Name: identifying the binding proteins of small ligands with the differential radial capillary action of ligand assay (dracala)
Uploaded: 2021-03-19T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay DRaCALA at JoVE.com

ويدعم هذا العمل منحة مشروع NNF (NNF19OC0058331) إلى YEZ، وبرنامج أفق الاتحاد الأوروبي للبحث والابتكار لعام 2020 بموجب اتفاقية منحة ماري سكلودوسكا كوري (Nº 801199) إلى MLS.
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62331/62331img1.jpg">

1. إعداد lysates الخلية بأكملها
<ol><li>تلقيح E. coli K-12 ASKA ORFeome جمعسلالات 15 إلى 1.5 مل مرق ليسوجيني (LB) التي تحتوي على 25 ميكروغرام / مل الكلورامفينيكول في 96 جيدا لوحات الآبار العميقة. تنمو بين عشية وضحاها (O / N) لمدة 18 ساعة في 30 درجة مئوية مع اهتزاز في 160 دورة في الدقيقة. في اليوم التالي، أ...

<ol>
	<li>Kalia, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleotide,+c-di-GMP,+c-di-AMP,+cGMP,+cAMP,+(p)ppGpp+signaling+in+bacteria+and+implications+in+pathogenesis.">Nucleotide, c-di-GMP, c-di-AMP, cGMP, cAMP, (p)ppGpp signaling in bacteria and implications in pathogenesis.</a> Chemical Society Reviews. 42 (1), 305-341 (2013).</li><li>Camilli, A., Bassler, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+small-molecule+signaling+pathways.">Bacterial small-molecule signaling pathways.</a> Science. 311 (5764), 1113-1116 (2006).</li><li>Luo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cAMP+capture+compound+mass+spectrometry+as+a+novel+tool+for+targeting+cAMP-binding+proteins:+from+protein+kinase+A+to+potassium/sodium+hyperpolarization-activated+cyclic+nucleotide-gated+channels.">The cAMP capture compound mass spectrometry as a novel tool for targeting cAMP-binding proteins: from protein kinase A to potassium/sodium hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channels.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 8 (12), 2843-2856 (2009).</li><li>Nesper, J., Reinders, A., Glatter, T., Schmidt, A., Jenal, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+capture+compound+for+the+identification+and+analysis+of+cyclic+di-GMP+binding+proteins.">A novel capture compound for the identification and analysis of cyclic di-GMP binding proteins.</a> Journal of Proteomics. 75 (15), 4874-4878 (2012).</li><li>Laventie, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capture+compound+mass+spectrometry--a+powerful+tool+to+identify+novel+c-di-GMP+effector+proteins.">Capture compound mass spectrometry--a powerful tool to identify novel c-di-GMP effector proteins.</a> Journal of Visual Experiments. (97), e51404 (2015).</li><li>Roelofs, K. G., Wang, J., Sintim, H. O., Lee, V. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+radial+capillary+action+of+ligand+assay+for+high-throughput+detection+of+protein-metabolite+interactions.">Differential radial capillary action of ligand assay for high-throughput detection of protein-metabolite interactions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (37), 15528-15533 (2011).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+adaptation+of+the+essential+tRNA+methyltransferase+TrmD+to+the+signaling+molecule+3+',5+'-cAMP+in+bacteria.">Evolutionary adaptation of the essential tRNA methyltransferase TrmD to the signaling molecule 3 ',5 '-cAMP in bacteria.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (1), 313-327 (2017).</li><li>Corrigan, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+identification+of+conserved+bacterial+c-di-AMP+receptor+proteins.">Systematic identification of conserved bacterial c-di-AMP receptor proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (22), 9084-9089 (2013).</li><li>Roelofs, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+identification+of+cyclic-di-GMP+binding+proteins+in+Vibrio+cholerae+reveals+a+novel+class+of+cyclic-di-GMP-binding+ATPases+associated+with+type+II+secretion+systems.">Systematic identification of cyclic-di-GMP binding proteins in Vibrio cholerae reveals a novel class of cyclic-di-GMP-binding ATPases associated with type II secretion systems.</a> PLoS Pathogen. 11 (10), 1005232 (2015).</li><li>Fang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GIL,+a+new+c-di-GMP-binding+protein+domain+involved+in+regulation+of+cellulose+synthesis+in+enterobacteria.">GIL, a new c-di-GMP-binding protein domain involved in regulation of cellulose synthesis in enterobacteria.</a> Molecular Microbiology. 93 (3), 439-452 (2014).</li><li>Corrigan, R. M., Bellows, L. E., Wood, A., Grundling, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ppGpp+negatively+impacts+ribosome+assembly+affecting+growth+and+antimicrobial+tolerance+in+Gram-positive+bacteria.">ppGpp negatively impacts ribosome assembly affecting growth and antimicrobial tolerance in Gram-positive bacteria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1710-1719 (2016).</li><li>Zhang, Y., Zbornikova, E., Rejman, D., Gerdes, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+(p)ppGpp+binding+and+metabolizing+proteins+of+Escherichia+coli.">Novel (p)ppGpp binding and metabolizing proteins of Escherichia coli.</a> Mbio. 9 (2), 02188 (2018).</li><li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nucleotide+pGpp+acts+as+a+third+alarmone+in+Bacillus,+with+functions+distinct+from+those+of+(p)+ppGpp.">The nucleotide pGpp acts as a third alarmone in Bacillus, with functions distinct from those of (p) ppGpp.</a> Nature Communications. 11 (1), 5388 (2020).</li><li>Orr, M. W., Lee, V. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+radial+capillary+action+of+ligand+assay+(DRaCALA)+for+high-throughput+detection+of+protein-metabolite+interactions+in+bacteria.">Differential radial capillary action of ligand assay (DRaCALA) for high-throughput detection of protein-metabolite interactions in bacteria.</a> Methods in Molecular Biology. 1535, 25-41 (2017).</li><li>Kitagawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+set+of+ORF+clones+of+Escherichia+coli+ASKA+library+(A+complete+Set+of+E.+coli+K-12+ORF+archive):+Unique+resources+for+biological+research.">Complete set of ORF clones of Escherichia coli ASKA library (A complete Set of E. coli K-12 ORF archive): Unique resources for biological research.</a> DNA Research. 12 (5), 291-299 (2005).</li><li>Hochstadt-Ozer, J., Cashel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+purine+utilization+in+bacteria.+V.+Inhibition+of+purine+phosphoribosyltransferase+activities+and+purine+uptake+in+isolated+membrane+vesicles+by+guanosine+tetraphosphate.">The regulation of purine utilization in bacteria. V. Inhibition of purine phosphoribosyltransferase activities and purine uptake in isolated membrane vesicles by guanosine tetraphosphate.</a> Journal of Biological Chemistry. 247 (21), 7067-7072 (1972).</li><li>Zhang, Y. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p)ppGpp+regulates+a+bacterial+nucleosidase+by+an+allosteric+two-domain+switch.">p)ppGpp regulates a bacterial nucleosidase by an allosteric two-domain switch.</a> Molecular Cell. 74 (6), 1239-1249 (2019).</li><li>Wang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity-based+capture+and+identification+of+protein+effectors+of+the+growth+regulator+ppGpp.">Affinity-based capture and identification of protein effectors of the growth regulator ppGpp.</a> Nature Chemical Biology. 15 (2), 141-150 (2019).</li></ol>

واحدة من الخطوات الحاسمة في أداء فحص DRaCALA هو الحصول على lysates خلية كاملة جيدة. أولا، ينبغي إنتاج البروتينات المختبرة بكميات كبيرة وفي أشكال قابلة للذوبان. ثانيا، يجب أن يكون تحلل الخلايا كاملا، ويجب أن تكون لزوجة التحلل ضئيلة. إدراج lysozyme واستخدام ثلاث دورات من تجميد ذوبان غالبا ما تكون كافي?...

البكتيريا استخدام عدة جزيئات الإشارات الصغيرة للتكيف مع بيئات المتغيرة باستمرار1،2. على سبيل المثال، فإن الحثات الذاتية، N-acylhomoserine lactones وoligopeptides المعدلة، والتوسط في الاتصالات بين الخلايا بين البكتيريا لتنسيق السلوك السكاني، وهي ظاهرة تعرف باسم استشعار النصابالقانوني 2. مجموعة أخرى من جزيئات الإشارات الصغيرة هي NSMs ، بما في ذلك الأدينوسين الدوري الذي تمت دراسته على نطاق واسع أحادي الفوسفات (cAMP) ، ودي أمبير الدوري ، والفوسفات الأحادي الدوري دي جوانوسين (الدوري دي GMP) ، وغوانوزين بنتا - وتترا فوسفات (p)ppGpp1. البكتيريا تنتج هذه NSMs كاستجابة لمجموعة متنوعة من ظروف الإجهاد المختلفة. بمجرد إنتاجها ، ترتبط هذه الجزيئات بالبروتينات المستهدفة وتنظم العديد من المسارات الفسيولوجية والأيضية المختلفة للتعامل مع الضغوط التي تواجهها وتعزيز البقاء البكتيري. لذلك ، فإن تحديد البروتينات المستهدفة هو شرط أساسي لا مفر منه لفك الرموز الوظائف الجزيئية لهذه الجزيئات الصغيرة.
وقد شهد العقد الماضي طفرة في المعرفة بهذه الجزيئات الصغيرة التي تشير إلى ذلك، ويرجع ذلك أساسا إلى العديد من الابتكارات التقنية التي كشفت عن البروتينات المستهدفة لهذه الجزيئات الصغيرة. وتشمل هذه تقنية مركب التقاط3،4،5، والعمل الشعيرات الدموية الشعاعية التفاضلية من المقايسة ليغاند (DRaCALA)6 لمناقشتها في هذه الورقة.
اخترعها فنسنت لي وزملاء العمل في 20116, DRaCALA تنشر قدرة غشاء النيتروسليلوز لعزل التفاضلية الحرة والبروتين ملزمة ligands. جزيئات مثل البروتينات لا يمكن أن تنتشر على غشاء النيتروسليلوز، في حين أن الليغنديات الصغيرة، مثل NSMs، قادرة على. عن طريق خلط NSM(على سبيل المثال، ppGpp) مع البروتين لاختبارها واكتشافها على الغشاء ، يمكن توقع سيناريوهين(الشكل 1):إذا (ع) ppGpp يربط البروتين ، سيتم الاحتفاظ بالعلامات المشعة (p) ppGpp في وسط البقعة بواسطة البروتين ولن ينتشر إلى الخارج ، مما يعطي نقطة صغيرة مكثفة (أي، إشارة مشعة قوية) تحت الفوسفوريماجر. ومع ذلك، إذا (ع)ppGpp لا يرتبط البروتين، وسوف تنتشر بحرية إلى الخارج لإنتاج بقعة كبيرة مع إشارة مشعة خلفية موحدة.
وعلاوة على ذلك، يمكن الكشف عن DRaCALA التفاعل بين جزيء صغير وبروتين غير مبور في lysate خلية كاملة إذا كان البروتين موجود في كمية كافية. هذه البساطة تسمح باستخدام DRaCALA في تحديد أهداف البروتين بسرعة باستخدام مكتبة التعبير ORFeome. في الواقع، البروتينات المستهدفة من cAMP7، دوري دي AMP8، دوري دي GMP9،10، و (ع) ppGpp11،12،13 وقد تم تحديد منهجي باستخدام DRaCALA. تستخدم هذه المقالة الفيديو (p)ppGpp كمثال على إظهار ووصف الخطوات والاعتبارات الهامة في إجراء فحص DRaCALA ناجحة. ملاحظة، ينصح بشدة وصف أكثر شمولا من DRaCALA14 لقراءة بالاشتراك مع هذه المقالة قبل تنفيذ DRaCALA.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62331/62331fig01.jpg"> الشكل 1: مبدأ DRaCALA. (أ) التخطيطي للدراكالا المقايسة. راجع النص للحصول على التفاصيل. (ب)تحديد وحساب الكسر الملزم. راجع النص للحصول على التفاصيل. باختصار، سيتم تحليل البقع DRaCALA عن طريق رسم دائرتين التي تحد من بقعة كاملة والنقطة المظلمة الداخلية(أي.،وتحتفظ (ع) ppGpp بسبب ربط البروتين اختبارها). إشارة الربط المحددة هي الإشارة المشعة للدائرة الداخلية (S1) بعد طرح إشارة الخلفية غير المحددة (محسوبة ب A1 × ((S2-S1)/(A2-A1)). الكسر الملزم هو إشارة الربط المحددة مقسومة على إجمالي الإشارة المشعة (S2). المختصرات: DRaCALA = العمل الشعيرات الشعرية الشعاعية التفاضلية من المقايسة ليغاند; (ع) ppGpp = جوانوسين بنتا - وتيترافوسفات؛ RT = درجة حرارة الغرفة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62331/62331fig01large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>32P-&#945;-GTP</td>
			<td>Perkinelmer</td>
			<td>BLU006X250UC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 x pin tool</td>
			<td>V&#38;P Scientific</td>
			<td>VP 404</td>
			<td>96 Bolt Replicator, on 9 mm centers, 4.2 mm Bolt Diameter, 24 mm long</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well V-bottom microtiter plate</td>
			<td>Sterilin</td>
			<td>MIC9004</td>
			<td>Sterilin Microplate V Well 611V96</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>OXOID - Thermo Fisher</td>
			<td>LP0011</td>
			<td>Agar no. 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ASKA collection strain</td>
			<td>NBRP, SHIGEN, JAPAN</td>
			<td></td>
			<td>Ref: DNA Research, Volume 12, Issue 5, 2005, Pages 291&#8211;299. https://doi.org/10.1093/dnares/dsi012</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>E1014-25KU</td>
			<td>genetically engineered endonuclease from Serratia marcescens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford Protein Assay Dye</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>5000006</td>
			<td>Reagent Concentrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D8418</td>
			<td>&#8805;99.9%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase 1</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>DN25-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gel filtration10x300 column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28990944</td>
			<td>contains 20% ethanol as preservative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>122329.1214</td>
			<td>Glycerol 87% for analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypercassette</td>
			<td>Amersham</td>
			<td>RPN 11647</td>
			<td>20 x 40 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>56750</td>
			<td>puriss. p.a., &#8805; 99.5% (GC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IP Storage Phosphor Screen</td>
			<td>FUJIFILM</td>
			<td>28956474</td>
			<td>BAS-MS 2040 20x 40 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>I6758</td>
			<td>Isopropyl &#946;-D-thiogalactoside</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysogeny Broth (LB)</td>
			<td>Invitrogen - Thermo Fisher</td>
			<td>12795027</td>
			<td>Miller&#39;s LB Broth Base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>L4949</td>
			<td>from chicken egg white; BioUltra, lyophilized powder, &#8805;98%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 (Magnesium chloride)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>208337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliQ water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ultrapure water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multichannel pipette</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>4661110</td>
			<td>F1 - Clip Tip; 1-10 ul, 8 x channels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>27810</td>
			<td>AnalaR NORMAPUR, ACS, Reag. Ph. Eur.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Agarose</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>30230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose Blotting Membrane</td>
			<td>Amersham Protran</td>
			<td>10600003</td>
			<td>Premium 0.45 um 300 mm x 4 m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>OXOID - Thermo Fisher</td>
			<td>BR0014G</td>
			<td>Phosphate buffered saline (Dulbecco A), Tablets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG3350 (Polyethylene glycol 3350)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>202444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>93482</td>
			<td>Phenylmethanesulfonyl fluoride solution - 0.1 M in ethanol (T)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphor-imager</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28955809</td>
			<td>Typhoon FLA-7000 Phosphor-imager</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips, filtered</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>94410040</td>
			<td>ClipTip 12.5 &#956;l nonsterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-Prep Chromatography column</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7311550</td>
			<td>polypropylene chromatography column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor Mini</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>A32955</td>
			<td>Tablets, EDTA-free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>screw cap tube</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3488</td>
			<td>Microcentifuge Tubes, 2.0 ml with screw cap, nonsterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SLS 96-deep Well plates</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>780285</td>
			<td>MASTERBLOCK, 2 ML, PP, V-Bottom, Natural</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spin column</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC500396</td>
			<td>Amicon Ultra -0.5 ml Centrifugal Filters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5382000015</td>
			<td>Thermomixer C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC plate (PEI-cellulose F TLC plates)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>105579</td>
			<td>DC PEI-cellulose F (20 x 20 cm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>BP152</td>
			<td>Tris Base for Molecular Biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P1379</td>
			<td>viscous non-ionic detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>M3148</td>
			<td>99% (GC/titration)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identifying the binding proteins of small ligands with the differential radial capillary action of ligand assay (dracala)

شهد العقد الماضي تقدما هائلا في فهم جزيئات الإشارات الصغيرة في فسيولوجيا البكتيريا. وعلى وجه الخصوص، تم تحديد البروتينات المستهدفة للعديد من الرسل الثانويين المشتقة من النيوكليوتيدات (NSMs) بشكل منهجي ودراسة في الكائنات الحية النموذجية. ويعزى هذا الإنجاز أساسا إلى تطوير العديد من التقنيات الجديدة بما في ذلك تقنية مركب التقاط والعمل الشعيرات الدموية الشعاعية التفاضلية من المقايسة ليغاند (DRaCALA)، والتي استخدمت لتحديد البروتينات المستهدفة بشكل منهجي من هذه الجزيئات الصغيرة. تصف هذه الورقة استخدام NSMs، وبانتوسين بنتا- و tetraphosphates (p)ppGpp، كمثال ومظاهرة فيديو لتقنية DRaCALA. باستخدام DRaCALA، تم تحديد 9 من أصل 20 البروتينات المستهدفة المعروفة و 12 من (ع) ppGpp في الكائن الحي النموذجي، Escherichia القولونية K-12، مما يدل على قوة هذا المقايسة. من حيث المبدأ ، يمكن استخدام DRaCALA لدراسة الليغندات الصغيرة التي يمكن تصنيفها بالنظائر المشعة أو الأصباغ الفلورية. تتم مناقشة الخطوات الحاسمة والايجابيات والسلبيات من DRaCALA هنا لمزيد من التطبيق لهذه التقنية.

باتباع البروتوكول المذكور أعلاه سوف تسفر عادة نوعين من النتائج (الشكل 3).
ويبين الشكل 3 ألف لوحة ذات إشارات ربط خلفية منخفضة نسبيا (كسور ملزمة < 0.025) من غالبية الآبار. إشارة الربط الإيجابية من بئر H3 يعطي جزء ملزم من ~ 0.35 وهذا هو أعلى بكثير من تلك ا?...

Watch this Scientific Journal Video about Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay DRaCALA at JoVE.com

Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay DRaCALA

يمكن استخدام العمل الشعيرات الدموية الشعاعية التفاضلية من المقايسة ليغاند (DRaCALA) لتحديد البروتينات ملزمة ليغاند الصغيرة من كائن حي باستخدام مكتبة ORFeome.

تحديد البروتينات الملزمة للليجاندات الصغيرة مع العمل الشعيرات الدموية الشعاعية التفاضلية من المقايسة ليغاند (DRaCALA)

The past decade has seen tremendous progress in the understanding of small signaling molecules in bacterial physiology. In particular, the target proteins ...

جزيئات الإشارات الصغيرة تستهدف البروتينات المختلفة للسيطرة على الفوعة البكتيرية والبيولوجيا البشرية. ومع ذلك، فإن هذه البروتينات التأثيرية صعبة التحديد. كأداة بيولوجيا النظم، DRaCALA يسمح تحديد ممكن وسريع وحساسة للغاية من البروتينات التأثير غير معروف باستخدام مكتبة OVium.يمكن استخدام DRaCALA لدراسة أي جزيء إشارات صغير طالما يمكن تسميته إما بالنظائر المشعة أو الأصباغ الفلورية. ابدأ بتطعيم الإشريكية القولونية إلى 1.5 ملليلتر من LB المكملة ب 25 ميكروغرام لكل ملليلتر كلورامفينيكول في كل بئر من لوحات الآبار العميقة 96 جيدا لاحتضانها بين عشية وضحاها عند 30 درجة مئوية و 160 دورانا في الدقيقة. في صباح اليوم التالي، علاج الثقافات بين عشية وضحاها مع 500 IPTG ميكرومولار لمدة ست ساعات في 30 درجة مئوية للحث على التعبير عن البروتين.في نهاية الحضانة ، بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي ، وإزالة supernatant ، وتجميد العينات في ناقص 80 درجة مئوية. لبدء التحلل ، وإعادة إنفاق الكريات في 150 ميكرولتر من العازلة تحلل واحد لكل بئر لاحتضان لمدة 30 دقيقة في ناقص 80 درجة مئوية قبل إذابة الخلايا لمدة 20 دقيقة في 37 درجة مئوية. ثم يجب تخزين الليسات عند ناقص 80 درجة مئوية قبل الاستخدام.لإكمال تحلل الخلايا مع البروتينات المفرطة، resuspend العينات في 40 ملليلتر من الجليد الباردة تحلل العازلة اثنين و sonicate العينات في 60٪ السعة في ثانيتين على أربع ثوان قبالة لمدة ثماني دقائق، ثم مسح التحلل عن طريق الطرد المركزي. وبينما يجري طرد العينات، أضف 500 ميكرولتر من راتنج النيكل-NTA المتجانس إلى عمود كروماتوغرافيا البولي بروبلين الدائم. بعد 15 دقيقة، اغسل الراتنج المستقر مرتين مع 15 ملليلتر من الماء فائق البور ومرة واحدة مع 15 ملليلتر من العازلة تحلل اثنين.في نهاية الطرد المركزي، قم بتحميل الناسخة الغليزة التي تم مسحها على العمود. عندما تتدفق كل اللحواف عبر العمود، اغسل العمود ب 30 ملليلتر من المخزن المؤقت للغسيل. لeute البروتينات، إضافة 400 حجم ميكرولتر من العازلة elution إلى العمود وتكرار elution ثلاث مرات.آخر 300 حجم ميكرولتر من العازلة elution لتكرار elution ثلاث مرات والجمع بين البروتينات eluted في حجم نهائي من 700 ميكرولتر. لترشيح هلام العينة eluted، بعد غسل عمود استبعاد حجم مع 25 ملليلتر من العازلة الترشيح هلام أعدت حديثا، تحميل كامل حجم البروتين eluted على العمود باستخدام حلقة ميكرولتر 500. تشغيل في 500 ميكرولتر في الدقيقة الواحدة وجمع 2-3 500 كسور حجم ميكروليتر من البروتينات المعنية.ثم استخدم أعمدة الدوران الفردية لتركيز كل بروتين واستخدام مجموعة اختبارات برادفورد لقياس تركيزات البروتين وفقا للبروتوكولات القياسية. لتجميع الفوسفور 32 المسمى جوانوسين pentaphosphate، وتجميع رد فعل Relseq على نطاق صغير في أنبوب المسمار توج كما هو موضح في الجدول واحتضان رد الفعل في ThermoMixer لمدة ساعة واحدة في 37 درجة مئوية وخمس دقائق في 95 درجة مئوية، تليها خمس دقائق على الجليد. في نهاية الحضانات، تدور أسفل البروتين عجلت عن طريق الطرد المركزي ونقل الفوسفور توليفها 32 المسمى جوانوسين pentaphosphate تحتوي على supernatant إلى أنبوب المسمار توج جديدة.لتخليق الفوسفور 32 غوانوزين رباعي الفوسفات، إضافة واحدة ميكرومولار GppA إلى نصف الفوسفور 32 المسمى جوانوسين pentaphosphate المنتج في أنبوب المسمار توج جديدة واحتضان رد الفعل لمدة 10 دقائق في 37 درجة مئوية، وخمس دقائق في 95 درجة مئوية، وخمس دقائق على الجليد. في نهاية الحضانة، تدور أسفل عجل عن طريق الطرد المركزي ونقل الفوسفور 32 المسمى جوانوسين tetraphosphate تحتوي على supernatant إلى أنبوب جديد. لتحليل البروتينات المستهدفة المعزولة، قم بتشغيل ميكرولتر واحد من كل عينة على طبقة رقيقة من لوحة الكروماتوغرافيا باستخدام فوسفات أحادي الوعاء المولي 1.5 كمرحلة متنقلة.بعد التحليل، ضع اللوحة المجففة في مجلد بلاستيكي شفاف وعرض اللوحة على شاشة الفوسفور التخزيني لمدة خمس دقائق قبل تصور وقياس البيانات على صور الفوسفور. لفحص DRaCALA من البروتينات المستهدفة، إضافة 20 ميكرولتر من الليسات بالجملة المذابة إلى الآبار الفردية من لوحة ميكروتيتر V-bottom 95 جيدا وإضافة 2.5 وحدة من Serratia marcescens endonuclease إلى كل بئر. بعد 15 دقيقة في 37 درجة مئوية، ضع الليسات على الجليد لمدة 20 دقيقة.بعد ذلك، مزيج كميات متساوية من الفوسفور 32 المسمى جوانوسين pentaphosphate وguanosine tetraphosphate وإضافة 1X تحلل العازلة واحدة إلى الخليط للحصول على محلول خماسي فوسفات جوانوسين نانومولار أربعة. باستخدام ماصة متعددة القنوات ونصائح ماصة المصفاة، مزيج 10 ميكرولتر من خليط الفوسفات الخماسي جوانوسين مع lysate الخلية لاحتضان لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. في نهاية الحضانة، اغسل أداة دبوس 96X ثلاث مرات في محلول 0.01٪ من المنظفات غير الأيونية لمدة 30 ثانية، تليها 30 ثانية من التجفيف على منشفة ورقية لكل غسل قبل وضع أداة الدبوس في لوحة العينة ذات 96 بئرا.بعد 30 ثانية، ارفع أداة الدبوس مباشرة وضعها مباشرة على غشاء نيتروسيلولوس لمدة 30 ثانية. بعد خمس دقائق من التجفيف، ضع غشاء النيتروسليلوز في مجلد بلاستيكي شفاف لتعرض شاشة الفوسفور التخزيني والتصور عن طريق التصوير الفوسفوري كما هو موضح. لتحديد وتحديد البروتينات المستهدفة المحتملة، في برنامج التحليل المرتبط بصور الفوسفور، افتح ملف الجل للوحات المرئية.لتعريف المواقع التي سيتم تحليلها، استخدم دالة تحليل الصفيف لإعداد عمود 12 بواسطة شبكة صف ثمانية. لتحديد الحافة الخارجية لنقاط الثقب، حدد الدوائر الكبيرة، واصدر وحدة التخزين بالإضافة إلى الخلفية والمنطقة من الدوائر الكبيرة المحددة إلى جدول بيانات. لتحديد النقاط الداخلية الصغيرة، قم بالحجم أسفل الدوائر المحددة، واصدر وحدة التخزين بالإضافة إلى الخلفية والمنطقة من الدوائر الصغيرة المحددة وحفظ جميع البيانات في جدول البيانات.دوائر الموقف إلى التداخل مع البقع حسب الضرورة، تغيير حجم أكبر قليلا من البقع الفعلية. استخدم المعادلة لحساب الكسور الربط في جدول البيانات ورسم البيانات. ثم تحديد البروتينات ملزمة المحتملة في الآبار التي تظهر كسور ملزمة عالية بالمقارنة مع غالبية الآبار الأخرى.في هذا التحليل التمثيلي، يمكن ملاحظة لوحة ذات إشارات ربط خلفية منخفضة نسبيا في معظم الآبار. أظهرت إشارة الربط الإيجابية في بئر H3 كسرا ملزما أعلى بكثير من ذلك الذي لوحظ للأبار الأخرى بسبب الإفراط في التعبير عن بروتين جوانوسين الخماسي الفوسفات الملزم Hpt. وفي اللوحات التمثيلية، أظهرت عدة آبار إشارات ربط خلفية أعلى نسبيا كما تشير إلى ذلك النقاط الداخلية القوية نسبيا التي لوحظت في العديد من الآبار، فضلا عن الكسور الملزمة العالية باستمرار التي لوحظت بعد القياس الكمي.وتجدر الإشارة إلى أن بعض الأهداف أعطت أيضا كسورا ملزمة متغيرة، مثل الإيجابيات الزائفة. ولتوضيح المزيد، استخدم الباحثون البروتينات النقية لاختبار الربط مرة أخرى. بمجرد تحديد البروتينات المستهدفة ، يمكن للمرء تنقيتها إلى التجانس وتأكيد قوة التفاعل وخصوصية باستخدام إما DRaCALA ، قياس السعرات الحرارية المعايرة ، أو طرق أخرى.إن تحديد البروتينات المستهدفة لجزيئات الإشارات الصغيرة يمهد الطريق لفهم متعمق للأدوار الناشئة من الفوعة البكتيرية إلى البيولوجيا البشرية.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay (DRaCALA)

Identification of Small Molecule-binding Proteins in a Native Cellular Environment by Live-cell Photoaffinity Labeling

تحديد البروتينات ملزمة جزيء صغير في الخلوي البيئة الأصلية التي تعيش خلية Photoaffinity وصفها

Identifying the molecular target(s) of small molecules is a challenging but necessary step towards understanding their mechanism of action. While several ...

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

طريقة لتحديد الصغيرة جزيء مثبطات التفاعل البروتين البروتين بين HCN1 وTRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Measuring Biomolecular DSC Profiles with Thermolabile Ligands to Rapidly Characterize Folding and Binding Interactions

قياس الملامح الجزيئية البيولوجية DSC مع يغاندس ثيرمولابيلي لوصف سرعة قابلة للطي والربط التفاعلات

Differential scanning calorimetry (DSC) is a powerful technique for quantifying thermodynamic parameters governing biomolecular folding and binding ...

Nitrogen Cavitation and Differential Centrifugation Allows for Monitoring the Distribution of Peripheral Membrane Proteins in Cultured Cells

التجويف النيتروجين والطرد المركزي التفاضلي يسمح بمراقبة توزيع البروتينات الغشاء المحيطي في الخلايا المستزرعة

Cultured cells are useful for studying the subcellular distribution of proteins, including peripheral membrane proteins. Genetically encoded fluorescently ...

Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

كشف الفسفرة Rab10 بالنشاط LRRK2 باستخدام مخزونات النشر الاستراتيجي-الصفحة مع علامة ربط الفوسفات

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

Capturing the Interaction Kinetics of an Ion Channel Protein with Small Molecules by the Bio-layer Interferometry Assay

التقاط حركية التفاعل البروتين قناة أيون مع جزيئات صغيرة بمقايسة التداخلي بيو-طبقة

The bio-layer interferometry (BLI) assay is a valuable tool for measuring protein-protein and protein-small molecule interactions. Here, we first describe ...

Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain

الأسلوب كفاءة ريفولدينج وتنقية ليجند تشيموريسيبتور ملزمة المجال

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be ...

Detection of Small GTPase Prenylation and GTP Binding Using Membrane Fractionation and  GTPase-linked Immunosorbent Assay

الكشف عن برينيليشن جتباسي صغيرة وأنشئ ملزمة باستخدام تجزئة غشاء ومقايسة الممتز GTPase مرتبطة

The Rho GTPase family belongs to the Ras superfamily and includes approximately 20 members in humans. Rho GTPases are important in the regulation of ...

Analysis of AtHIRD11 Intrinsic Disorder and Binding Towards Metal Ions by Capillary Gel Electrophoresis and Affinity Capillary Electrophoresis

تحليل AtHIRD11 اضطرابات جوهرية وملزمة تجاه أيونات المعادن بالتفريد جل الشعرية وتقارب التفريد الشعرية

Plants are strongly dependent on their environment. In order to adjust to stressful changes (e.g., drought and high salinity), higher plants evolve ...

A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors

تكييف شبه عالي الإنتاجية لفحص ATPase المقترن بـ NADH لفحص مثبطات الجزيئات الصغيرة

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would ...