Name: identifying the binding proteins of small ligands with the differential radial capillary action of ligand assay (dracala)
Uploaded: 2021-03-19T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay DRaCALA at JoVE.com

Het werk wordt ondersteund door een NNF-projectsubsidie (NNF19OC0058331) aan YEZ en het onderzoeks- en innovatieprogramma Horizon 2020 van de Europese Unie in het kader van de Marie Skłodowska-Curie-subsidieovereenkomst (Nº 801199) aan MLS.
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62331/62331img1.jpg">

1. Bereiding van hele cellysaten
<ol><li>Ent de E. coli K-12 ASKA ORFeome collectie stammen15 in 1,5 ml Lysogeney bouillon (LB) met 25 μg/ml chlooramfenicol in 96-put diepe putplaten. Laat 's nachts (O/N) groeien gedurende 18 uur bij 30 °C met schudden bij 160 tpm. Voeg de volgende dag isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) (laatste 0,5 mM) toe aan de O/N-culturen om gedurende 6 uur eiwitexpressie bij 30 °C te induceren.</li>
	<li>Pelletcellen bij 500 x g gedurende 10...

<ol>
	<li>Kalia, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleotide,+c-di-GMP,+c-di-AMP,+cGMP,+cAMP,+(p)ppGpp+signaling+in+bacteria+and+implications+in+pathogenesis.">Nucleotide, c-di-GMP, c-di-AMP, cGMP, cAMP, (p)ppGpp signaling in bacteria and implications in pathogenesis.</a> Chemical Society Reviews. 42 (1), 305-341 (2013).</li><li>Camilli, A., Bassler, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+small-molecule+signaling+pathways.">Bacterial small-molecule signaling pathways.</a> Science. 311 (5764), 1113-1116 (2006).</li><li>Luo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cAMP+capture+compound+mass+spectrometry+as+a+novel+tool+for+targeting+cAMP-binding+proteins:+from+protein+kinase+A+to+potassium/sodium+hyperpolarization-activated+cyclic+nucleotide-gated+channels.">The cAMP capture compound mass spectrometry as a novel tool for targeting cAMP-binding proteins: from protein kinase A to potassium/sodium hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channels.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 8 (12), 2843-2856 (2009).</li><li>Nesper, J., Reinders, A., Glatter, T., Schmidt, A., Jenal, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+capture+compound+for+the+identification+and+analysis+of+cyclic+di-GMP+binding+proteins.">A novel capture compound for the identification and analysis of cyclic di-GMP binding proteins.</a> Journal of Proteomics. 75 (15), 4874-4878 (2012).</li><li>Laventie, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capture+compound+mass+spectrometry--a+powerful+tool+to+identify+novel+c-di-GMP+effector+proteins.">Capture compound mass spectrometry--a powerful tool to identify novel c-di-GMP effector proteins.</a> Journal of Visual Experiments. (97), e51404 (2015).</li><li>Roelofs, K. G., Wang, J., Sintim, H. O., Lee, V. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+radial+capillary+action+of+ligand+assay+for+high-throughput+detection+of+protein-metabolite+interactions.">Differential radial capillary action of ligand assay for high-throughput detection of protein-metabolite interactions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (37), 15528-15533 (2011).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+adaptation+of+the+essential+tRNA+methyltransferase+TrmD+to+the+signaling+molecule+3+',5+'-cAMP+in+bacteria.">Evolutionary adaptation of the essential tRNA methyltransferase TrmD to the signaling molecule 3 ',5 '-cAMP in bacteria.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (1), 313-327 (2017).</li><li>Corrigan, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+identification+of+conserved+bacterial+c-di-AMP+receptor+proteins.">Systematic identification of conserved bacterial c-di-AMP receptor proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (22), 9084-9089 (2013).</li><li>Roelofs, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+identification+of+cyclic-di-GMP+binding+proteins+in+Vibrio+cholerae+reveals+a+novel+class+of+cyclic-di-GMP-binding+ATPases+associated+with+type+II+secretion+systems.">Systematic identification of cyclic-di-GMP binding proteins in Vibrio cholerae reveals a novel class of cyclic-di-GMP-binding ATPases associated with type II secretion systems.</a> PLoS Pathogen. 11 (10), 1005232 (2015).</li><li>Fang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GIL,+a+new+c-di-GMP-binding+protein+domain+involved+in+regulation+of+cellulose+synthesis+in+enterobacteria.">GIL, a new c-di-GMP-binding protein domain involved in regulation of cellulose synthesis in enterobacteria.</a> Molecular Microbiology. 93 (3), 439-452 (2014).</li><li>Corrigan, R. M., Bellows, L. E., Wood, A., Grundling, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ppGpp+negatively+impacts+ribosome+assembly+affecting+growth+and+antimicrobial+tolerance+in+Gram-positive+bacteria.">ppGpp negatively impacts ribosome assembly affecting growth and antimicrobial tolerance in Gram-positive bacteria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1710-1719 (2016).</li><li>Zhang, Y., Zbornikova, E., Rejman, D., Gerdes, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+(p)ppGpp+binding+and+metabolizing+proteins+of+Escherichia+coli.">Novel (p)ppGpp binding and metabolizing proteins of Escherichia coli.</a> Mbio. 9 (2), 02188 (2018).</li><li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nucleotide+pGpp+acts+as+a+third+alarmone+in+Bacillus,+with+functions+distinct+from+those+of+(p)+ppGpp.">The nucleotide pGpp acts as a third alarmone in Bacillus, with functions distinct from those of (p) ppGpp.</a> Nature Communications. 11 (1), 5388 (2020).</li><li>Orr, M. W., Lee, V. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+radial+capillary+action+of+ligand+assay+(DRaCALA)+for+high-throughput+detection+of+protein-metabolite+interactions+in+bacteria.">Differential radial capillary action of ligand assay (DRaCALA) for high-throughput detection of protein-metabolite interactions in bacteria.</a> Methods in Molecular Biology. 1535, 25-41 (2017).</li><li>Kitagawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+set+of+ORF+clones+of+Escherichia+coli+ASKA+library+(A+complete+Set+of+E.+coli+K-12+ORF+archive):+Unique+resources+for+biological+research.">Complete set of ORF clones of Escherichia coli ASKA library (A complete Set of E. coli K-12 ORF archive): Unique resources for biological research.</a> DNA Research. 12 (5), 291-299 (2005).</li><li>Hochstadt-Ozer, J., Cashel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+purine+utilization+in+bacteria.+V.+Inhibition+of+purine+phosphoribosyltransferase+activities+and+purine+uptake+in+isolated+membrane+vesicles+by+guanosine+tetraphosphate.">The regulation of purine utilization in bacteria. V. Inhibition of purine phosphoribosyltransferase activities and purine uptake in isolated membrane vesicles by guanosine tetraphosphate.</a> Journal of Biological Chemistry. 247 (21), 7067-7072 (1972).</li><li>Zhang, Y. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p)ppGpp+regulates+a+bacterial+nucleosidase+by+an+allosteric+two-domain+switch.">p)ppGpp regulates a bacterial nucleosidase by an allosteric two-domain switch.</a> Molecular Cell. 74 (6), 1239-1249 (2019).</li><li>Wang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity-based+capture+and+identification+of+protein+effectors+of+the+growth+regulator+ppGpp.">Affinity-based capture and identification of protein effectors of the growth regulator ppGpp.</a> Nature Chemical Biology. 15 (2), 141-150 (2019).</li></ol>

Een van de cruciale stappen bij het uitvoeren van DRaCALA-screening is het verkrijgen van goede hele cellysaten. Ten eerste moeten de geteste eiwitten in grote hoeveelheden en in oplosbare vormen worden geproduceerd. Ten tweede moet de lysis van cellen volledig zijn en moet de viscositeit van het lysaat minimaal zijn. De opname van lysozym en het gebruik van drie cycli van vries-dooi zijn vaak genoeg om cellen volledig te lyseren. Het vrijgegeven chromosomale DNA maakt het lysaat echter stroperig en genereert een hoog ac...

Bacteriën gebruiken verschillende kleine signaalmoleculen om zich aan te passen aan constant veranderende omgevingen1,2. Bijvoorbeeld, de auto-inducers, N-acylhomoserine lactones en hun gemodificeerde oligopeptiden, bemiddelen de intercellulaire communicatie tussen bacteriën om populatiegedrag te coördineren, een fenomeen dat bekend staat als quorum sensing2. Een andere groep kleine signaalmoleculen zijn de NSM's, waaronder het veel bestudeerde cyclische adenosinemonofosfaat (cAMP), cyclisch di-AMP, cyclisch di-guanosinemonofosfaat (cyclisch di-GMP) en guanosine penta- en tetrafosfaat (p)ppGpp1. Bacteriën produceren deze NSM's als reactie op verschillende stressomstandigheden. Eenmaal geproduceerd, binden deze moleculen zich aan hun doeleiwitten en reguleren ze verschillende fysiologische en metabolische routes om de ondervonden stress aan te kunnen en de bacteriële overleving te verbeteren. Daarom is identificatie van de doeleiwitten een onvermijdelijke voorwaarde voor het ontcijferen van de moleculaire functies van deze kleine moleculen.
Het afgelopen decennium is getuige geweest van een hausse aan kennis van deze kleine signaalmoleculen, voornamelijk als gevolg van verschillende technische innovaties die de doeleiwitten van deze kleine moleculen onthulden. Deze omvatten de afvangverbindingstechniek3,4,5, en de differentiële radiale capillaire werking van ligandtest (DRaCALA)6 die in dit artikel moet worden besproken.
Uitgevonden door Vincent Lee en collega's in 20116, DRaCALA zet het vermogen van een nitrocellulosemembraan in om differentieel vrije en eiwitgebonden liganden vast te zetten. Moleculen zoals eiwitten kunnen zich niet verspreiden op een nitrocellulosemembraan, terwijl kleine liganden, zoals de NSM's, dat wel kunnen. Door het NSM (bijv.ppGpp ) te mengen met het te testen eiwit en deze op het membraan te spotten, kunnen twee scenario's worden verwacht(figuur 1):Als (p)ppGpp zich aan het eiwit bindt, wordt het radiolabel (p)ppGpp in het midden van de vlek door het eiwit behouden en zal het niet naar buiten diffuus zijn, wat een intens klein puntje geeft (d.w.z. sterk radioactief signaal) onder een fosforimager. Als (p)ppGpp zich echter niet aan het eiwit bindt, zal het vrij naar buiten diffuus zijn om een grote vlek met een uniform radioactief achtergrondsignaal te produceren.
Bovendien kan DRaCALA de interactie tussen een klein molecuul en een ongezuiverd eiwit in een hele cellysaat detecteren als het eiwit in voldoende hoeveelheid aanwezig is. Deze eenvoud maakt het gebruik van DRaCALA mogelijk bij het snel identificeren van eiwitdoelen met behulp van een ORFeome-expressiebibliotheek. Doeleiwitten van cAMP7, cyclische di-AMP8, cyclische di-GMP9,10en (p)ppGpp 11,12,13 zijn systematisch geïdentificeerd met behulp van DRaCALA. Dit videoartikel gebruikt (p)ppGpp als voorbeeld om de kritische stappen en overwegingen bij het uitvoeren van een succesvolle DRaCALA-screening te demonstreren en te beschrijven. Een meer grondige beschrijving van DRaCALA14 wordt ten zeerste aanbevolen om te lezen in combinatie met dit artikel voordat U DRaCALA uitvoert.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62331/62331fig01.jpg"> Figuur 1: Het principe van DRaCALA. (A) Schematisch van de DRaCALA-test. Zie de tekst voor meer informatie. B) Kwantificering en berekening van de bindende fractie. Zie de tekst voor meer informatie. Kortom, de DRaCALA-vlekken worden geanalyseerd door twee cirkels te tekenen die de hele vlek en de binnenste donkere stip omringen(d.w.z.de behouden (p)ppGpp vanwege de binding van het geteste eiwit). Het specifieke bindingssignaal is het radioactieve signaal van de binnenste cirkel (S1) na aftrek van het niet-specifieke achtergrondsignaal (berekend door A1 × ((S2-S1)/(A2-A1))). De bindingsfractie is het specifieke bindingssignaal gedeeld door het totale radioactieve signaal (S2). Afkortingen: DRaCALA = Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay; (p)ppGpp = guanosine penta- en tetrafosfaten; RT = kamertemperatuur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62331/62331fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>32P-&#945;-GTP</td>
			<td>Perkinelmer</td>
			<td>BLU006X250UC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 x pin tool</td>
			<td>V&#38;P Scientific</td>
			<td>VP 404</td>
			<td>96 Bolt Replicator, on 9 mm centers, 4.2 mm Bolt Diameter, 24 mm long</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well V-bottom microtiter plate</td>
			<td>Sterilin</td>
			<td>MIC9004</td>
			<td>Sterilin Microplate V Well 611V96</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>OXOID - Thermo Fisher</td>
			<td>LP0011</td>
			<td>Agar no. 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ASKA collection strain</td>
			<td>NBRP, SHIGEN, JAPAN</td>
			<td></td>
			<td>Ref: DNA Research, Volume 12, Issue 5, 2005, Pages 291&#8211;299. https://doi.org/10.1093/dnares/dsi012</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>E1014-25KU</td>
			<td>genetically engineered endonuclease from Serratia marcescens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford Protein Assay Dye</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>5000006</td>
			<td>Reagent Concentrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D8418</td>
			<td>&#8805;99.9%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase 1</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>DN25-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gel filtration10x300 column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28990944</td>
			<td>contains 20% ethanol as preservative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>122329.1214</td>
			<td>Glycerol 87% for analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypercassette</td>
			<td>Amersham</td>
			<td>RPN 11647</td>
			<td>20 x 40 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>56750</td>
			<td>puriss. p.a., &#8805; 99.5% (GC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IP Storage Phosphor Screen</td>
			<td>FUJIFILM</td>
			<td>28956474</td>
			<td>BAS-MS 2040 20x 40 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>I6758</td>
			<td>Isopropyl &#946;-D-thiogalactoside</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysogeny Broth (LB)</td>
			<td>Invitrogen - Thermo Fisher</td>
			<td>12795027</td>
			<td>Miller&#39;s LB Broth Base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>L4949</td>
			<td>from chicken egg white; BioUltra, lyophilized powder, &#8805;98%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 (Magnesium chloride)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>208337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliQ water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ultrapure water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multichannel pipette</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>4661110</td>
			<td>F1 - Clip Tip; 1-10 ul, 8 x channels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>27810</td>
			<td>AnalaR NORMAPUR, ACS, Reag. Ph. Eur.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Agarose</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>30230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose Blotting Membrane</td>
			<td>Amersham Protran</td>
			<td>10600003</td>
			<td>Premium 0.45 um 300 mm x 4 m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>OXOID - Thermo Fisher</td>
			<td>BR0014G</td>
			<td>Phosphate buffered saline (Dulbecco A), Tablets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG3350 (Polyethylene glycol 3350)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>202444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>93482</td>
			<td>Phenylmethanesulfonyl fluoride solution - 0.1 M in ethanol (T)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphor-imager</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28955809</td>
			<td>Typhoon FLA-7000 Phosphor-imager</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips, filtered</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>94410040</td>
			<td>ClipTip 12.5 &#956;l nonsterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-Prep Chromatography column</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7311550</td>
			<td>polypropylene chromatography column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor Mini</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>A32955</td>
			<td>Tablets, EDTA-free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>screw cap tube</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3488</td>
			<td>Microcentifuge Tubes, 2.0 ml with screw cap, nonsterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SLS 96-deep Well plates</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>780285</td>
			<td>MASTERBLOCK, 2 ML, PP, V-Bottom, Natural</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spin column</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC500396</td>
			<td>Amicon Ultra -0.5 ml Centrifugal Filters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5382000015</td>
			<td>Thermomixer C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC plate (PEI-cellulose F TLC plates)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>105579</td>
			<td>DC PEI-cellulose F (20 x 20 cm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>BP152</td>
			<td>Tris Base for Molecular Biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P1379</td>
			<td>viscous non-ionic detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>M3148</td>
			<td>99% (GC/titration)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identifying the binding proteins of small ligands with the differential radial capillary action of ligand assay (dracala)

Het afgelopen decennium heeft enorme vooruitgang geboekt in het begrijpen van kleine signaalmoleculen in de bacteriële fysiologie. Met name de doeleiwitten van verschillende nucleotide-afgeleide secundaire boodschappers (NSM's) zijn systematisch geïdentificeerd en bestudeerd in modelorganismen. Deze prestaties zijn voornamelijk te danken aan de ontwikkeling van verschillende nieuwe technieken, waaronder de capture compound-techniek en de differentiële radiale capillaire werking van ligandtest (DRaCALA), die werden gebruikt om systematisch doeleiwitten van deze kleine moleculen te identificeren. Dit artikel beschrijft het gebruik van de NSM's, guanosine penta- en tetrafosfaten (p)ppGpp, als voorbeeld en videodemonstratie van de DRaCALA-techniek. Met behulp van DRaCALA werden 9 van de 20 bekende en 12 nieuwe doeleiwitten van (p)ppGpp geïdentificeerd in het modelorganisme Escherichia coli K-12, wat de kracht van deze test aantoont. In principe kan DRaCALA worden gebruikt voor het bestuderen van kleine liganden die kunnen worden geëtiketteerd door radioactieve isotopen of fluorescerende kleurstoffen. De kritische stappen, voor- en nadelen van DRaCALA worden hier besproken voor verdere toepassing van deze techniek.

Het volgen van het hierboven beschreven protocol levert doorgaans twee soorten resultaten op (figuur 3).
Figuur 3A toont een plaat met relatief lage achtergrondbindingssignalen (bindingsfracties < 0,025) uit de meeste putten. Het positieve bindingssignaal van de put H3 geeft een bindende fractie van ~0,35 die veel hoger is dan die waargenomen voor de andere putten. Zelfs zonder kwantificering is goed H3 opmerkelijk, wat suggereert dat...

Watch this Scientific Journal Video about Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay DRaCALA at JoVE.com

Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay DRaCALA

De differentiële radiale capillaire werking van Ligand Assay (DRaCALA) kan worden gebruikt om kleine ligandbindende eiwitten van een organisme te identificeren met behulp van een ORFeome-bibliotheek.

Identificatie van de bindende eiwitten van kleine liganden met de differentiële radiale capillaire werking van ligandtest (DRaCALA)

The past decade has seen tremendous progress in the understanding of small signaling molecules in bacterial physiology. In particular, the target proteins ...

Kleine signaalmoleculen richten zich op verschillende effectoreiwitten om bacteriële virulentie en menselijke biologie te beheersen. Deze effectoreiwitten zijn echter een uitdaging om te identificeren. Als systeembiologietool maakt DRaCALA een haalbare, snelle en zeer gevoelige identificatie van de onbekende effectoreiwitten mogelijk met behulp van een OVium-bibliotheek.DRaCALA kan worden gebruikt om elk klein signaalmolecuul te bestuderen, zolang het kan worden gelabeld met radioactieve isotoop of fluorescerende kleurstoffen. Begin met het inenten van E.coli in 1,5 milliliter LB aangevuld met 25 microgram per milliliter chlooramfenicol in elke put van 96-put diepe putplaten voor een nachtelijke incubatie bij 30 graden Celsius en 160 rotaties per minuut. Behandel de volgende ochtend de overnachtingsculturen met 500 micromolar IPTG gedurende zes uur bij 30 graden Celsius om eiwitexpressie te induceren.Aan het einde van de incubatie pellet de cellen door centrifugeren, verwijder het supernatant en vries de monsters in bij min 80 graden Celsius. Om de lysis te starten, resuspend de pellets in 150 microliter lysis buffer één per put voor een incubatie van 30 minuten bij min 80 graden Celsius voordat de cellen gedurende 20 minuten ontdooien bij 37 graden Celsius. Het lysaat moet dan voor gebruik bij min 80 graden Celsius worden bewaard.Om de lysis van cellen met overexpressie-eiwitten te voltooien, resuspendeer de monsters in 40 milliliter ijskoude lysisbuffer twee en soniceer de monsters met een amplitude van 60% op twee seconden op vier seconden uit gedurende acht minuten, en wis vervolgens de lysaten door centrifugeren. Terwijl de monsters worden gecentrifugeerd, voegt u 500 microliters gehomogeniseerde nikkel-NTA-hars toe aan een staande polypropyleenchromatografiekolom. Was de bezinkte hars na 15 minuten twee keer met 15 milliliter ultrapure water en één keer met 15 milliliter lysisbuffer twee.Aan het einde van de centrifugeer, laad de ontruimde lysaat supernatant op de kolom. Wanneer al het lysaat door de kolom is gestroomd, wast u de kolom met 30 milliliter wasbuffer. Om de eiwitten te elute, voeg 400 microliter volume van elutie buffer toe aan de kolom en herhaal elutie drie keer.Nog eens 300 microliter volume van de elutie buffer om elutie drie keer te herhalen en de geëuteerde eiwitten te combineren in een eindvolume van 700 microliter. Voor gelfiltratie van het geëuteerde monster, na het wassen van een maatuitsluitingskolom met 25 milliliter vers bereide gelfiltratiebuffer, laadt u het volledige volume geëuteerde eiwitten op de kolom met behulp van een lus van 500 microliter. Voer 500 microliters per minuut uit en verzamel twee tot drie volumefracties van 500 microliter van de respectieve eiwitten.Gebruik vervolgens individuele spinkolommen om elk eiwit te concentreren en gebruik de Bradford-testkit om de eiwitconcentraties volgens standaardprotocollen te meten. Om het fosfor 32 gelabelde guanosine pentafosfaat te synthetiseren, monteert u een kleinschalige Relseq-reactie in een schroefvormige buis zoals beschreven in de tabel en incubeert u de reactie in een ThermoMixer gedurende een uur bij 37 graden Celsius en vijf minuten bij 95 graden Celsius, gevolgd door vijf minuten op ijs. Draai aan het einde van de incubaties het neergeslagen eiwit door centrifugeren en breng het gesynthetiseerde fosfor 32 gelabeld guanosine pentafosfaat met supernatant over naar een nieuwe schroefgecapteerde buis.Voeg voor fosfor 32 guanosinetetrafosfaatsynthese één micromolar GppA toe aan de helft van het fosfor 32 gelabelde guanosine pentafosfaatproduct in een nieuwe buis met schroefdop en incubeer de reactie gedurende 10 minuten bij 37 graden Celsius, vijf minuten bij 95 graden Celsius en vijf minuten op ijs. Draai aan het einde van de incubatie het neerslag door centrifugeren en breng het fosfor 32 gelabeld guanosinetetrafosfaat met supernatant over naar een nieuwe buis. Om de geïsoleerde doeleiwitten te analyseren, voert u één microliter van elk monster uit op een dunnelaagchromatografieplaat met 1,5 molair monopotassiumfosfaat als mobiele fase.Plaats na de analyse de gedroogde plaat in een transparante plastic map en stel de plaat vijf minuten bloot aan een fosforscherm voordat u de gegevens op een fosforbeeldvisualisatie visualiseert en kwantificeert. Voeg voor DRaCALA-screening van de doeleiwitten 20 microliter van de ontdooide groothandelslysaten toe aan individuele putten van een 95-put V-bodem microtiterplaat en voeg 2,5 eenheden Serratia marcescens endonuclease toe aan elke put. Na 15 minuten bij 37 graden Celsius, zet de lysates 20 minuten op ijs.Meng vervolgens gelijke hoeveelheden fosfor 32 met het label guanosine pentafosfaat en guanosinetetrafosfaat en voeg 1X lysisbuffer één toe aan het mengsel om een vier nanomolar guanosine pentafosfaatoplossing te verkrijgen. Meng met behulp van een meerkanaals pipet en gefilterde pipettips 10 microliters van het guanosine pentafosfaatmengsel met het cellysaat gedurende een incubatietijd van vijf minuten bij kamertemperatuur. Was aan het einde van de incubatie een 96X-pingereedschap drie keer in een 0,01% oplossing van niet-ionisch wasmiddel gedurende 30 seconden, gevolgd door 30 seconden drogen op een papieren handdoek per wasbeurt voordat u het pingereedschap in de 96-put monsterplaat plaatst.Til het pengereedschap na 30 seconden recht omhoog en plaats het gedurende 30 seconden recht op een nitrocellulosemembraan. Plaats na vijf minuten drogen het nitrocellulosemembraan in een transparante plastic map voor blootstelling aan fosforscreening en visualisatie door fosforbeeldvorming zoals aangetoond. Om potentiële doeleiwitten te kwantificeren en te identificeren, opent u in de analysesoftware die is gekoppeld aan de fosforafbeelding het gelbestand van de gevisualiseerde platen.Als u de te analyseren vlekken wilt definiëren, gebruikt u de functie matrixanalyse om een raster van 12 kolommen bij acht rijen in te stellen. Als u de buitenste rand van de gatvlekken wilt omsnijden, definieert u grote cirkels, exporteert u het volume plus de achtergrond en het gebied van de gedefinieerde grote cirkels naar een spreadsheet. Als u de kleine binnenste punten wilt omgrenzen, verkleint u de gedefinieerde cirkels, exporteert u het volume plus de achtergrond en het gebied van de gedefinieerde kleine cirkels en slaat u alle gegevens in het werkblad op.Plaats cirkels om zo nodig te overlappen met vlekken, waarbij het formaat van de iets grotere dan werkelijke vlekken wordt wijzigen. Gebruik de vergelijking om de bindingsfracties in het werkblad te berekenen en de gegevens te plotten. Identificeer vervolgens de potentiële bindende eiwitten in de putten die hoge bindingsfracties vertonen in vergelijking met de meeste andere putten.In deze representatieve analyse kan een plaat met relatief lage achtergrondbindingssignalen in de meeste putten worden waargenomen. Het positieve bindingssignaal in put H3 vertoonde een bindende fractie die veel hoger was dan die waargenomen voor de andere putten als gevolg van overexpressie van het guanosine pentafosfaatbindend eiwit Hpt. In de representatieve platen vertoonden verschillende putten een relatief hogere achtergrondbindingssignalen, zoals aangegeven door de relatief sterke binnenste stippen die in veel putten werden waargenomen, evenals de consistent hoge bindingsfracties die na kwantificering werden waargenomen.Sommige doelen gaven met name ook variabele bindingsfracties, zoals de false positives. Om verder te verduidelijken, gebruikten onderzoekers gezuiverde eiwitten om de binding opnieuw te testen. Zodra de doeleiwitten zijn geïdentificeerd, kan men ze zuiveren tot homogeniteit en interactiesterkte en specificiteit bevestigen met behulp van DRaCALA, isotherme titratiecalorimetrie of andere methoden.Het identificeren van de doeleiwitten van kleine signaalmoleculen maakt de weg vrij voor een diepgaand begrip van de rollen die voortkomen uit bacteriële virulentie tot menselijke biologie.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay (DRaCALA)

Identification of Small Molecule-binding Proteins in a Native Cellular Environment by Live-cell Photoaffinity Labeling

Identificatie van kleine synthetische molecules bindende eiwitten in een Inheemse cellulaire omgeving door live-cell fotoaffiniteitslabeling

Identifying the molecular target(s) of small molecules is a challenging but necessary step towards understanding their mechanism of action. While several ...

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Methode voor het identificeren van kleinmoleculige remmers van het eiwit-eiwit interactie tussen HCN1 en TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Measuring Biomolecular DSC Profiles with Thermolabile Ligands to Rapidly Characterize Folding and Binding Interactions

Biomoleculaire DSC profielen met Thermolabile liganden te karakteriseren snel vouwen en inbinden van interacties te meten

Differential scanning calorimetry (DSC) is a powerful technique for quantifying thermodynamic parameters governing biomolecular folding and binding ...

Nitrogen Cavitation and Differential Centrifugation Allows for Monitoring the Distribution of Peripheral Membrane Proteins in Cultured Cells

Stikstof cavitatie en differentiële centrifugeren zorgt voor de verdeling van perifere membraaneiwitten in gekweekte cellen

Cultured cells are useful for studying the subcellular distribution of proteins, including peripheral membrane proteins. Genetically encoded fluorescently ...

Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

Rab10 fosforylering detectie door LRRK2 activiteit met behulp van SDS-pagina met een fosfaat-bindende-Tag

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

Capturing the Interaction Kinetics of an Ion Channel Protein with Small Molecules by the Bio-layer Interferometry Assay

Vastleggen van de kinetiek van de interactie van een ionkanaal eiwit met kleine moleculen door de Bio-laag interferometrie Assay

The bio-layer interferometry (BLI) assay is a valuable tool for measuring protein-protein and protein-small molecule interactions. Here, we first describe ...

Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain

Methode voor het efficiënt uiteinde en zuivering van de Chemoreceptor-Ligand bindend domein

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be ...

Detection of Small GTPase Prenylation and GTP Binding Using Membrane Fractionation and  GTPase-linked Immunosorbent Assay

Detectie van kleine GTPase Prenylation en GTP bindend gebruiken membraan fractionering en GTPase-linked Immunosorbent Assay

The Rho GTPase family belongs to the Ras superfamily and includes approximately 20 members in humans. Rho GTPases are important in the regulation of ...

Analysis of AtHIRD11 Intrinsic Disorder and Binding Towards Metal Ions by Capillary Gel Electrophoresis and Affinity Capillary Electrophoresis

Analyse van intrinsieke wanorde van de AtHIRD11 en bindende naar metaalionen door capillaire gelelektroforese en affiniteit capillaire elektroforese

Plants are strongly dependent on their environment. In order to adjust to stressful changes (e.g., drought and high salinity), higher plants evolve ...

A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors

Een semi-High-throughput adaptatie van de NADH-gekoppelde ATPase-assay voor het screenen van kleine molecuul remmers

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would ...