Name: identifying the binding proteins of small ligands with the differential radial capillary action of ligand assay (dracala)
Uploaded: 2021-03-19T14:30:00
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Le travail est soutenu par une subvention de projet NNF (NNF19OC0058331) à YEZ, et le programme de recherche et d’innovation Horizon 2020 de l’Union européenne dans le cadre de la convention de subvention Marie Skłodowska-Curie (Nº 801199) à MLS.
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62331/62331img1.jpg">

1. Préparation de lysates de cellules entières
<ol><li>Inoculer les souches de collecte E. coli K-12 ASKA ORFeome15 dans un bouillon de lysogénie (LB) de 1,5 mL contenant 25 μg/mL de chloramphénicol dans des plaques de puits profondes de 96 puits. Cultiver pendant la nuit (O/N) pendant 18 h à 30 °C en agitant à 160 tr/min. Le lendemain, ajouter l’isopropyle β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) (final 0,5 mM) aux cultures O/N pour induire l’expression des protéines à 30 °C ...

<ol>
	<li>Kalia, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleotide,+c-di-GMP,+c-di-AMP,+cGMP,+cAMP,+(p)ppGpp+signaling+in+bacteria+and+implications+in+pathogenesis.">Nucleotide, c-di-GMP, c-di-AMP, cGMP, cAMP, (p)ppGpp signaling in bacteria and implications in pathogenesis.</a> Chemical Society Reviews. 42 (1), 305-341 (2013).</li><li>Camilli, A., Bassler, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+small-molecule+signaling+pathways.">Bacterial small-molecule signaling pathways.</a> Science. 311 (5764), 1113-1116 (2006).</li><li>Luo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cAMP+capture+compound+mass+spectrometry+as+a+novel+tool+for+targeting+cAMP-binding+proteins:+from+protein+kinase+A+to+potassium/sodium+hyperpolarization-activated+cyclic+nucleotide-gated+channels.">The cAMP capture compound mass spectrometry as a novel tool for targeting cAMP-binding proteins: from protein kinase A to potassium/sodium hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channels.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 8 (12), 2843-2856 (2009).</li><li>Nesper, J., Reinders, A., Glatter, T., Schmidt, A., Jenal, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+capture+compound+for+the+identification+and+analysis+of+cyclic+di-GMP+binding+proteins.">A novel capture compound for the identification and analysis of cyclic di-GMP binding proteins.</a> Journal of Proteomics. 75 (15), 4874-4878 (2012).</li><li>Laventie, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capture+compound+mass+spectrometry--a+powerful+tool+to+identify+novel+c-di-GMP+effector+proteins.">Capture compound mass spectrometry--a powerful tool to identify novel c-di-GMP effector proteins.</a> Journal of Visual Experiments. (97), e51404 (2015).</li><li>Roelofs, K. G., Wang, J., Sintim, H. O., Lee, V. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+radial+capillary+action+of+ligand+assay+for+high-throughput+detection+of+protein-metabolite+interactions.">Differential radial capillary action of ligand assay for high-throughput detection of protein-metabolite interactions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (37), 15528-15533 (2011).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+adaptation+of+the+essential+tRNA+methyltransferase+TrmD+to+the+signaling+molecule+3+',5+'-cAMP+in+bacteria.">Evolutionary adaptation of the essential tRNA methyltransferase TrmD to the signaling molecule 3 ',5 '-cAMP in bacteria.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (1), 313-327 (2017).</li><li>Corrigan, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+identification+of+conserved+bacterial+c-di-AMP+receptor+proteins.">Systematic identification of conserved bacterial c-di-AMP receptor proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (22), 9084-9089 (2013).</li><li>Roelofs, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+identification+of+cyclic-di-GMP+binding+proteins+in+Vibrio+cholerae+reveals+a+novel+class+of+cyclic-di-GMP-binding+ATPases+associated+with+type+II+secretion+systems.">Systematic identification of cyclic-di-GMP binding proteins in Vibrio cholerae reveals a novel class of cyclic-di-GMP-binding ATPases associated with type II secretion systems.</a> PLoS Pathogen. 11 (10), 1005232 (2015).</li><li>Fang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GIL,+a+new+c-di-GMP-binding+protein+domain+involved+in+regulation+of+cellulose+synthesis+in+enterobacteria.">GIL, a new c-di-GMP-binding protein domain involved in regulation of cellulose synthesis in enterobacteria.</a> Molecular Microbiology. 93 (3), 439-452 (2014).</li><li>Corrigan, R. M., Bellows, L. E., Wood, A., Grundling, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ppGpp+negatively+impacts+ribosome+assembly+affecting+growth+and+antimicrobial+tolerance+in+Gram-positive+bacteria.">ppGpp negatively impacts ribosome assembly affecting growth and antimicrobial tolerance in Gram-positive bacteria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1710-1719 (2016).</li><li>Zhang, Y., Zbornikova, E., Rejman, D., Gerdes, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+(p)ppGpp+binding+and+metabolizing+proteins+of+Escherichia+coli.">Novel (p)ppGpp binding and metabolizing proteins of Escherichia coli.</a> Mbio. 9 (2), 02188 (2018).</li><li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nucleotide+pGpp+acts+as+a+third+alarmone+in+Bacillus,+with+functions+distinct+from+those+of+(p)+ppGpp.">The nucleotide pGpp acts as a third alarmone in Bacillus, with functions distinct from those of (p) ppGpp.</a> Nature Communications. 11 (1), 5388 (2020).</li><li>Orr, M. W., Lee, V. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+radial+capillary+action+of+ligand+assay+(DRaCALA)+for+high-throughput+detection+of+protein-metabolite+interactions+in+bacteria.">Differential radial capillary action of ligand assay (DRaCALA) for high-throughput detection of protein-metabolite interactions in bacteria.</a> Methods in Molecular Biology. 1535, 25-41 (2017).</li><li>Kitagawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+set+of+ORF+clones+of+Escherichia+coli+ASKA+library+(A+complete+Set+of+E.+coli+K-12+ORF+archive):+Unique+resources+for+biological+research.">Complete set of ORF clones of Escherichia coli ASKA library (A complete Set of E. coli K-12 ORF archive): Unique resources for biological research.</a> DNA Research. 12 (5), 291-299 (2005).</li><li>Hochstadt-Ozer, J., Cashel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+purine+utilization+in+bacteria.+V.+Inhibition+of+purine+phosphoribosyltransferase+activities+and+purine+uptake+in+isolated+membrane+vesicles+by+guanosine+tetraphosphate.">The regulation of purine utilization in bacteria. V. Inhibition of purine phosphoribosyltransferase activities and purine uptake in isolated membrane vesicles by guanosine tetraphosphate.</a> Journal of Biological Chemistry. 247 (21), 7067-7072 (1972).</li><li>Zhang, Y. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p)ppGpp+regulates+a+bacterial+nucleosidase+by+an+allosteric+two-domain+switch.">p)ppGpp regulates a bacterial nucleosidase by an allosteric two-domain switch.</a> Molecular Cell. 74 (6), 1239-1249 (2019).</li><li>Wang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity-based+capture+and+identification+of+protein+effectors+of+the+growth+regulator+ppGpp.">Affinity-based capture and identification of protein effectors of the growth regulator ppGpp.</a> Nature Chemical Biology. 15 (2), 141-150 (2019).</li></ol>

L’une des étapes critiques dans la réalisation du dépistage DRaCALA est d’obtenir de bons lysates de cellules entières. Tout d’abord, les protéines testées doivent être produites en grande quantité et sous des formes solubles. Deuxièmement, la lyse des cellules doit être complète et la viscosité du lysate doit être minimale. L’inclusion de lysozyme et l’utilisation de trois cycles de gel-dégel sont souvent suffisantes pour lyser complètement les cellules. Cependant, l’ADN chromosomique libéré...

Les bactéries utilisent plusieurs petites molécules de signalisation pour s’adapter à des environnements en constante évolution1,2. Par exemple, les auto-inducteurs, les lactones N-acylhomosérine et leurs oligopeptides modifiés, médient la communication intercellulaire entre les bactéries pour coordonner le comportement de la population, un phénomène connu sous le nom de quorum sensing2. Un autre groupe de petites molécules de signalisation est les NSM, y compris l’adénosine monophosphate cyclique (AMPc), le di-AMP cyclique, la di-guanosine monophosphate cyclique (di-GMP cyclique) et les penta- et tétraphosphates de guanosine (p)ppGpp1. Les bactéries produisent ces NSM en réponse à une variété de conditions de stress différentes. Une fois produites, ces molécules se lient à leurs protéines cibles et régulent plusieurs voies physiologiques et métaboliques différentes pour faire face aux stress rencontrés et améliorer la survie bactérienne. Par conséquent, l’identification des protéines cibles est une condition préalable inévitable pour déchiffrer les fonctions moléculaires de ces petites molécules.
La dernière décennie a été témoin d’un boom des connaissances sur ces petites molécules de signalisation, principalement en raison de plusieurs innovations techniques qui ont dévoilé les protéines cibles de ces petites molécules. Il s’agit notamment de la technique du composé de capture3,4,5et de l’action capillaire radiale différentielle du test de ligand (DRaCALA)6 qui sera discutée dans cet article.
Inventé par Vincent Lee et ses collègues en 20116,DRaCALA déploie la capacité d’une membrane de nitrocellulose à séquestrer différemment des ligands libres et liés aux protéines. Les molécules telles que les protéines ne peuvent pas diffuser sur une membrane de nitrocellulose, tandis que de petits ligands, tels que les NSM, sont capables de le faire. En mélangeant le NSM(par exemple,ppGpp) avec la protéine à tester et en les repérant sur la membrane, on peut s’attendre à deux scénarios (Figure 1): Si (p)ppGpp se lie à la protéine, le (p)ppGpp radiomarqué sera retenu au centre de la tache par la protéine et ne diffusera pas vers l’extérieur, donnant un petit point intense(c’est-à-dire, signal radioactif fort) sous un imageur phosphoré. Cependant, si (p)ppGpp ne se lie pas à la protéine, elle diffusera librement vers l’extérieur pour produire une grande tache avec un signal radioactif de fond uniforme.
De plus, DRaCALA peut détecter l’interaction entre une petite molécule et une protéine non purifiée dans un lysate cellulaire entier si la protéine est présente en quantité suffisante. Cette simplicité permet l’utilisation de DRaCALA dans l’identification rapide de cibles protéiques à l’aide d’une bibliothèque d’expression ORFeome. En effet, les protéines cibles de l’AMPc7,du di-AMP8cyclique,du di-GMPcyclique 9,10et du (p)ppGpp11,12,13 ont été systématiquement identifiées à l’aide de DRaCALA. Cet article vidéo utilise (p)ppGpp comme exemple pour démontrer et décrire les étapes et les considérations critiques dans la réalisation d’un dépistage DRaCALA réussi. Il est à noter qu’il est fortement recommandé de lire une description plus complète de DRaCALA14 en combinaison avec cet article avant d’effectuer DRaCALA.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62331/62331fig01.jpg"> Figure 1: Le principe de DRaCALA. (A) Schéma du test DRaCALA. Voir le texte pour plus de détails. (B) Quantification et calcul de la fraction liante. Voir le texte pour plus de détails. En bref, les taches DRaCALA seront analysées en dessinant deux cercles qui circonscrivent la tache entière et le point sombre interne(c’est-à-direle (p)ppGpp retenu en raison de la liaison de la protéine testée). Le signal de liaison spécifique est le signal radioactif du cercle intérieur (S1) après soustraction du signal de fond non spécifique (calculé par A1 × ((S2-S1)/(A2-A1))). La fraction de liaison est le signal de liaison spécifique divisé par le signal radioactif total (S2). Abréviations: DRaCALA = Action capillaire radiale différentielle du test de ligand; (p)ppGpp = guanosine penta- et tétraphosphates; RT = température ambiante. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62331/62331fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>32P-&#945;-GTP</td>
			<td>Perkinelmer</td>
			<td>BLU006X250UC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 x pin tool</td>
			<td>V&#38;P Scientific</td>
			<td>VP 404</td>
			<td>96 Bolt Replicator, on 9 mm centers, 4.2 mm Bolt Diameter, 24 mm long</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well V-bottom microtiter plate</td>
			<td>Sterilin</td>
			<td>MIC9004</td>
			<td>Sterilin Microplate V Well 611V96</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>OXOID - Thermo Fisher</td>
			<td>LP0011</td>
			<td>Agar no. 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ASKA collection strain</td>
			<td>NBRP, SHIGEN, JAPAN</td>
			<td></td>
			<td>Ref: DNA Research, Volume 12, Issue 5, 2005, Pages 291&#8211;299. https://doi.org/10.1093/dnares/dsi012</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>E1014-25KU</td>
			<td>genetically engineered endonuclease from Serratia marcescens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford Protein Assay Dye</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>5000006</td>
			<td>Reagent Concentrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D8418</td>
			<td>&#8805;99.9%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase 1</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>DN25-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gel filtration10x300 column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28990944</td>
			<td>contains 20% ethanol as preservative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>122329.1214</td>
			<td>Glycerol 87% for analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypercassette</td>
			<td>Amersham</td>
			<td>RPN 11647</td>
			<td>20 x 40 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>56750</td>
			<td>puriss. p.a., &#8805; 99.5% (GC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IP Storage Phosphor Screen</td>
			<td>FUJIFILM</td>
			<td>28956474</td>
			<td>BAS-MS 2040 20x 40 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>I6758</td>
			<td>Isopropyl &#946;-D-thiogalactoside</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysogeny Broth (LB)</td>
			<td>Invitrogen - Thermo Fisher</td>
			<td>12795027</td>
			<td>Miller&#39;s LB Broth Base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>L4949</td>
			<td>from chicken egg white; BioUltra, lyophilized powder, &#8805;98%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 (Magnesium chloride)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>208337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliQ water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ultrapure water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multichannel pipette</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>4661110</td>
			<td>F1 - Clip Tip; 1-10 ul, 8 x channels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>27810</td>
			<td>AnalaR NORMAPUR, ACS, Reag. Ph. Eur.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Agarose</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>30230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose Blotting Membrane</td>
			<td>Amersham Protran</td>
			<td>10600003</td>
			<td>Premium 0.45 um 300 mm x 4 m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>OXOID - Thermo Fisher</td>
			<td>BR0014G</td>
			<td>Phosphate buffered saline (Dulbecco A), Tablets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG3350 (Polyethylene glycol 3350)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>202444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>93482</td>
			<td>Phenylmethanesulfonyl fluoride solution - 0.1 M in ethanol (T)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphor-imager</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28955809</td>
			<td>Typhoon FLA-7000 Phosphor-imager</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips, filtered</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>94410040</td>
			<td>ClipTip 12.5 &#956;l nonsterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-Prep Chromatography column</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7311550</td>
			<td>polypropylene chromatography column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor Mini</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>A32955</td>
			<td>Tablets, EDTA-free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>screw cap tube</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3488</td>
			<td>Microcentifuge Tubes, 2.0 ml with screw cap, nonsterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SLS 96-deep Well plates</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>780285</td>
			<td>MASTERBLOCK, 2 ML, PP, V-Bottom, Natural</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spin column</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC500396</td>
			<td>Amicon Ultra -0.5 ml Centrifugal Filters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5382000015</td>
			<td>Thermomixer C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC plate (PEI-cellulose F TLC plates)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>105579</td>
			<td>DC PEI-cellulose F (20 x 20 cm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>BP152</td>
			<td>Tris Base for Molecular Biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P1379</td>
			<td>viscous non-ionic detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>M3148</td>
			<td>99% (GC/titration)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identifying the binding proteins of small ligands with the differential radial capillary action of ligand assay (dracala)

La dernière décennie a vu d’énormes progrès dans la compréhension des petites molécules de signalisation dans la physiologie bactérienne. En particulier, les protéines cibles de plusieurs messagers secondaires dérivés de nucléotides (NSM) ont été systématiquement identifiées et étudiées dans des organismes modèles. Ces réalisations sont principalement dues au développement de plusieurs nouvelles techniques dont la technique du composé de capture et l’action capillaire radiale différentielle du dosage des ligands (DRaCALA), qui ont été utilisées pour identifier systématiquement les protéines cibles de ces petites molécules. Cet article décrit l’utilisation des NSM, de la guanosine penta- et des tétraphosphates (p)ppGpp, à titre d’exemple et de démonstration vidéo de la technique DRaCALA. En utilisant DRaCALA, 9 des 20 protéines cibles connues et 12 nouvelles de (p)ppGpp ont été identifiées dans l’organisme modèle, Escherichia coli K-12, démontrant la puissance de ce test. En principe, DRaCALA pourrait être utilisé pour étudier de petits ligands qui peuvent être marqués par des isotopes radioactifs ou des colorants fluorescents. Les étapes critiques, les avantages et les inconvénients de DRaCALA sont discutés ici pour une application ultérieure de cette technique.

Suivre le protocole décrit ci-dessus donnera généralement deux types de résultats (Figure 3).
La figure 3A montre une plaque avec des signaux de liaison de fond relativement faibles (fractions de liaison < 0,025) provenant de la majorité des puits. Le signal de liaison positif du puits H3 donne une fraction de liaison d’environ 0,35 qui est beaucoup plus élevée que celle observée pour les autres puits. Même sans quantificat...

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Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay DRaCALA

L’action capillaire radiale différentielle du test de ligand (DRaCALA) peut être utilisée pour identifier les petites protéines de liaison au ligand d’un organisme à l’aide d’une bibliothèque ORFeome.

Identification des protéines de liaison des petits ligands avec l’action capillaire radiale différentielle du test de ligand (DRaCALA)

The past decade has seen tremendous progress in the understanding of small signaling molecules in bacterial physiology. In particular, the target proteins ...

De petites molécules de signalisation ciblent diverses protéines effectrices pour contrôler la virulence bactérienne et la biologie humaine. Cependant, ces protéines effectrices sont difficiles à identifier. En tant qu’outil de biologie des systèmes, DRaCALA permet une identification réalisable, rapide et très sensible des protéines effectrices inconnues à l’aide d’une bibliothèque OVium.DRaCALA pourrait être utilisé pour étudier n’importe quelle petite molécule de signalisation tant qu’elle peut être étiquetée avec des isotopes radioactifs ou des colorants fluorescents. Commencez par inoculer E. coli en 1,5 millilitre de LB complété par 25 microgrammes par millilitre de chloramphénicol dans chaque puits de plaques de puits profondes de 96 puits pour une incubation nocturne à 30 degrés Celsius et 160 rotations par minute. Le lendemain matin, traiter les cultures de nuit avec 500 IPTG micromolaires pendant six heures à 30 degrés Celsius pour induire l’expression des protéines.À la fin de l’incubation, arouillez les cellules par centrifugation, retirez le surnageant et congelez les échantillons à moins 80 degrés Celsius. Pour initier la lyse, resuspendez les granulés dans 150 microlitres de tampon de lyse un par puits pour une incubation de 30 minutes à moins 80 degrés Celsius avant de décongeler les cellules pendant 20 minutes à 37 degrés Celsius. Le lysate doit ensuite être conservé à moins 80 degrés Celsius avant utilisation.Pour compléter la lyse des cellules avec des protéines surexprimées, resuspendez les échantillons dans 40 millilitres de tampon de lyse glacée deux et soniquez les échantillons à une amplitude de 60% à deux secondes sur quatre secondes pendant huit minutes, puis nettoyez les lysates par centrifugation. Pendant que les échantillons sont en cours de centrifugation, ajoutez 500 microlitres de résine nickel-NTA homogénéisée à une colonne de chromatographie en polypropylène sur pied. Après 15 minutes, laver la résine déposée deux fois avec 15 millilitres d’eau ultrapure et une fois avec 15 millilitres de tampon de lyse deux.À la fin de la centrifugation, chargez le surnageant de lysate dégagé sur la colonne. Lorsque tout le lysate a coulé à travers la colonne, lavez la colonne avec 30 millilitres de tampon de lavage. Pour éluer les protéines, ajoutez 400 microlitres de volume de tampon d’élution à la colonne et répétez l’élution trois fois.Un autre volume de 300 microlitres du tampon d’élution pour répéter l’élution trois fois et combiner les protéines éluées dans un volume final de 700 microlitres. Pour la filtration sur gel de l’échantillon élué, après avoir lavé une colonne d’exclusion de taille avec 25 millilitres de tampon de filtration en gel fraîchement préparé, chargez tout le volume de protéine éluée sur la colonne à l’aide d’une boucle de 500 microlitres. Exécutez à 500 microlitres par minute et collectez deux à trois fractions volumiques de 500 microlitres des protéines respectives.Ensuite, utilisez des colonnes de spin individuelles pour concentrer chaque protéine et utilisez le kit de dosage de Bradford pour mesurer les concentrations de protéines selon des protocoles standard. Pour synthétiser le pentaphosphate de guanosine marqué phosphore 32, assemblez une réaction Relseq à petite échelle dans un tube à bouchon à vis comme indiqué dans le tableau et incubez la réaction dans un ThermoMixer pendant une heure à 37 degrés Celsius et cinq minutes à 95 degrés Celsius, suivies de cinq minutes sur glace. À la fin des incubations, faire tourner la protéine précipitée par centrifugation et transférer le phosphore synthétisé 32 marqué guanosine pentaphosphate contenant un surnageant dans un nouveau tube à bouchon à vis.Pour la synthèse du phosphore 32 guanosine tétraphosphate, ajouter un GppA micromolaire à la moitié du produit de guanosine pentaphosphate marqué phosphore 32 dans un nouveau tube à bouchon à vis et incuber la réaction pendant 10 minutes à 37 degrés Celsius, cinq minutes à 95 degrés Celsius et cinq minutes sur glace. À la fin de l’incubation, faire tourner le précipité par centrifugation et transférer le phosphore 32 marqué guanosine tétraphosphate contenant un surnageant dans un nouveau tube. Pour analyser les protéines cibles isolées, exécutez un microlitre de chaque échantillon sur une plaque de chromatographie sur couche mince en utilisant 1,5 molaire de phosphate monopotassique comme phase mobile.Après l’analyse, placez la plaque séchée dans un dossier en plastique transparent et exposez-la à un écran de phosphore de stockage pendant cinq minutes avant de visualiser et de quantifier les données sur un imageur au phosphore. Pour le criblage DRaCALA des protéines cibles, ajouter 20 microlitres de lysates en gros décongelés à des puits individuels d’une plaque de microtitrage à fond en V de 95 puits et ajouter 2,5 unités d’endonucléase serratia marcescens à chaque puits. Après 15 minutes à 37 degrés Celsius, placez les lysates sur de la glace pendant 20 minutes.Ensuite, mélangez des volumes égaux de phosphore 32 marqué guanosine pentaphosphate et guanosine tétraphosphate et ajoutez un tampon de lyse 1X au mélange pour obtenir une solution de pentaphosphate de guanosine à quatre nanomolaires. À l’aide d’une pipette multicanal et d’embouts de pipette filtrés, mélanger 10 microlitres du mélange de guanosine pentaphosphate avec le lysate cellulaire pour une incubation de cinq minutes à température ambiante. À la fin de l’incubation, lavez un outil à broches 96X trois fois dans une solution à 0,01% de détergent non ionique pendant 30 secondes, suivi de 30 secondes de séchage sur une serviette en papier par lavage avant de placer l’outil à goupille dans la plaque d’échantillonnage de 96 puits.Après 30 secondes, soulevez l’outil à broches vers le haut et placez-le directement sur une membrane de nitrocellulose pendant 30 secondes. Après cinq minutes de séchage, placez la membrane de nitrocellulose dans un dossier en plastique transparent pour stocker l’exposition à l’écran de phosphore et la visualisation par imagerie au phosphore, comme démontré. Pour quantifier et identifier les protéines cibles potentielles, dans le logiciel d’analyse associé à l’imageur de phosphore, ouvrez le fichier gel des plaques visualisées.Pour définir les points à analyser, utilisez la fonction d’analyse de tableau pour configurer une grille de 12 colonnes sur huit lignes. Pour circonscrire le bord extérieur des taches de trou, définissez de grands cercles, exportez le volume ainsi que l’arrière-plan et la zone des grands cercles définis vers une feuille de calcul. Pour circonscrire les petits points intérieurs, réduisez la taille des cercles définis, exportez le volume ainsi que l’arrière-plan et la zone des petits cercles définis et enregistrez toutes les données dans la feuille de calcul.Positionnez les cercles pour qu’ils se chevauchent avec les taches si nécessaire, en redimensionnant les taches légèrement plus grandes que les taches réelles. Utilisez l’équation pour calculer les fractions de liaison dans la feuille de calcul et tracer les données. Ensuite, identifiez les protéines de liaison potentielles dans les puits qui présentent des fractions de liaison élevées par rapport à la majorité des autres puits.Dans cette analyse représentative, on peut observer une plaque avec des signaux de liaison de fond relativement faibles dans la plupart des puits. Le signal de liaison positif dans le puits H3 présentait une fraction de liaison beaucoup plus élevée que celle observée pour les autres puits en raison de la surexpression de la protéine de liaison à la guanosine pentaphosphate Hpt. Dans les plaques représentatives, plusieurs puits ont montré des signaux de liaison de fond relativement plus élevés, comme l’indiquent les points internes relativement forts observés dans de nombreux puits, ainsi que les fractions de liaison constamment élevées observées après quantification.Notamment, certaines cibles ont également donné des fractions de liaison variables, telles que les faux positifs. Pour clarifier davantage, les chercheurs ont utilisé des protéines purifiées pour tester à nouveau la liaison. Une fois les protéines cibles identifiées, on peut les purifier en homogénéité et confirmer la force et la spécificité de l’interaction en utilisant DRaCALA, la calorimétrie de titrage isotherme ou d’autres méthodes.L’identification des protéines cibles de petites molécules de signalisation ouvre la voie à une compréhension approfondie des rôles émergeant de la virulence bactérienne à la biologie humaine.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay (DRaCALA)

Identification of Small Molecule-binding Proteins in a Native Cellular Environment by Live-cell Photoaffinity Labeling

Identification des protéines de petites molécules de liaison dans un Natif cellulaire Environnement par des cellules vivantes photoaffinité Étiquetage

Identifying the molecular target(s) of small molecules is a challenging but necessary step towards understanding their mechanism of action. While several ...

Recherche

Biochimie

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Procédé pour l&#39;identification d&#39;inhibiteurs de petites molécules de l&#39;interaction protéine-protéine entre HCN1 et TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Measuring Biomolecular DSC Profiles with Thermolabile Ligands to Rapidly Characterize Folding and Binding Interactions

Mesurer les profils biomoléculaire DSC avec des Ligands Thermolabile de caractériser rapidement pliage et reliure Interactions

Differential scanning calorimetry (DSC) is a powerful technique for quantifying thermodynamic parameters governing biomolecular folding and binding ...

Nitrogen Cavitation and Differential Centrifugation Allows for Monitoring the Distribution of Peripheral Membrane Proteins in Cultured Cells

Azote Cavitation et Centrifugation différentielle permet de surveiller la Distribution des protéines membranaires périphériques dans des cellules cultivées

Cultured cells are useful for studying the subcellular distribution of proteins, including peripheral membrane proteins. Genetically encoded fluorescently ...

Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

Rab10 détection de Phosphorylation par LRRK2 l’activité à l’aide de SDS-PAGE avec une balise de Phosphate-binding

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

Capturing the Interaction Kinetics of an Ion Channel Protein with Small Molecules by the Bio-layer Interferometry Assay

Capturer la cinétique de l’Interaction d’une protéine canal ionique avec petites molécules par le dosage de l’interférométrie Bio-couche

The bio-layer interferometry (BLI) assay is a valuable tool for measuring protein-protein and protein-small molecule interactions. Here, we first describe ...

Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain

Procédé de repliement efficace et la Purification des chémorécepteurs Ligand Binding Domain

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be ...

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Détection des petits GTPase prénylation et GTP Binding utilisant le fractionnement Membrane et GTPase-linked Immunosorbent Assay

The Rho GTPase family belongs to the Ras superfamily and includes approximately 20 members in humans. Rho GTPases are important in the regulation of ...

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Analyse de AtHIRD11 désordre intrinsèque et la liaison vers les Ions métalliques par électrophorèse capillaire et l’électrophorèse capillaire affinité

Plants are strongly dependent on their environment. In order to adjust to stressful changes (e.g., drought and high salinity), higher plants evolve ...

A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors

Adaptation semi-haute débit de l'analyse ATPase couplée au NADH pour le dépistage des petits inhibiteurs des molécules

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would ...