכבתית מקוטבת ומקוטבת עם משטח אפי חשוף בלוח תרבית רקמות המכילה קרום התא. למרות monolayer יתחיל להבדיל בפורמט שקוע, monolayer, הבחנה נוספת של monolayer ניתן להשיג על ידי מעבר לתרבות ALI לאחר שהגיע למפגש. הן ה- monolayer והן פרוטוקולי ALI הבאים נועדו כבוחות נקודת קצה ולמרות שתרבות המונו-שכבתית שומרת על אוכלוסיית תאי גזע קטנה, לא ניתן לפצל ולהעביר אותה ביעילות לאחר הקמתה.
<ol><li>הכנת מדיה וצלחות לתרבות חד-שכבתית במעיים<ol>
<li>הכן מדיום בידול אורגנויד מעייםכפי שמתואר על ידי היצרן לתרבות monolayer (ראה רשימת חומרים ). הוסף Y-27632 רק לנפח של מדיום שישמש בתוך שבוע אחד בריכוז סופי של 10 מיקרומטר. אם לא נעשה שימוש מיידי, יש לאחסן ב-4 °C (70 °F).</li>
		<li>טריפסין EDTA לפני חם (0.05%) עד 37 °C (50 °F).</li>
		<li>לפחות 2 שעות לפני זריעת תרבויות מונו-שכבתיות, הכינו פתרון ציפוי ECM 2% כדלקמן.<ol>
<li>הפשירו ECM על הקרח והוסיפו 1:50 ל-PBS קר וסטרילי כדי להכין פתרון של 2%. הכן כמויות מספיקות כדי להוסיף 100 μL לבאר העליונה של כל 6.5 מ"מ (0.33 ס"מ2) קרום התא להוסיף לשימוש. כוונן את עוצמת הקול בהתאם לתרבויות גדולות או קטנות יותר.</li>
		</ol>
</li>
		<li>מוסיפים 100 μL לכל באר ודגרה כל צלחת ב 37 °C ו 5% CO2 עד הצורך (לפחות 2 שעות לפני זריעה).</li>
	</ol></li>
	<li>פירוק אורגנוידים במעיים לדור ולתרבות של מונו-שכבתיות<ol>
<li>הסר מספר מתאים של בארות תרבות organoid מן האינקובטור. עיין בטבלה 1 לקבלת המספר המומלץ של בארות לקצור עבור כלי תרבות שונים.</li>
		<li>שאפו את כל המדיום מתרבויות האורגנויד מבלי להפריע לכיפת ECM.</li>
		<li>הוסף 1 מ"ל של פתרון דיסוציאציה לכל באר.</li>
		<li>דגירה בטמפרטורת החדר (15-25 מעלות צלזיוס) למשך דקה אחת לפחות.</li>
		<li>באמצעות פיפטה של 1 מ"ל, פיפטה נמרצת למעלה ולמטה כדי לשבש את הכיפה ולשחרר את האורגנוידים.</li>
		<li>יש לאסוף את האורגנוידים התלויים מכל באר בצינור חרוט של 15 מ"ל. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות עם עצבנות עדינה או נדנדה. Organoids עבור זריעת בארות מרובות ניתן לאגד בשלב זה, עד 10 מ"ל נפח בכל צינור.</li>
		<li>צנטריפוגה ב 200 x g במשך 5 דקות ב 4 °C (5 °F).</li>
		<li>הסר והשלך את supernatant. יש להוסיף 5 מ"ל DMEM/F-12 קר כקרח לאורגנואידים.</li>
		<li>מערבבים וצנטריפוגה שוב ב 200 x גרם במשך 5 דקות ב 4 °C (70 °F).</li>
		<li>לשאוף supernatant, הסרת ככל האפשר, נזהר לא להפריע לכדור. הערה: חלק מה- ECM שיורית עשוי להישאר בכדור; עם זאת, זה לא אמור להשפיע באופן משמעותי על ניתוק האורגנוידים.</li>
		<li>הוסף 1 מ"ל של טריפסין-EDTA מחומם מראש (37 °C) (0.05%) כדי resuspend organoids. יש לערבב היטב כדי להבטיח השעיה אחידה. הוסף עד 1 מ"ל נוספים של טריפסין-EDTA עבור מספר רב של תאים, או אם כמות משמעותית של ECM נשאר.</li>
		<li>דגירה ב 37 °C (5-10 דקות).</li>
		<li>מערבבים היטב עם פיפטה של 1 מ"ל כדי לשבש את האורגנוידים ככל האפשר. אורגנואידים צריכים להיות מנותקים לחלוטין לתאים בודדים או שברים קטנים. אם שברים גדולים יותר או organoids שלם להישאר לאחר pipetting ביסודיות, להמשיך את הדגירה עם טריפסין-EDTA ב 37 °C (5 דקות נוספות). הערה: אין לדגור עם טריפסין-EDTA במשך יותר מ -20 דקות, שכן הדבר עלול לגרום לאובדן מוגבר של הכדאיות התאית.</li>
		<li>לאחר organoids הם מנותקים מספיק, להוסיף נפח שווה של DMEM / F-12 (למשל, 1 מ"ל DMEM / F-12 לכל mL טריפסין-EDTA) ו pipette למעלה ולמטה לערבב ביסודיות. לאפעיל טריפסין-EDTA על-ידי הוספת 10% FBS ל- DMEM/F-12 בשלב זה.</li>
		<li>שברי צנטריפוגה ב 200 x g במשך 5 דקות ב 2-8 °C (7 °F).</li>
		<li>אם organoids מנותק להיכשל גלולה, זה נפוץ יכול להיות בגלל הצטברות של ריר שוחרר על ידי התאים מנותקים. במקרה זה, לערבב את התאים ביסודיות על ידי צנרת למעלה ולמטה צנטריפוגה אותם שוב ב 200 x g במשך 5 דקות ב 2-8 °C (8 °F).</li>
		<li>הסר בזהירות כמה שיותר supernatant ככל האפשר, משאיר רק את גלולה התא.</li>
		<li>Resuspend התאים 100 μL של מדיום בידול אורגנויד מעיים (עם 10 μM Y-27632) עבור כל באר להיות זרע. התאם את עוצמת הקול בהתאם לגדלי באר גדולים או קטנים יותר.</li>
		<li>הסר את הצלחות מצופות מן האינקובטור (מוכן בשלב 3.1.4) ולהסיר את עודף ECM מכל באר.</li>
		<li>הוסף 100 μL של השעיית התא לבאר העליונה של כל הוספה של תרבית תא.</li>
		<li>הוסף 500 μL של מדיום בידול אורגנויד מעיים לבאר התחתונה של כל תוספת תרבית תא.</li>
		<li>דגירה ב 37 °C (7 °F) ו 5% CO2.</li>
		<li>החלף את המדיום הן בבאר העליונה והן בבאר התחתונה כל 2 עד 3 ימים. תרבויות Monolayer צריך להגיע למפגש בתוך 7 ימים ולעתים קרובות יגיע למפגש בתוך 2-3 ימים.</li>
	</ol></li>
	<li>הקמת תרבות ממשק אוויר נוזלי (ALI) הערה: אם תרצה, ניתן לבצע הבחנה נוספת של תרבות מונו-שכבתית מעיים שקועה על ידי מעבר תרבות המונו-שכבתית השקועה לתרבות ALI. שיטת תרבית זו תאפשר עלייה במספר סוגי התאים המובחנים, במיוחד תאים של שושלת הפרשה, כגון תאים בגבל ואנטרונדוקריני.<ol>
<li>קבעו תרבות של שכבות תאים בתרבית תאים כמתואר לעיל בשלבים 2.2.1-2.2.23 ושמירה על תרבות זו ב-100% השפעה למשך 4 ימים לפחות.</li>
		<li>כדי ליצור תרבות ALI, הסר בינוני מהבאר העליונה והתחתון. הוסף מדיום בידול אורגנויד מעיים טרי (עם Y-27632) לבאר התחתונה, משאיר את הבאר העליונה ריקה.</li>
		<li>דגירה ב 37 °C (5°F) ו 5% CO2.</li>
		<li>החלף את המדיום בבאר התחתונה כל 2-3 ימים ואפשר למונולייר להבדיל לפחות שבוע אחד.</li>
		<li>יש לשטוף את הבאר העליונה עם PBS סטרילי כדי להסיר הצטברות ריר עודפת, במידת הצורך. בתנאים אלה, תרבות ALI ניתן לשמור על לפחות 2-3 שבועות.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>Gehart, H., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tales+from+the+crypt:+new+insights+into+intestinal+stem+cells.">Tales from the crypt: new insights into intestinal stem cells.</a> Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology. 16 (1), 19-34 (2019).</li><li>Schneeberger, K., Roth, S., Nieuwenhuis, E. E. S., Middendorp, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+epithelial+cell+polarity+defects+in+disease:+lessons+from+microvillus+inclusion+disease.">Intestinal epithelial cell polarity defects in disease: lessons from microvillus inclusion disease.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 11 (2), (2018).</li><li>Klunder, L. J., Faber, K. N., Dijkstra, G., Van Ijzendoorn, S. C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+cell+polarity+-+Controlled+epithelial+homeostasis+and+immunity+in+the+intestine.">Mechanisms of cell polarity - Controlled epithelial homeostasis and immunity in the intestine.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (7), 0227888 (2017).</li><li>DiMarco, R. L., Hunt, D. R., Dewi, R. E., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+paracellular+transport+in+the+Caco-2+drug+screening+model+using+protein-engineered+substrates.">Improvement of paracellular transport in the Caco-2 drug screening model using protein-engineered substrates.</a> Biomaterials. 129, 152-162 (2017).</li><li>Sun, H., Chow, E. C., Liu, S., Du, Y., Pang, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Caco-2+cell+monolayer:+usefulness+and+limitations.">The Caco-2 cell monolayer: usefulness and limitations.</a> Expert Opinion on Drug Metabolism &amp; Toxicology. 4 (4), 395-411 (2008).</li><li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+development+and+disease+with+organoids.">Modeling development and disease with organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li><li>Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+modeling+in+stem+cell-derived+3D+organoid+systems.">Disease modeling in stem cell-derived 3D organoid systems.</a> Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).</li><li>Zhang, Y. -. G., Wu, S., Xia, Y., Sun, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella-infected+crypt-derived+intestinal+organoid+culture+system+for+host-bacterial+interactions.">Salmonella-infected crypt-derived intestinal organoid culture system for host-bacterial interactions.</a> Physiological Reports. 2 (9), 12147 (2014).</li><li>Nigro, G., Rossi, R., Commere, P. -. H., Jay, P., Sansonetti, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cytosolic+bacterial+peptidoglycan+sensor+Nod2+affords+stem+cell+protection+and+links+microbes+to+gut+epithelial+regeneration.">The cytosolic bacterial peptidoglycan sensor Nod2 affords stem cell protection and links microbes to gut epithelial regeneration.</a> Cell Host &amp; Microbe. 15 (6), 792-798 (2014).</li><li>Heo, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+Cryptosporidium+infection+in+human+small+intestinal+and+lung+organoids.">Modelling Cryptosporidium infection in human small intestinal and lung organoids.</a> Nature Microbiology. 3 (7), 814-823 (2018).</li><li>Bartfeld, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+expansion+of+human+gastric+epithelial+stem+cells+and+their+responses+to+bacterial+infection.">In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection.</a> Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).</li><li>Leslie, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistence+and+toxin+production+by+Clostridium+difficile+within+human+intestinal+organoids+result+in+disruption+of+epithelial+paracellular+barrier+function.">Persistence and toxin production by Clostridium difficile within human intestinal organoids result in disruption of epithelial paracellular barrier function.</a> Infection and Immunity. 83 (1), 138-145 (2015).</li><li>Pleguezuelos-Manzano, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutational+signature+in+colorectal+cancer+caused+by+genotoxic+pks(+)+E.+coli.">Mutational signature in colorectal cancer caused by genotoxic pks(+) E. coli.</a> Nature. 580 (7802), 269-273 (2020).</li><li>Fernando, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple,+cost-effective+method+for+generating+murine+colonic+3D+enteroids+and+2D+monolayers+for+studies+of+primary+epithelial+cell+function.+American+journal+of+physiology.">A simple, cost-effective method for generating murine colonic 3D enteroids and 2D monolayers for studies of primary epithelial cell function. American journal of physiology.</a> Gastrointestinal and Liver Physiology. 313 (5), 467-475 (2017).</li><li>Moon, C., VanDussen, K. L., Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+primary+mouse+intestinal+epithelial+cell+monolayer+culture+system+to+evaluate+factors+that+modulate+IgA+transcytosis.">Development of a primary mouse intestinal epithelial cell monolayer culture system to evaluate factors that modulate IgA transcytosis.</a> Mucosal Immunology. 7 (4), 818-828 (2014).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+culture+captures+injury-repair+cycles+of+colonic+stem+cells.">Long-term culture captures injury-repair cycles of colonic stem cells.</a> Cell. 179 (5), 1144-1159 (2019).</li><li>Noel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+primary+human+macrophage-enteroid+co-culture+model+to+investigate+mucosal+gut+physiology+and+host-pathogen+interactions.">A primary human macrophage-enteroid co-culture model to investigate mucosal gut physiology and host-pathogen interactions.</a> Scientific Reports. 7, 45270 (2017).</li><li>VanDussen, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+enhanced+human+gastrointestinal+epithelial+culture+system+to+facilitate+patient-based+assays.">Development of an enhanced human gastrointestinal epithelial culture system to facilitate patient-based assays.</a> Gut. 64 (6), 911-920 (2015).</li><li>Thorne, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteroid+monolayers+reveal+an+autonomous+WNT+and+BMP+circuit+controlling+intestinal+epithelial+growth+and+organization.">Enteroid monolayers reveal an autonomous WNT and BMP circuit controlling intestinal epithelial growth and organization.</a> Developmental Cell. 44 (5), 624-633 (2018).</li><li>Wang, A. Z., Ojakian, G. K., Nelson, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Steps+in+the+morphogenesis+of+a+polarized+epithelium:+I.+Uncoupling+the+roles+of+cell-cell+and+cell-substratum+contact+in+establishing+plasma+membrane+polarity+in+multicellular+epithelial+(MDCK)+cysts.">Steps in the morphogenesis of a polarized epithelium: I. Uncoupling the roles of cell-cell and cell-substratum contact in establishing plasma membrane polarity in multicellular epithelial (MDCK) cysts.</a> Journal of Cell Science. 95 (1), 137-151 (1990).</li><li>Wang, A. Z., Ojakian, G. K., Nelson, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Steps+in+the+morphogenesis+of+a+polarized+epithelium:+II.+Disassembly+and+assembly+of+plasma+membrane+domains+during+reversal+of+epithelial+cell+polarity+in+multicellular+epithelial+(MDCK)+cysts.">Steps in the morphogenesis of a polarized epithelium: II. Disassembly and assembly of plasma membrane domains during reversal of epithelial cell polarity in multicellular epithelial (MDCK) cysts.</a> Journal of Cell Science. 95 (1), 153-165 (1990).</li><li>Co, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+epithelial+polarity:+a+human+enteroid+model+for+host-pathogen+interactions.">Controlling epithelial polarity: a human enteroid model for host-pathogen interactions.</a> Cell Reports. 26 (9), 2509-2520 (2019).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett's+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li><li>Dodt, H. -. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultramicroscopy:+three-dimensional+visualization+of+neuronal+networks+in+the+whole+mouse+brain.">Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain.</a> Nature Methods. 4 (4), 331-336 (2007).</li><li>Fujii, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+intestinal+organoids+maintain+self-renewal+capacity+and+cellular+diversity+in+niche-inspired+culture+condition.">Human intestinal organoids maintain self-renewal capacity and cellular diversity in niche-inspired culture condition.</a> Cell Stem Cell. 23 (6), 787-793 (2018).</li><li>Crowley, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+restriction+of+Salmonella+Typhimurium+requires+caspase-1+and+caspase-11+epithelial+intrinsic+inflammasomes.">Intestinal restriction of Salmonella Typhimurium requires caspase-1 and caspase-11 epithelial intrinsic inflammasomes.</a> PLoS Pathogens. 16 (4), 1008498 (2020).</li><li>Rees, W. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteroids+derived+from+inflammatory+bowel+disease+patients+display+dysregulated+endoplasmic+reticulum+stress+pathways,+leading+to+differential+inflammatory+responses+and+dendritic+cell+maturation.">Enteroids derived from inflammatory bowel disease patients display dysregulated endoplasmic reticulum stress pathways, leading to differential inflammatory responses and dendritic cell maturation.</a> Journal of Crohn's &amp; Colitis. 14 (7), 948-961 (2020).</li><li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+CFTR+assay+using+primary+cystic+fibrosis+intestinal+organoids.">A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids.</a> Nature Medicine. 19 (7), 939-945 (2013).</li><li>Almeqdadi, M., Mana, M. D., Roper, J., Yilmaz, &. #. 2. 1. 4. ;. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut+organoids:+mini-tissues+in+culture+to+study+intestinal+physiology+and+disease.">Gut organoids: mini-tissues in culture to study intestinal physiology and disease.</a> American Journal of Physiology. Cell Physiology. 317 (3), 405-419 (2019).</li><li>Williamson, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+organoid+microinjection+platform+to+study+gastrointestinal+microbiota+and+luminal+physiology.">A high-throughput organoid microinjection platform to study gastrointestinal microbiota and luminal physiology.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 6 (3), 301-319 (2018).</li><li>Kassis, T., Hernandez-Gordillo, V., Langer, R., Griffith, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OrgaQuant:+human+intestinal+organoid+localization+and+quantification+using+deep+convolutional+neural+networks.">OrgaQuant: human intestinal organoid localization and quantification using deep convolutional neural networks.</a> Scientific Reports. 9 (1), 12479 (2019).</li><li>Gracz, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+platform+for+stem+cell+niche+co-cultures+and+downstream+gene+expression+analysis.">A high-throughput platform for stem cell niche co-cultures and downstream gene expression analysis.</a> Nature Cell Biology. 17 (3), 340-349 (2015).</li><li>Gunasekara, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+arrayed+colonic+organoids+for+screening+of+secretagogues+associated+with+enterotoxins.">Development of arrayed colonic organoids for screening of secretagogues associated with enterotoxins.</a> Analytical Chemistry. 90 (3), 1941-1950 (2018).</li><li>Shin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+gradient+and+instability+of+Wnt+induce+heterogeneous+growth+and+differentiation+of+human+intestinal+organoids.">Spatiotemporal gradient and instability of Wnt induce heterogeneous growth and differentiation of human intestinal organoids.</a> iScience. 23 (8), 101372 (2020).</li></ol>

G. S., W.C., ו S. S. הם עובדים של STEMCELL טכנולוגיות בע"מ, קיימברידג '(בריטניה). מ.ס., פ. א', ש.ל., א.א. ור.ק.C הם עובדי STEMCELL Technologies Inc. , ונקובר (קנדה).

מודלים organoid אפיתל הפכו פלטפורמות חזקות שניתן להשתמש בהם כדי מודל ארגון רקמות, התקדמות המחלה, ולזהות טיפולית23,28,29. microinjection Organoid יש ערך מוסף ליכולת האורגנוידים של מידול מחלות זיהומיות כפי שהוא מאפשר אינטראקציה פתוגן עם הצד האפיקלי של האפיתל המארח. ההתקדמות האחרונה בטכניקות מיקרו-אינפלציה מיטבו את מהירות ההזרקה באורגנוידים והגיעו לקצב של עד 90 organoids מוזרק לשעה. פונקציית המחסום באורגנוידים מוזרקים נשמרה, וריכוז החמצן הנמוך בתוך הלומן אפשר את הישרדותם של חיידקים מוזרקיםחובה-אנאירוביים 30. עם זאת, מחקרים ציינו את נוכחותה של הטרוגניות באוכלוסיות אורגנויד באותה באר. הבדלים אלה נצפו בגודל ובצורה31, רמות ביטוי של גנים מרכזיים32, כמו גם שיעוריהתפשטות 33. תגובות דיפרנציאליות בתוך אותה אוכלוסיית organoid לתרכובות כגון forskolin ו PGE2, או רעלן כולרה, תוארו גם28,33. תוצאות אלה מדגישות את הצורך במספרים אורגנוידים גבוהים במחקרים ומגבילים את ניצול הזרקת זוהר.
תרבות האורגנויד הקונבנציונלית מבוססת על אנקפסולציה והפצה של אורגנוידים בהידרוג'ל. עם זאת, הידרוג'ל יכול להוות מגבלות על דיפוזיה ולהציג שיפועי ריכוז, אשר יכול להגביר את ההטרוגניות34. יתר על כן, תועדו שונות גבוהה, לא רק בין תרבויות ותורמים אלא גם בתנאי ניסוי בודדים. מקור התורם, תכונות ביוכימיות של הידרוג'ל, והטרוגניות מהותית של האורגנויד כמערכת תרבות הם גורמים חשובים שיכולים להגביר את השונות הניסיונית ולהגביל את יכולת הרבייה של תוצאות שהושגו ביישומים במורד הזרם. שתי השיטות המתוארות כאן מספקות אמצעי פשוט לחשיפת הצד האפיקלי של האפיתל, ומאפשרות מידול של תרכובות ופתוגנים של עניין על ידי הוספתם ישירות למדיום התרבותי. הירידה בניצול הידרוג'ל יכולה להגביל את השונות הניסיונית ממקורות שגיאה טכניים.
האורגנוידים במעיים האפיקליים שומרים על מאפיינים מרכזיים של מערכת המודל האורגנויד והמדרגיות שלהם הופכת אותם למקובלים יותר עד תפוקה גבוהה, בהשוואה למונו-שכבתית הדו-ממדית. עם זאת, כמו organoids לשמור על המבנה 3D שלהם, הנגישות של הצד הבזלי מוגבלת ועלול לעכב מחקרים הדורשים גישה לשני הצדדים בו זמנית.
הוכחנו כי היפוך הקוטביות של organoids מעיים מסתמך על הסרה יעילה ומוחלטת של ECM, תוך שמירה על המבנה שלם של organoids. הן השימוש בפתרון הדיסוציאציה להסרת ECM והן הפתרון האנטי-דבק כדי למנוע דבקות אורגנוידים בכלי הפלסטיק תרמו ameliorating היעילות הכוללת של הפרוטוקול שפורסם על ידי Co, J. Y. ועמיתיו22, במיוחד לגבי מספר organoids apical-out המיוצר עבור יישומים במורד הזרם.
יתר על כן, ראינו כי הפרוטוקול שלנו תומך היפוך יעיל יותר של organoids קטן מ 250 מיקרומטר ושימוש organoids גדול יותר עלול לגרום פלט organoid מופחת, בשל הפיצול שנגרם על ידי pipetting. טיפים רחבים, כגון אלה המצוינים בטבלת החומרים, עשויים לאפשר ניצול של organoids גדול יותר. עם זאת, טיפים רחב נשא יעילים פחות דיסוציאציה ECM בהשוואה טיפים סטנדרטיים בשל כוח מכני מיושם נמוך יותר. לכן, שלבים חוזרים 1.2.9-1.2.11 עשויים להידרש לשיבושים מספיקים והסרה מלאה של כל שרידי ECM בעת עבודה עם organoids גדול יותר.
אורגנואידים בהשעיה יכולים לשרוד לפחות שבועיים. לאחר פרק זמן זה, ראינו שינויים מורפולוגיים ומספר גדל של מוות תאים. נוכחותם של תאים מתרבים באורגנוידים apical-out22 מאפשרת הקמה מחדש של תרביות organoid מעיים apical-in. זה יכול להיות מושגת על ידי ניתוק organoids apical-out לתאים בודדים והטבעת אותם ECM עם מדיום הרחבת אורגנויד מעיים.
מגבלה שנתקלת בה לעתים קרובות בפרוטוקולים המתארים הקמת אורגנואידים במעיים בתרביות השעיה היא דור של אגרגטים גדולים. זה משפיע על מספר משתנים כגון יעילות, רבייה של התכונות המורפולוגיות, חמיכות לתרכובות, ואיתות paracrine. בדומה לפרוטוקול שפורסם על ידי Co, J. Y. ועמיתיו, כאן אנו מאשרים כי השיג היפוך קוטביות של לפחות 97% מכל organoids מושעה ללא גיזום לאחר 3 ימים בהשעיה. עם זאת, בניגוד לפרסום, הצגנו צעד ניתוק מכני על מנת להפחית את היווצרות האגרגטים הגדולים ולהגדיל את התשואה. מאז הליך זה עלול לפגוע האפיתל של organoids, הארכנו את תקופת הדגירה organoids במשך יומיים נוספים כדי לאפשר התאוששות אפיתל מלאה ולהבטיח תרבויות באיכות גבוהה עבור יישומים במורד הזרם. כניסת תסיסה מתמדת עם השימוש בשייקר אינקובטור או בקבוקון ספינר עשויה להפחית אירועי היתוך, למזער פיצולים ולהגביר את החמצון. גישות חלופיות אלה עשויות לשמור על התרבויות למשך זמן ארוך יותר, להפחית את מות התאים ולאפשר הבחנה נוספת של האורגנוידים במעיים.
הקמתו של מונו-שכבתית 2D שמקורו באורגנויד מספקת מספר יתרונות וחסרונות בהשוואה לאורגנואידים הקוטביים ההפוכים. הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר הקמה מהירה של תרבות מונולייר משוחחת, בדרך כלל, תוך פחות מ -7 ימים ואפשרות לתחזוקה ארוכת טווח של התרבויות לתקופה ממושכת (עד 10 שבועות). הפרוטוקול והמדיה המשמשים כאן מאפשרים גם הבחנה יעילה של מספר משמעותי של תאים, לא תמיד נמצא בתרבויות מונו-שכבתיות אחרות שמקורן באורגנויד16. הקמת monolayer על קרום הכנסת תרבית התא מאפשר גישה בו זמנית הן לצדים apical ו basolateral של האפיתל מה שהופך אותם אידיאליים עבור מחקרים שלמות המחסום והובלה אפיתל. גישה פשוטה זו גם הופכת אותם נוחים יותר למחקרי זיהום וטיפול תרופתי. יתר על כן, תרבויות אלה שומרות על רבים מהמאפיינים הייחודיים לתורם, תוך שמירה על הרלוונטיות שלהן למחקרים ספציפיים למטופל. שיטת התרבות ALI גם מקלה על ההבחנה של אפיתל פונקציונלי יותר המורכב מסוגי תאים הפרשתיים וספיגה, מה שהופך אותו לייצוגי יותר של אפיתל המעי האנושי. היציבות היחסית של תרבויות אלה מאפשרת גם לשמור עליהן לתקופה ממושכת, ומספקת את האפשרות ללימודים ארוכי טווח. עם זאת, מגבלות של גישה זו הן המספר הגבוה של תאים הנדרשים כדי להקים monolayer confluent ואת הצורך לשמור על השפעה מלאה יש הפרדה פונקציונלית בין התאים apical ו basolateral. ארכיטקטורת הקריפטה האופיינית, אשר ניתן לדגמן בתרבויות האורגנויד 3D הולך לאיבוד גם עם הקמת תרבות monolayer. עם זאת, הפורמט הידידותי מבחינה ניסיונית של התרבות ואת הקלות שבה ניתן לגשת לצדדים apical ו basolateral של האפיתל, להפוך אותו כלי רב עוצמה לחקר פיזיולוגיה של המעי.

אפיתל המעי הוא האפיתל השני בגודלו בגוף האדם והוא מורכב משכבת תאים מקוטבת המאפשרת ספיגת חומרים מזינים ופועלת כמחסום נגד עלבונות סביבתיים1. הבחנה זו בין הצדדים האפיים והבסולטריים מאפשרת לתאי האפיתל לבצע את תפקידיהם המגוונים. התא האפיאלי חשוף ללומן ומתווך את האינטראקציות האפיתליות עם גירויים סביבתיים ומיקרואורגניזמים, תוך שהוא גם מקל על ספיגת החומרים המזינים. פני השטח הבסולטריים מכילים צמתים בין-תאיים והידבקויות במטריצת תאים, תוך כדי שדול לתאי מערכת החיסון ורקמות אחרות2. צמתים אלה מייצרים monolayer בלתי חדיר מחובר קרום המרתף, אשר פועל כמחסום ומספק את החומרים המזינים נספגים לרקמת הגוף שמסביב.
הקמת מערכות תרבות המסוגלות לשחזר את תפקודי המעיים הללו במבחנה הייתה מאתגרת3. מודלים במבחנה קונבנציונליים משתמשים בקווי תאים של סרטן המעי הגס האנושי שעברו טרנספורמציה, כגון קאקו-2, כדי ליצור תרביות מונו-שכבתיות דו-ממדיות. למרות היכולת לדגמן פונקציות מרובות של תא הספיגה, מודלים אלה אינם יכולים לשחזר באופן מלא את הרכב האפיתל והתפקוד במעיים, המגבילים מאפיינים פונקציונליים מרכזיים ויישומים4,5.
הופעתם של organoids כמערכת תרבית תלת-ממדית מתקדמת שנוצרה מתאי גזע שיכולים לארגן ולהבדיל את עצמם לסוגי תאים ספציפיים לאיברים, הייתה פריצת דרך במחקר במבחנה של אפיתל המעי6. אורגנוידים במעיים מוטבעים במטריצה חוץ-תאית (ECM) הדומה ללאמינה בזאלית ויוצרים צמתים של מטריצת תאים המאפשרים לתרבויות אלה לשמור על הקוטביות האפיקובסלת של האפיתל. Organoids מציגים ארכיטקטורה סגורה שבה הצד האפימי חשוף לתא הזוהר, ובכך מחקה את מבנה המעי. למרות שארגון סגור זה מציע את ההזדמנות ללמוד פונקציות ספציפיות להתמצאות, הוא מגביל חקירות הדורשות גישה לצד האפיזי של האפיתל. גישות שונות נלקחו כדי להתגבר על מגבלות אלה הן 2D ו 3D, כולל פיצול organoid, microinjection organoid, ודור של תרבויות monolayer7. פיצול אורגנויד גורם לאובדן הארגון המבני ולהרס צמתים סלולריים, המאפשרים את חשיפת המשטח האפיקלי של האפיתל למדיום. טכניקה זו מנצלת את היכולת ההתחדשותית של השברים כדי לתקן organoids כאשר זרע לתוך מטריצה חוץ תאית שימש מודל מחלות זיהומיות ואינטראקציותמארח-פתוגן 8,9. עם זאת, הגישה בו זמנית הן למשטח האפאלי והן למשטח הבזלי עשויה גם לעורר תגובות לא ספציפיות לזיהום.
גישה חלופית המאפשרת גישה למשטח האפילי ושומרת הן על הארכיטקטורה המבנית והן על צמתים סלולריים מיוצגת על ידי מיקרו-ינון של גורמים ללומן של אורגנוידים. שיטה זו נוצלה בהרחבה כדי לחקור אינטראקציות מארח-פתוגן ולדגם את ההשפעות של Cryptosporidium10, H. pylori11, ו C. difficile12 על אפיתל מערכת העיכול במבחנה. באמצעות טכניקות דומות, הפוטנציאל mutagenic של pks+ זן של E. coli על אפיתל מעיים נקבע13. למרות יעיל, microinjection organoid היא משימה מייגע ולא יעיל בהתחשב במספר הגבוה של organoids כי יש צורך להזריק כדי לקבל אפקטים מדידים ולכן מגביל את היישום שלה עבור בדיקות תפוקה גבוהה.
ההתקדמות האחרונה עם organoids מעיים סיפקו גם שיטות להקמת תרבויות organoid 2D monolayer, ובכך לחשוף את פני השטח apical שלהם14,15,16,17. אלה מונו-שכבתיות שמקורן באורגנוידים לשחזר מפתח בתכונות vivo של אפיתל המעי. הם מציגים הרכב תאים רלוונטי מבחינה פיזיולוגית, המכיל אוכלוסיות מובחנות ותאי גזע ומדגם את המגוון על פני ציר הקריפטה-villus. ככל שהקוטביות האפיקובסלת נשמרת, תכונות המונו-שכבתיות הטבועות מאפשרות גישה קלה הן לצדים האפיים והן לצדים הבסקיים וחילופי מדיה יכולים לחקות זרימת מעיים ופינוי פסולת המאפשרים תרבות ארוכת טווח. תכונות אלה הופכות את המונו-שכבתיות שמקורן באורגנוידים למקובלות למחקרים המתמקדים באינטראקציות זוהרות ומספקות מודל מעולה לשלמות מחסום אפיתל וחמלות18,19.
מחקרים הראו כי קוטביות תאי אפיתל מווסתת בחוזקה על ידי חלבוני ECM ב SDCK כדורי20,21 ולאחרונה באורגנוידים במעיים אנושיים22. הסרת רכיבי ECM או עיכוב של הקולטן integrin המתווך צמתים מטריצת התא גורמת היפוך קוטביות של organoids מעיים ואת החשיפה של הצד האפילי של האפיתל למדיום22. גישה זו משכה את העניין של חוקרים העובדים על מחלות זיהומיות שכן היא מאפשרת גישה קלה לצד האפירי בתלת-ממד והופכת אותו למקובל על תפוקה גבוהה. כאן, אנו מתארים פרוטוקול שונה המבוסס על העבודה האחרונה על ידי מעבדת Amieva22, המאפשר את הדור של organoids מעיים 3D לחשוף בקלות את הצד האפילי שלהם. אנו גם מתארים פרוטוקול שיכול ליצור ביעילות ובשחזור מונו-שכבתיים דו-שכבתיים במעיים הנגזרים מאורגנואידים במעיים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-Adherence Rinsing Solution</td>
			<td>STEMCELL Technologies Inc.</td>
			<td>7010</td>
			<td>For coating cultureware. Referred as anti-adherent solution into the main text.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes, 15 mL</td>
			<td>STEMCELL Technologies Inc.</td>
			<td>38009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Matrigel Matrix, Growth Factor Reduced (GFR), Phenol Red-Free</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td>Extracellular matrix (ECM) for maintenance and establishment of organoid lines.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar 6.5 mm or 12 mm Transwell inserts</td>
			<td>STEMCELL Technologies Inc.</td>
			<td>38023/38024</td>
			<td>For 2D Monolayer culture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar 24 Well&#160; Flat-Bottom, Tissue culture-treated plate</td>
			<td>STEMCELL Technologies Inc.</td>
			<td>38017</td>
			<td>For maintenance and establishment of organoid lines.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS (Without Ca++ and Mg++)</td>
			<td>STEMCELL Technologies Inc.</td>
			<td>37350</td>
			<td>For washing&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td>Reconstitution of small molecules</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12 with 15 mM HEPES</td>
			<td>STEMCELL Technologies Inc.</td>
			<td>36254</td>
			<td>For washing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentle Cell Dissociation Reagent (GCDR)</td>
			<td>STEMCELL Technologies Inc.</td>
			<td>7174</td>
			<td>For Matrigel removal. Referred as dissociation reagent into the main text.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IntestiCult Organoid Growth Medium (Human)</td>
			<td>STEMCELL Technologies Inc.</td>
			<td>6010</td>
			<td>For expansion of organoid lines prior to differentiation. Referred as Intestinal Organoid Expansion Medium into the main text.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IntestiCult Organoid Differentiation Medium (Human)</td>
			<td>STEMCELL Technologies Inc.</td>
			<td>100-0214</td>
			<td>For establishment of monolayers and 3D differentiation. Referred as Intestinal Organoid Differentiation Medium into the main text.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%)</td>
			<td>STEMCELL Technologies Inc.</td>
			<td>7910</td>
			<td>For 2D Monolayer establishment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>STEMCELL Technologies Inc.</td>
			<td>72302</td>
			<td>RHO/ROCK pathway inhibitor, Inhibits ROCK1 and ROCK2. Used for 2D monolayer establishment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide bore tips</td>
			<td>Corning</td>
			<td>#TF-1005-WB-R-S</td>
			<td>Organoids handling</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culture methods to study apical-specific interactions using intestinal organoid models

רירית האפיתל במעיים מורכבת משכבה פשוטה של תאי אפיתל מיוחדים החושפים את הצד האפיקלי שלהם ללומן ומגיבים לרמזים חיצוניים. אופטימיזציה אחרונה של תנאי תרבות במבחנה מאפשרת יצירה מחדש של נישה של תאי גזע המעי ופיתוח של מערכות תרבות תלת ממדיות מתקדמות (3D) כי recapitulate הרכב התא ואת הארגון של האפיתל. אורגנוידים מעיים המוטמעים במטריצה חוץ-תאית (ECM) יכולים להישמר לטווח ארוך ולארגן את עצמם כדי ליצור אפיתל מקוטב ומוגדר היטב המקיף לומן פנימי וצד בזאלי חיצוני חשוף. אופי מגביל זה של האורגנוידים במעיים מציב אתגרים בגישה למשטח האפילי של האפיתל במבחנה ומגביל את החקירה של מנגנונים ביולוגיים כגון ספיגת חומרים מזינים ואינטראקציות בין מארח מיקרוביוטה לפתוגן. כאן, אנו מתארים שתי שיטות המאפשרות גישה לצד האפילי של האפיתל האורגנויד ותומכות בהבחנה של סוגי תאי מעיים ספציפיים. ראשית, אנו מראים כיצד הסרת ECM מעוררת היפוך של קוטביות תאי האפיתל ומאפשרת את הדור של organoids 3D apical-out. שנית, אנו מתארים כיצד ליצור monolayers דו ממדי (2D) מן השעיות תא יחיד נגזר organoids מעיים, המורכב מסוגי תאים בוגרים ומובחנים. טכניקות אלה מספקות כלים חדשניים לחקר אינטראקציות ספציפיות לאפיתל עם רמזים חיצוניים במבחנה ולקדם את השימוש באורגנוידים כפלטפורמה להקלה על רפואה מדויקת.

Watch this Scientific Journal Video about Culture Methods to Study Apical-Specific Interactions using Intestinal Organoid Models at JoVE.com

Culture Methods to Study Apical-Specific Interactions using Intestinal Organoid Models

כאן אנו מציגים שני פרוטוקולים המאפשרים מידול של אינטראקציות ספציפיות למעיים. מונו-שכבתי מעיים שמקורם באורגנוידים ותרבויות ממשק נוזלי אוויר (ALI) מאפשרות ליצור אפיתליה מובחנת היטב הנגישה הן מצדי הזוהר והן מצד בזולטר, בעוד שאורגנואידים מעיים הפוכים בקוטביות חושפים את הצד האפי שלהם והם נוחים לתפוקה גבוהה.

שיטות תרבות לחקר אינטראקציות ספציפיות לאפיקליות באמצעות מודלים אורגנויד מעיים

The lining of the gut epithelium is made up of a simple layer of specialized epithelial cells that expose their apical side to the lumen and respond to ...

מחקרים אלה שואפים לספק מערכות מודל חזקות לשחזור כדי לבצע מחקרים ספציפיים אוריינטציה של אפיתל המעי. אורגנואידים אפיים יכולים להיווצר במספרים גבוהים ולהבטיח הקרנת תפוקה גבוהה. קל יותר לתמרן את המונוליירים ומציעים גישה לסימנים אפיים ובזליליים כאחד.ודא כי גודל organoids הוא 150 עד 250 מיקרומטר קוטר לפני תחילת פרוטוקול היפוך. הסר בזהירות ולהשליך את המדיום מכל באר המכילה organoids מבלי לשבש את כיפת ECM. מוסיפים מיליליטר אחד של תמיסת דיסוציאציה קרה כקרח לכל באר ודגר את הצלחת בטמפרטורת החדר למשך דקה אחת.בזהירות להוציא את הכיפות על ידי צנרת לאט עם קצה מצופה, דואג לא לשבש ולפצל את organoids. מעבירים את ההשעיה האורגנוידית לצלחת המטופלת בתמיסה נגד הדבקה ומניחים את הצלחת על שייקר בארבע מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר 30 דקות להסיר את הצלחת בעדינות pipette את הפתרון למעלה ולמטה באמצעות קצה פיפטה מיליליטר אחד מצופה פתרון אנטי דבק.מניחים את הצלחת על השייקר בארבע מעלות צלזיוס למשך 30 דקות נוספות. הסר את הצלחת ולתת organoids להתיישב על ידי כוח המשיכה במשך 1 עד 2 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר organoids להתיישב, להסיר כמה שיותר של פתרון דיסוציאציה ככל האפשר לשטוף אותם על ידי הוספת 1.5 מיליליטר של DMEM F-12.אפשר לאורגנואידים למכתם ולהסיר את הסופר-טבעי. ואז לחזור על הכביסה. הסר כמה שיותר של DMEM F-12 ככל האפשר ולהוסיף 0.5 מיליליטר של מדיום הרחבת organoid מעיים.דגירה בין לילה ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני. למחרת לבצע שינוי בינוני חלקי על ידי הטיית הצלחת בזווית של 25 עד 30 מעלות והסרת בינוני לאורך קיר הבאר דואג לא להסיר organoids מושעה. הוסף 0.4 מיליליטר של התפשטות organoid מעיים בינוני ודגורה ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני במשך שלושה ימים.אם נוצרו אגרגטים השתמש בקצה פיפטה מיליליטר אחד מצופה בתמיסה אנטי דבקה כדי לגטות את האגרגטים על ידי צנרת למעלה ולמטה 20 פעמים תוך לחיצה על קצה הקצה לתחתית הצלחת. הוסף מיליליטר אחד של 0.05% טריפסין-EDTA מחומם מראש כדי resuspend organoids. ומערבבים ביסודיות כדי להבטיח השעיה אחידה.הוסף עד מיליליטר אחד נוסף של טריפסין-EDTA עבור מספר רב של תאים, או אם כמות משמעותית של ECM נשאר. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך חמש עד 10 דקות, ולאחר מכן לערבב ביסודיות עם פיפטה מיליליטר אחד כדי לשבש את organoids כך שהם מנותקים לחלוטין לתאים בודדים או שברים קטנים. כדי לנתק לחלוטין שברים או organoids שלם להמשיך את הדגירה עם טריפסין-EDTA ב 37 מעלות צלזיוס עוד שלוש עד חמש דקות.לאחר organoids הם מנותקים מספיק להוסיף נפח שווה של DMEM F-12 ו pipette למעלה ולמטה לערבב ביסודיות. הפעל את טריפסין-EDTA על-ידי הוספת 10%FBS לתאים. שברי צנטריפוגה ב 200 פעמים G במשך חמש דקות בשתיים עד שמונה מעלות צלזיוס.אם האורגנוידים המנותקים לא הצליחו לבלבל את התאים ביסודיות על ידי צנרת למעלה ולמטה וצנטריפוגה אותם שוב. הסר בזהירות כמה שיותר על-טבעי ככל האפשר. משאיר רק את גלולה התא.Resuspend התאים ב 100 microliters של מדיום בידול אורגנויד מעיים עבור כל באר להיות זרע. כוונון אמצעי האחסון בהתאם לגדלי באר גדולים או קטנים יותר. הסר את הצלחות מצופות מן האינקובטור ולהסיר את תמיסה מטריצת קרום המרתף עודף מכל באר.הוסף 100 מיקרוליטרים של השעיית התא לבאר העליונה של כל תוספת תרבית תא ו -500 מיקרוליטרים של בידול אורגנויד במעיים מדיום לבאר התחתונה. ואז דגירה ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני. החלף את המדיום הן בבאר העליונה והן בבאר התחתונה כל יומיים עד שלושה ימים.כדי להקים תרבית ALI להסיר מדיום מן הבאר העליונה והתחתון, ולהוסיף בינוני בידול אורגנויד מעיים טריים לבאר התחתונה משאיר את הבאר העליונה ריקה. האורגנוידים במעיים עם מדיום הרחבת אורגנויד במעיים הציגו מורפולוגיה ציסטית. כאשר ECM מוסר כמה organoids נוטים לצבור במהלך שלושת הימים הראשונים צריך להיות שף ב כדי להגדיל את מספר organoid.אורגנוידים מעיים בתרבית ECM המשיכו להתרחב ולהציג היווצרות ספונטנית של מבנים ניצנים משניים. Organoids נשמר במשך חמישה ימים בהיעדר מטריצה חוץ תאית הציג צורות מוארכות, ציסטיות, ולא סדיר. הביטוי של סמנים לא טיפוסיים, כגון villin ו- ZO-1 זוהה בצד החיצוני של האפיתל שנחשף למדיום.אורגנוידים משובצים ECM מוכתמים בגרעין, villin ו- ZO-1 המדגימים קוטביות בזאלית אפית שבה הצד האפילי פונה ללומן של האורגנויד. ברגע שהוקם המונו-שכבתית נוצרו תאים צמתים הדוקים ושכבה ממפגשית. השכבה המשתלבת מכוונת גם את הווילין שלה המכיל גבול מברשת לכיוון הצד האפיקלי של האפיתל, ויוצרת מתחמי חלבון רב-חלבונים ZO-1 בין התאים.מעבר לתרבות ALI גרם לבידול נוסף עם תאי גאבל בולטים יותר אשר היה דמיוני על ידי כתמים עבור חלבון mucin המופרש MUC2 כדי לגרום היפוך הקוטביות זה חיוני כדי להסיר את כל ECM מבלי לשבש או פיצול organoids. שינויים בתקשורת צריכים להיעשות גם בזהירות כדי למנוע הסרת כל organoids מושעה. הבטחת כי ישנם תאים בודדים מספיקים להקמת תרבות monolayer הוא דטרמיננטה מרכזית של איכותה.פונקציות ספציפיות אפיות כגון ספיגת חומרים מזינים או אינטראקציות פתוגן מארח יכול עכשיו הוא למד במערכות רלוונטיות שמתאימות לצרכים של החוקרים.

Research

JoVE Journal

Biology

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

בדיקת רגישות חזותית על מהירות ועל כיוון התנועה של לטאות

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the I&middot;Cryo Kit

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the IÃƒâ€šÃ‚Â·Cryo Kit

הזרע עכבר cryopreservation ושחזור באמצעות · אני cryo Kit

Thousands of new genetically modified (GM) strains of mice have been created since the advent of transgenesis and knockout technologies.  Many of these ...

Using Coculture to Detect Chemically Mediated Interspecies Interactions

שימוש Coculture לזהות אינטראקציות interspecies המתווכת כימית

In nature, bacteria rarely exist in isolation; they are instead surrounded by a diverse array of other microorganisms that alter the local environment by ...

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

<em&gt; Ex vivo</em&gt; מערכת תרבות ללמוד התפתחות בלוטת התריס

The thyroid is a bilobated endocrine gland localized at the base of the neck, producing the thyroid hormones T3, T4, and calcitonin. T3 and T4 are ...

A Video Protocol of Retroviral Infection in Primary Intestinal Organoid Culture

פרוטוקול וידאו של זיהום retroviral ביסודי מעיים Organoid תרבות

Lgr5-positive stem cells can be supplemented with the essential growth factors Egf, Noggin, and R-Spondin, which allows us to culture ever-expanding ...

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

אמיתי ניתוח זמן של פרופיל המטבולי ב<em&gt; Ex Vivo</em&gt; תרבויות עכבר המעיים קריפטה Organoid

The small intestinal mucosa exhibits a repetitive architecture organized into two fundamental structures: villi, projecting into the intestinal lumen and ...

Isolation and Enrichment of Human Lung Epithelial Progenitor Cells for Organoid Culture

בידוד והעשרה של תאי אב אפיתל הריאה האנושיים לתרבית אורגנואידית

Epithelial organoid models serve as valuable tools to study the basic biology of an organ system and for disease modeling. When grown as organoids, ...

Organoid-Derived Epithelial Monolayer: A Clinically Relevant In Vitro Model for Intestinal Barrier Function

מונו-שכבת אפיתל שמקורה באורגנואידים: מודל במבחנה רלוונטי מבחינה קלינית לתפקוד מחסום המעי

In the past, intestinal epithelial model systems were limited to transformed cell lines and primary tissue. These model systems have inherent limitations ...

Staining and High-Resolution Imaging of Three-Dimensional Organoid and Spheroid Models

צביעה והדמיה ברזולוציה גבוהה של מודלים תלת מימדיים של אורגנואידים וכדוריים

In vitro three-dimensional (3D) cell culture models, such as organoids and spheroids, are valuable tools for many applications including development and ...

Quantitative Methods to Study Protein Arginine Methyltransferase 1-9 Activity in Cells

שיטות כמותיות לחקר חלבון ארגינין מתילטרנספראז 1-9 פעילות בתאים

Protein methyltransferases (PRMTs) catalyze the transfer of a methyl group to arginine residues of substrate proteins. The PRMT family consists of nine ...