Name: identifying the binding proteins of small ligands with the differential radial capillary action of ligand assay (dracala)
Uploaded: 2021-03-19T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay DRaCALA at JoVE.com

Arbejdet støttes af et NNF-projekttilskud (NNF19OC0058331) til YEZ og EU's Horizon 2020-forsknings- og innovationsprogram under Marie Skłodowska-Curie-tilskudsaftalen (Nº 801199) til MLS.
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62331/62331img1.jpg">

1. Fremstilling af lysater af hele celler
<ol><li>E. coli K-12 ASKA ORFeome-opsamlingsstammernepodes 15 til 1,5 mL Lysogeny bouillon (LB), der indeholder 25 μg/mL chloramphenicol i 96-godt dybe brøndplader. Der tilstøses natten over (O/N) i 18 timer ved 30 °C med omrystning ved 160 omdrejninger i minuttet. Den næste dag tilsættes isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) (endelig 0,5 mM) til O/N-kulturerne for at fremkalde proteinudtryk ved 30 °C i 6 timer.</li>
	<li>Pellet c...

<ol>
	<li>Kalia, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleotide,+c-di-GMP,+c-di-AMP,+cGMP,+cAMP,+(p)ppGpp+signaling+in+bacteria+and+implications+in+pathogenesis.">Nucleotide, c-di-GMP, c-di-AMP, cGMP, cAMP, (p)ppGpp signaling in bacteria and implications in pathogenesis.</a> Chemical Society Reviews. 42 (1), 305-341 (2013).</li><li>Camilli, A., Bassler, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+small-molecule+signaling+pathways.">Bacterial small-molecule signaling pathways.</a> Science. 311 (5764), 1113-1116 (2006).</li><li>Luo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cAMP+capture+compound+mass+spectrometry+as+a+novel+tool+for+targeting+cAMP-binding+proteins:+from+protein+kinase+A+to+potassium/sodium+hyperpolarization-activated+cyclic+nucleotide-gated+channels.">The cAMP capture compound mass spectrometry as a novel tool for targeting cAMP-binding proteins: from protein kinase A to potassium/sodium hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channels.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 8 (12), 2843-2856 (2009).</li><li>Nesper, J., Reinders, A., Glatter, T., Schmidt, A., Jenal, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+capture+compound+for+the+identification+and+analysis+of+cyclic+di-GMP+binding+proteins.">A novel capture compound for the identification and analysis of cyclic di-GMP binding proteins.</a> Journal of Proteomics. 75 (15), 4874-4878 (2012).</li><li>Laventie, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capture+compound+mass+spectrometry--a+powerful+tool+to+identify+novel+c-di-GMP+effector+proteins.">Capture compound mass spectrometry--a powerful tool to identify novel c-di-GMP effector proteins.</a> Journal of Visual Experiments. (97), e51404 (2015).</li><li>Roelofs, K. G., Wang, J., Sintim, H. O., Lee, V. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+radial+capillary+action+of+ligand+assay+for+high-throughput+detection+of+protein-metabolite+interactions.">Differential radial capillary action of ligand assay for high-throughput detection of protein-metabolite interactions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (37), 15528-15533 (2011).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+adaptation+of+the+essential+tRNA+methyltransferase+TrmD+to+the+signaling+molecule+3+',5+'-cAMP+in+bacteria.">Evolutionary adaptation of the essential tRNA methyltransferase TrmD to the signaling molecule 3 ',5 '-cAMP in bacteria.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (1), 313-327 (2017).</li><li>Corrigan, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+identification+of+conserved+bacterial+c-di-AMP+receptor+proteins.">Systematic identification of conserved bacterial c-di-AMP receptor proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (22), 9084-9089 (2013).</li><li>Roelofs, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+identification+of+cyclic-di-GMP+binding+proteins+in+Vibrio+cholerae+reveals+a+novel+class+of+cyclic-di-GMP-binding+ATPases+associated+with+type+II+secretion+systems.">Systematic identification of cyclic-di-GMP binding proteins in Vibrio cholerae reveals a novel class of cyclic-di-GMP-binding ATPases associated with type II secretion systems.</a> PLoS Pathogen. 11 (10), 1005232 (2015).</li><li>Fang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GIL,+a+new+c-di-GMP-binding+protein+domain+involved+in+regulation+of+cellulose+synthesis+in+enterobacteria.">GIL, a new c-di-GMP-binding protein domain involved in regulation of cellulose synthesis in enterobacteria.</a> Molecular Microbiology. 93 (3), 439-452 (2014).</li><li>Corrigan, R. M., Bellows, L. E., Wood, A., Grundling, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ppGpp+negatively+impacts+ribosome+assembly+affecting+growth+and+antimicrobial+tolerance+in+Gram-positive+bacteria.">ppGpp negatively impacts ribosome assembly affecting growth and antimicrobial tolerance in Gram-positive bacteria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1710-1719 (2016).</li><li>Zhang, Y., Zbornikova, E., Rejman, D., Gerdes, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+(p)ppGpp+binding+and+metabolizing+proteins+of+Escherichia+coli.">Novel (p)ppGpp binding and metabolizing proteins of Escherichia coli.</a> Mbio. 9 (2), 02188 (2018).</li><li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nucleotide+pGpp+acts+as+a+third+alarmone+in+Bacillus,+with+functions+distinct+from+those+of+(p)+ppGpp.">The nucleotide pGpp acts as a third alarmone in Bacillus, with functions distinct from those of (p) ppGpp.</a> Nature Communications. 11 (1), 5388 (2020).</li><li>Orr, M. W., Lee, V. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+radial+capillary+action+of+ligand+assay+(DRaCALA)+for+high-throughput+detection+of+protein-metabolite+interactions+in+bacteria.">Differential radial capillary action of ligand assay (DRaCALA) for high-throughput detection of protein-metabolite interactions in bacteria.</a> Methods in Molecular Biology. 1535, 25-41 (2017).</li><li>Kitagawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+set+of+ORF+clones+of+Escherichia+coli+ASKA+library+(A+complete+Set+of+E.+coli+K-12+ORF+archive):+Unique+resources+for+biological+research.">Complete set of ORF clones of Escherichia coli ASKA library (A complete Set of E. coli K-12 ORF archive): Unique resources for biological research.</a> DNA Research. 12 (5), 291-299 (2005).</li><li>Hochstadt-Ozer, J., Cashel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+purine+utilization+in+bacteria.+V.+Inhibition+of+purine+phosphoribosyltransferase+activities+and+purine+uptake+in+isolated+membrane+vesicles+by+guanosine+tetraphosphate.">The regulation of purine utilization in bacteria. V. Inhibition of purine phosphoribosyltransferase activities and purine uptake in isolated membrane vesicles by guanosine tetraphosphate.</a> Journal of Biological Chemistry. 247 (21), 7067-7072 (1972).</li><li>Zhang, Y. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p)ppGpp+regulates+a+bacterial+nucleosidase+by+an+allosteric+two-domain+switch.">p)ppGpp regulates a bacterial nucleosidase by an allosteric two-domain switch.</a> Molecular Cell. 74 (6), 1239-1249 (2019).</li><li>Wang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity-based+capture+and+identification+of+protein+effectors+of+the+growth+regulator+ppGpp.">Affinity-based capture and identification of protein effectors of the growth regulator ppGpp.</a> Nature Chemical Biology. 15 (2), 141-150 (2019).</li></ol>

Et af de kritiske skridt i udførelsen af DRaCALA screening er at opnå gode hele celle lysater. For det første skal de testede proteiner produceres i store mængder og i opløselige former. For det andet skal cellernes lysis være komplet, og lysatets viskositet skal være minimal. Inddragelsen af lysozym og brugen af tre cyklusser af fryse-optøning er ofte nok til at lyse celler helt. Det frigivne kromosomale DNA gør imidlertid lysatet tyktflydende og genererer et højt baggrundsbindingssignal, hvilket resulterer i ...

Bakterier bruger flere små signalmolekyler til at tilpasse sig konstant skiftende miljøer1,2. For eksempel, autoinducers, N-acylhomoserine lactones og deres modificerede oligopeptider, mægle intercellulær kommunikation mellem bakterier til at koordinere befolkningens adfærd, et fænomen kendt som quorum sensing2. En anden gruppe af små signalmolekyler er NSM'erne, herunder det almindeligt undersøgte cykliske adenosinmonophosphat (cAMP), cyklisk di-AMP, cyklisk di-guanosinmonophosphat (cyklisk di-GMP) og guanosinpenta- og tetraphosphater (p)ppGpp1. Bakterier producerer disse NSMs som en reaktion på en række forskellige stress betingelser. Når de er produceret, binder disse molekyler sig til deres målproteiner og regulerer flere forskellige fysiologiske og metaboliske veje for at klare de stødte belastninger og forbedre bakterieoverlevelser. Derfor er identifikation af målproteinerne en uundgåelig forudsætning for at dechifrere de molekylære funktioner i disse små molekyler.
Det seneste årti har været vidne til et boom af viden om disse små signalmolekyler, hovedsageligt på grund af flere tekniske innovationer, der afslørede målproteinerne i disse små molekyler. Disse omfatter fangst sammensatte teknik3,4,5, og differentiale radial kapillær virkning af ligand assay (DRaCALA)6, der skal drøftes i dette papir.
Opfundet af Vincent Lee og kolleger i 20116, DRaCALA anvender muligheden for en nitrocellulose membran til differentieret sequester fri og protein-bundet ligands. Molekyler som proteiner kan ikke diffuse på en nitrocellulosemembran, mens små ligands, såsom NSMs, er i stand til. Ved at blande NSM (f.eks.ppGpp) med det protein, der skal testes, og spotte dem på membranen, kan der forventes to scenarier (figur 1): Hvis (p)ppGpp binder sig til proteinet, vil den radiolabelerede (p)ppGpp blive bevaret i midten af stedet af proteinet og vil ikke sprede udad, hvilket giver en intens lille prik (dvs. stærkt radioaktivt signal) under en fosformager. Men hvis (p)ppGpp ikke binder sig til proteinet, vil det spredes frit udad for at producere et stort sted med ensartet baggrundsradioaktivt signal.
Desuden kan DRaCALA detektere samspillet mellem et lille molekyle og et upurificeret protein i en hel celle lysat, hvis proteinet er til stede i en tilstrækkelig mængde. Denne enkelhed gør det muligt at bruge DRaCALA til hurtigt at identificere proteinmål ved hjælp af et ORFeome-udtryksbibliotek. Målproteiner af cAMP7, cyklisk di-AMP8, cyklisk di-GMP9,10og (p)ppGpp11,12,13 er systematisk blevet identificeret ved hjælp af DRaCALA. Denne videoartikel bruger (p)ppGpp som et eksempel til at demonstrere og beskrive de kritiske trin og overvejelser i forbindelse med udførelsen af en vellykket DRaCALA-screening. Bemærk, at en mere grundig beskrivelse af DRaCALA14 anbefales stærkt at læse i kombination med denne artikel, før du udfører DRaCALA.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62331/62331fig01.jpg"> Figur 1: Princippet om DRaCALA. (A) Skematisk over DRaCALA-analysen. Se teksten for at få flere oplysninger. (B) Kvantificering og beregning af bindingsfraktionen. Se teksten for at få flere oplysninger. Kort sagt vil DRaCALA pletter blive analyseret ved at tegne to cirkler, der afgrænser hele stedet og den indre mørke prik(dvs.den bevarede (p) ppGpp på grund af bindingen af det testede protein). Det specifikke bindingssignal er indercirklens (S1) radioaktive signal efter fratrækning af det ikke-specifikke baggrundssignal (beregnet ved A1 × ((S2-S1)/(A2-A1))). Bindingsfraktionen er det specifikke bindingssignal divideret med det samlede radioaktive signal (S2). Forkortelser: DRaCALA = Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay; p)ppGpp = guanosinpenta- og tetraphosphater RT = stuetemperatur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62331/62331fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>32P-&#945;-GTP</td>
			<td>Perkinelmer</td>
			<td>BLU006X250UC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 x pin tool</td>
			<td>V&#38;P Scientific</td>
			<td>VP 404</td>
			<td>96 Bolt Replicator, on 9 mm centers, 4.2 mm Bolt Diameter, 24 mm long</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well V-bottom microtiter plate</td>
			<td>Sterilin</td>
			<td>MIC9004</td>
			<td>Sterilin Microplate V Well 611V96</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>OXOID - Thermo Fisher</td>
			<td>LP0011</td>
			<td>Agar no. 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ASKA collection strain</td>
			<td>NBRP, SHIGEN, JAPAN</td>
			<td></td>
			<td>Ref: DNA Research, Volume 12, Issue 5, 2005, Pages 291&#8211;299. https://doi.org/10.1093/dnares/dsi012</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>E1014-25KU</td>
			<td>genetically engineered endonuclease from Serratia marcescens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford Protein Assay Dye</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>5000006</td>
			<td>Reagent Concentrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D8418</td>
			<td>&#8805;99.9%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase 1</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>DN25-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gel filtration10x300 column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28990944</td>
			<td>contains 20% ethanol as preservative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>122329.1214</td>
			<td>Glycerol 87% for analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypercassette</td>
			<td>Amersham</td>
			<td>RPN 11647</td>
			<td>20 x 40 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>56750</td>
			<td>puriss. p.a., &#8805; 99.5% (GC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IP Storage Phosphor Screen</td>
			<td>FUJIFILM</td>
			<td>28956474</td>
			<td>BAS-MS 2040 20x 40 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>I6758</td>
			<td>Isopropyl &#946;-D-thiogalactoside</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysogeny Broth (LB)</td>
			<td>Invitrogen - Thermo Fisher</td>
			<td>12795027</td>
			<td>Miller&#39;s LB Broth Base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>L4949</td>
			<td>from chicken egg white; BioUltra, lyophilized powder, &#8805;98%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 (Magnesium chloride)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>208337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliQ water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ultrapure water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multichannel pipette</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>4661110</td>
			<td>F1 - Clip Tip; 1-10 ul, 8 x channels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>27810</td>
			<td>AnalaR NORMAPUR, ACS, Reag. Ph. Eur.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Agarose</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>30230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose Blotting Membrane</td>
			<td>Amersham Protran</td>
			<td>10600003</td>
			<td>Premium 0.45 um 300 mm x 4 m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>OXOID - Thermo Fisher</td>
			<td>BR0014G</td>
			<td>Phosphate buffered saline (Dulbecco A), Tablets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG3350 (Polyethylene glycol 3350)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>202444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>93482</td>
			<td>Phenylmethanesulfonyl fluoride solution - 0.1 M in ethanol (T)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphor-imager</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28955809</td>
			<td>Typhoon FLA-7000 Phosphor-imager</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips, filtered</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>94410040</td>
			<td>ClipTip 12.5 &#956;l nonsterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-Prep Chromatography column</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7311550</td>
			<td>polypropylene chromatography column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor Mini</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>A32955</td>
			<td>Tablets, EDTA-free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>screw cap tube</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3488</td>
			<td>Microcentifuge Tubes, 2.0 ml with screw cap, nonsterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SLS 96-deep Well plates</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>780285</td>
			<td>MASTERBLOCK, 2 ML, PP, V-Bottom, Natural</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spin column</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC500396</td>
			<td>Amicon Ultra -0.5 ml Centrifugal Filters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5382000015</td>
			<td>Thermomixer C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC plate (PEI-cellulose F TLC plates)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>105579</td>
			<td>DC PEI-cellulose F (20 x 20 cm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>BP152</td>
			<td>Tris Base for Molecular Biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P1379</td>
			<td>viscous non-ionic detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>M3148</td>
			<td>99% (GC/titration)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identifying the binding proteins of small ligands with the differential radial capillary action of ligand assay (dracala)

Det seneste årti har oplevet enorme fremskridt i forståelsen af små signalmolekyler i bakteriel fysiologi. Især er målproteinerne fra flere nukleotid-afledte sekundære budbringere (NSMs) systematisk blevet identificeret og undersøgt i modelorganismer. Disse resultater skyldes hovedsagelig udviklingen af flere nye teknikker, herunder indfangningsblandingsteknikken og den differentierede radiale kapillærvirkning af ligand assay (DRaCALA), som blev brugt til systematisk at identificere målproteiner af disse små molekyler. Dette papir beskriver brugen af NSMs, guanosine penta- og tetraphosphater (p)ppGpp, som et eksempel og video demonstration af DRaCALA teknik. Ved hjælp af DRaCALA blev 9 ud af 20 kendte og 12 nye målproteiner af (p)ppGpp identificeret i modelorganismen, Escherichia coli K-12, hvilket viser kraften i denne analyse. I princippet kan DRaCALA bruges til at studere små ligands, der kan mærkes af radioaktive isotoper eller fluorescerende farvestoffer. De kritiske trin, fordele og ulemper ved DRaCALA diskuteres her for yderligere anvendelse af denne teknik.

Efter ovennævnte protokol vil typisk give to typer resultater (Figur 3).
Figur 3A viser en plade med relativt lave baggrundsbindingssignaler (bindefraktioner < 0,025) fra de fleste brønde. Det positive bindingssignal fra brønden H3 giver en bindende brøkdel af ~ 0,35, der er meget højere end den, der observeres for de andre brønde. Selv uden kvantificering, godt H3 er bemærkelsesværdigt, tyder på, at et mål protein udtrykt i...

Watch this Scientific Journal Video about Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay DRaCALA at JoVE.com

Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay DRaCALA

Den differentierede Radial Kapillæraktion fra Ligand Assay (DRaCALA) kan bruges til at identificere små ligand bindende proteiner i en organisme ved hjælp af et ORFeome-bibliotek.

Identifikation af bindingsproteiner fra små ligands med Ligand Assays differentierede radiale kapillærhandling (DRaCALA)

The past decade has seen tremendous progress in the understanding of small signaling molecules in bacterial physiology. In particular, the target proteins ...

Små signalmolekyler er rettet mod forskellige effektorproteiner for at kontrollere bakteriel virulens og menneskelig biologi. Men disse effector proteiner er udfordrende at identificere. Som et systembiologisk værktøj giver DRaCALA mulighed for en gennemførlig, hurtig og meget følsom identifikation af de ukendte effektorproteiner ved hjælp af et OVium-bibliotek.DRaCALA kan bruges til at studere ethvert lille signalmolekyle, så længe det kan mærkes med enten radioaktiv isotop eller fluorescerende farvestoffer. Start med at vaccinere E.coli i 1,5 milliliter LB suppleret med 25 mikrogram pr milliliter chloramphenicol i hver brønd på 96-godt dyb brønd plader til en overnatning inkubation ved 30 grader Celsius og 160 rotationer i minuttet. Næste morgen skal du behandle natten kulturer med 500 mikromolar IPTG i seks timer ved 30 grader Celsius for at fremkalde proteinudtryk.I slutningen af inkubationen pellet cellerne ved centrifugering, fjern supernatanten og frys prøverne ved minus 80 grader Celsius. For at starte lysis, genbruges pellets i 150 mikroliter af lysis buffer en per brønd for en 30-minutters inkubation ved minus 80 grader Celsius før optøning cellerne i 20 minutter ved 37 grader Celsius. Lysatet skal derefter opbevares ved minus 80 grader Celsius før brug.For at fuldende lysis af celler med overekspresserede proteiner, genbruges prøverne i 40 milliliter iskold lysis buffer to og sonicate prøverne på en 60%amplitude på to sekunder på fire sekunder ud i otte minutter, derefter rydde lysater ved centrifugering. Mens prøverne centrifuges, tilsættes 500 mikroliter homogeniseret nikkel-NTA-harpiks til en stående polypropylenkromatografikolonne. Efter 15 minutter vaskes den afregnede harpiks to gange med 15 milliliter ultrapure vand og en gang med 15 milliliter lysis buffer to.Ved afslutningen af centrifugeringen skal den ryddede lysat-supernatant indlæses på kolonnen. Når alt lysatet er strømmet gennem kolonnen, skal kolonnen vaskes med 30 milliliter vaskebuffer. For at elute proteinerne tilsættes 400 mikrolitervolumen af elueringsbuffer til kolonnen og gentages eluer tre gange.En anden 300 mikroliter volumen af eluering buffer til at gentage eluering tre gange og kombinere eluted proteiner i et sidste volumen på 700 mikroliter. Til gelfiltrering af den eluterede prøve skal hele mængden af elueret protein på kolonnen efter vask af en størrelsesudelukkelseskolonne med 25 milliliter frisklavet gelfiltreringsbuffer indlæses på kolonnen ved hjælp af en 500 mikrolitersløjfe. Kør ved 500 mikroliter i minuttet og indsamle to til tre 500 mikroliter volumen fraktioner af de respektive proteiner.Brug derefter individuelle spinsøjler til at koncentrere hvert protein og bruge Bradford-analysesættet til at måle proteinkoncentrationerne i henhold til standardprotokollerne. For at syntetisere fosfor 32 mærket guanosinpentaphosphat, samle en lille Relseq reaktion i en skrue udjævnet rør som skitseret i tabellen og inkubere reaktionen i en ThermoMixer i en time ved 37 grader Celsius og fem minutter ved 95 grader Celsius, efterfulgt af fem minutter på is. Ved afslutningen af inkubationerne skal du dreje det udfældede protein ned ved centrifugering og overføre det syntetiserede fosfor 32 mærket guanosinpentaphosphat, der indeholder supernatant, til et nyt skrueskallet rør.For fosfor 32 guanosinmethanmethanphosphatsyntese tilsættes en mikromolar GppA til halvdelen af fosfor 32 mærket guanosinpentaphosphatprodukt i et nyt skruekappet rør og inkuber reaktionen i 10 minutter ved 37 grader Celsius, fem minutter ved 95 grader Celsius og fem minutter på is. Ved afslutningen af inkubationen skal bundfaldet spindes ned ved centrifugering, og fosfor 32 mærket guanosinmethanmethanphosphat, der indeholder supernatant, overføres til et nyt rør. For at analysere de isolerede målproteiner skal du køre en mikroliter af hver prøve på en tynd lagkromatografiplade ved hjælp af 1,5 molar monopotassiumphosphat som den mobile fase.Efter analysen anbringes den tørrede plade i en gennemsigtig plastmappe, og pladen udsættes for en opbevaringsphosphorskærm i fem minutter, før dataene visualiseres og kvantificeres på en fosforbilled. Til DRaCALA screening af målproteiner tilsættes 20 mikroliter af optøede engros lysater til individuelle brønde af en 95-brønds V-bund mikrotiter plade og tilsæt 2,5 enheder serratia marcescens endonuclease til hver brønd. Efter 15 minutter ved 37 grader Celsius skal lysaterne placeres på is i 20 minutter.Dernæst blandes lige store mængder fosfor 32 mærket guanosinpentaphosphat og guanosintetrofat, og der tilsættes 1X lysis buffer en til blandingen for at opnå en fire nanomolar guanosine pentaphosphatopløsning. Ved hjælp af en multikanalpipette og filtrerede pipettespidser blandes 10 mikroliter af guanosinpentaphosphatblandingen med cellelysatet for en fem minutters inkubation ved stuetemperatur. Ved afslutningen af inkubationen vaskes et 96X pinværktøj tre gange i en 0,01%-opløsning af non-ionisk vaskemiddel i 30 sekunder efterfulgt af 30 sekunders tørring på et køkkenrulle pr. Vask, før du placerer pinværktøjet i prøvepladen på 96 brønde.Efter 30 sekunder løftes pinværktøjet lige op og placeres lige ned på en nitrocellulosemembran i 30 sekunder. Efter fem minutters tørring skal nitrocellulosemembranen placeres i en gennemsigtig plastmappe til opbevaring af fosforskærmeksponering og visualisering ved fosforbilleddannelse som påvist. For at kvantificere og identificere potentielle målproteiner skal du åbne gelfilen på de visualiserede plader i den analysesoftware, der er forbundet med fosforbilledet.Hvis du vil definere de pletter, der skal analyseres, skal du bruge arrayanalysefunktionen til at oprette en 12-kolonne med otte rækkegitter. Hvis du vil afgrænse den ydre kant af hulpletterne, skal du definere store cirkler, eksportere lydstyrken plus baggrunden og arealet af de definerede store cirkler til et regneark. Hvis du vil afgrænse de små inderste prikker, skal du tilpasse størrelsen på de definerede cirkler, eksportere lydstyrken plus baggrunden og området for de definerede små cirkler og gemme alle dataene i regnearket.Placer cirkler for at overlappe med pletter efter behov, og gør de lidt større end de faktiske pletter mindre. Brug ligningen til at beregne bindingsbrøkene i regnearket og afbilde dataene. Derefter identificere de potentielle bindende proteiner i brøndene, der viser høje bindende fraktioner i forhold til de fleste andre brønde.I denne repræsentative analyse kan en plade med relativt lave baggrundsbindingssignaler i de fleste brønde observeres. Det positive bindingssignal i godt H3 udviste en bindende fraktion, der var meget højere end den, der blev observeret for de andre brønde på grund af overekspression af guanosinpentaphosphatbindingsprotein hpt. I de repræsentative plader viste flere brønde et relativt højere baggrundsbindingssignal som angivet af de relativt stærke indre prikker observeret i mange brønde, såvel som de konsekvent høje bindingsfraktioner observeret efter kvantificering.Især gav nogle mål også variable bindende fraktioner, såsom de falske positiver. For yderligere at præcisere, forskere brugte rensede proteiner til at teste bindingen igen. Når målproteinerne er identificeret, kan man rense dem for homogenitet og bekræfte interaktionsstyrke og specificitet ved hjælp af enten DRaCALA, isotermisk titreringskalorimetri eller andre metoder.Identifikation af målproteiner af små signalmolekyler baner vejen for en dybdegående forståelse af de roller, der opstår fra bakteriel virulens til menneskelig biologi.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay (DRaCALA)

Identification of Small Molecule-binding Proteins in a Native Cellular Environment by Live-cell Photoaffinity Labeling

Identifikation af små molekyler-bindende proteiner i en Native Cellular Environment af live-cell fotoaffinitetsmærkning

Identifying the molecular target(s) of small molecules is a challenging but necessary step towards understanding their mechanism of action. While several ...

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Fremgangsmåde til at identificere småmolekylære inhibitorer af protein-protein-vekselvirkning mellem HCN1 og TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Measuring Biomolecular DSC Profiles with Thermolabile Ligands to Rapidly Characterize Folding and Binding Interactions

Måling af Biomolekylær DSC profiler med termolabile ligander til hurtigt karakterisere foldning og bindende interaktioner

Differential scanning calorimetry (DSC) is a powerful technique for quantifying thermodynamic parameters governing biomolecular folding and binding ...

Nitrogen Cavitation and Differential Centrifugation Allows for Monitoring the Distribution of Peripheral Membrane Proteins in Cultured Cells

Kvælstof kavitation og differentieret centrifugering giver mulighed for overvågning fordelingen af perifere Membranproteiner i kulturperler celler

Cultured cells are useful for studying the subcellular distribution of proteins, including peripheral membrane proteins. Genetically encoded fluorescently ...

Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

Rab10 fosforylering påvisning af LRRK2 aktivitet ved hjælp af SDS-PAGE med en fosfat-bindende Tag

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

Capturing the Interaction Kinetics of an Ion Channel Protein with Small Molecules by the Bio-layer Interferometry Assay

Indfange interaktion kinetik af en Ion-kanal Protein med små molekyler af Bio-lag interferometri Assay

The bio-layer interferometry (BLI) assay is a valuable tool for measuring protein-protein and protein-small molecule interactions. Here, we first describe ...

Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain

Metode til effektiv hvorved man genfolder og rensning af Chemoreceptor Ligand bindende domæne

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be ...

Detection of Small GTPase Prenylation and GTP Binding Using Membrane Fractionation and  GTPase-linked Immunosorbent Assay

Påvisning af små GTPase Prenylation og GTP bindende ved hjælp af membran fraktionering og GTPase-forbundet Immunosorbent Assay

The Rho GTPase family belongs to the Ras superfamily and includes approximately 20 members in humans. Rho GTPases are important in the regulation of ...

Analysis of AtHIRD11 Intrinsic Disorder and Binding Towards Metal Ions by Capillary Gel Electrophoresis and Affinity Capillary Electrophoresis

Analyse af AtHIRD11 iboende lidelse og bindende mod metalioner af kapillar gelelektroforese og affinitet kapillær elektroforese

Plants are strongly dependent on their environment. In order to adjust to stressful changes (e.g., drought and high salinity), higher plants evolve ...

A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors

En semi-High-gennemløb tilpasning af NADH-koblede ATPase assay til screening små molekyle hæmmere

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would ...