Name: identifying the binding proteins of small ligands with the differential radial capillary action of ligand assay (dracala)
Uploaded: 2021-03-19T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay DRaCALA at JoVE.com

Die Arbeit wird durch einen NNF-Projektzuschuss (NNF19OC0058331) für YEZ und das Forschungs- und Innovationsprogramm Horizon 2020 der Europäischen Union im Rahmen der Marie Skłodowska-Curie-Finanzhilfevereinbarung (Nr. 801199) an MLS unterstützt.
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62331/62331img1.jpg">

1. Herstellung von Ganzzelllysaten
<ol><li>Impfen Sie die E. coli K-12 ASKA ORFeome Collection Stämme15 in 1,5 ml Lysogeny Brühe (LB) mit 25 μg/ml Chloramphenicol in 96-Well-Tiefbrunnenplatten. Über Nacht (O/N) für 18 h bei 30 °C mit Schütteln bei 160 U/min wachsen. Am nächsten Tag isopropyl β-d-1-thiogalactopyranosid (IPTG) (letzte 0,5 mM) in die O/N-Kulturen geben, um die Proteinexpression bei 30 °C für 6 h zu induzieren.</li>
	<li>Pelletzellen bei 500 x g für 10 ...

<ol>
	<li>Kalia, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleotide,+c-di-GMP,+c-di-AMP,+cGMP,+cAMP,+(p)ppGpp+signaling+in+bacteria+and+implications+in+pathogenesis.">Nucleotide, c-di-GMP, c-di-AMP, cGMP, cAMP, (p)ppGpp signaling in bacteria and implications in pathogenesis.</a> Chemical Society Reviews. 42 (1), 305-341 (2013).</li><li>Camilli, A., Bassler, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+small-molecule+signaling+pathways.">Bacterial small-molecule signaling pathways.</a> Science. 311 (5764), 1113-1116 (2006).</li><li>Luo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cAMP+capture+compound+mass+spectrometry+as+a+novel+tool+for+targeting+cAMP-binding+proteins:+from+protein+kinase+A+to+potassium/sodium+hyperpolarization-activated+cyclic+nucleotide-gated+channels.">The cAMP capture compound mass spectrometry as a novel tool for targeting cAMP-binding proteins: from protein kinase A to potassium/sodium hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channels.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 8 (12), 2843-2856 (2009).</li><li>Nesper, J., Reinders, A., Glatter, T., Schmidt, A., Jenal, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+capture+compound+for+the+identification+and+analysis+of+cyclic+di-GMP+binding+proteins.">A novel capture compound for the identification and analysis of cyclic di-GMP binding proteins.</a> Journal of Proteomics. 75 (15), 4874-4878 (2012).</li><li>Laventie, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capture+compound+mass+spectrometry--a+powerful+tool+to+identify+novel+c-di-GMP+effector+proteins.">Capture compound mass spectrometry--a powerful tool to identify novel c-di-GMP effector proteins.</a> Journal of Visual Experiments. (97), e51404 (2015).</li><li>Roelofs, K. G., Wang, J., Sintim, H. O., Lee, V. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+radial+capillary+action+of+ligand+assay+for+high-throughput+detection+of+protein-metabolite+interactions.">Differential radial capillary action of ligand assay for high-throughput detection of protein-metabolite interactions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (37), 15528-15533 (2011).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+adaptation+of+the+essential+tRNA+methyltransferase+TrmD+to+the+signaling+molecule+3+',5+'-cAMP+in+bacteria.">Evolutionary adaptation of the essential tRNA methyltransferase TrmD to the signaling molecule 3 ',5 '-cAMP in bacteria.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (1), 313-327 (2017).</li><li>Corrigan, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+identification+of+conserved+bacterial+c-di-AMP+receptor+proteins.">Systematic identification of conserved bacterial c-di-AMP receptor proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (22), 9084-9089 (2013).</li><li>Roelofs, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+identification+of+cyclic-di-GMP+binding+proteins+in+Vibrio+cholerae+reveals+a+novel+class+of+cyclic-di-GMP-binding+ATPases+associated+with+type+II+secretion+systems.">Systematic identification of cyclic-di-GMP binding proteins in Vibrio cholerae reveals a novel class of cyclic-di-GMP-binding ATPases associated with type II secretion systems.</a> PLoS Pathogen. 11 (10), 1005232 (2015).</li><li>Fang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GIL,+a+new+c-di-GMP-binding+protein+domain+involved+in+regulation+of+cellulose+synthesis+in+enterobacteria.">GIL, a new c-di-GMP-binding protein domain involved in regulation of cellulose synthesis in enterobacteria.</a> Molecular Microbiology. 93 (3), 439-452 (2014).</li><li>Corrigan, R. M., Bellows, L. E., Wood, A., Grundling, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ppGpp+negatively+impacts+ribosome+assembly+affecting+growth+and+antimicrobial+tolerance+in+Gram-positive+bacteria.">ppGpp negatively impacts ribosome assembly affecting growth and antimicrobial tolerance in Gram-positive bacteria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1710-1719 (2016).</li><li>Zhang, Y., Zbornikova, E., Rejman, D., Gerdes, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+(p)ppGpp+binding+and+metabolizing+proteins+of+Escherichia+coli.">Novel (p)ppGpp binding and metabolizing proteins of Escherichia coli.</a> Mbio. 9 (2), 02188 (2018).</li><li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nucleotide+pGpp+acts+as+a+third+alarmone+in+Bacillus,+with+functions+distinct+from+those+of+(p)+ppGpp.">The nucleotide pGpp acts as a third alarmone in Bacillus, with functions distinct from those of (p) ppGpp.</a> Nature Communications. 11 (1), 5388 (2020).</li><li>Orr, M. W., Lee, V. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+radial+capillary+action+of+ligand+assay+(DRaCALA)+for+high-throughput+detection+of+protein-metabolite+interactions+in+bacteria.">Differential radial capillary action of ligand assay (DRaCALA) for high-throughput detection of protein-metabolite interactions in bacteria.</a> Methods in Molecular Biology. 1535, 25-41 (2017).</li><li>Kitagawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+set+of+ORF+clones+of+Escherichia+coli+ASKA+library+(A+complete+Set+of+E.+coli+K-12+ORF+archive):+Unique+resources+for+biological+research.">Complete set of ORF clones of Escherichia coli ASKA library (A complete Set of E. coli K-12 ORF archive): Unique resources for biological research.</a> DNA Research. 12 (5), 291-299 (2005).</li><li>Hochstadt-Ozer, J., Cashel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+purine+utilization+in+bacteria.+V.+Inhibition+of+purine+phosphoribosyltransferase+activities+and+purine+uptake+in+isolated+membrane+vesicles+by+guanosine+tetraphosphate.">The regulation of purine utilization in bacteria. V. Inhibition of purine phosphoribosyltransferase activities and purine uptake in isolated membrane vesicles by guanosine tetraphosphate.</a> Journal of Biological Chemistry. 247 (21), 7067-7072 (1972).</li><li>Zhang, Y. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p)ppGpp+regulates+a+bacterial+nucleosidase+by+an+allosteric+two-domain+switch.">p)ppGpp regulates a bacterial nucleosidase by an allosteric two-domain switch.</a> Molecular Cell. 74 (6), 1239-1249 (2019).</li><li>Wang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity-based+capture+and+identification+of+protein+effectors+of+the+growth+regulator+ppGpp.">Affinity-based capture and identification of protein effectors of the growth regulator ppGpp.</a> Nature Chemical Biology. 15 (2), 141-150 (2019).</li></ol>

Einer der kritischen Schritte bei der Durchführung eines DRaCALA-Screenings besteht darin, gute Lysate ganzer Zellen zu erhalten. Zunächst sollten die getesteten Proteine in großen Mengen und in löslichen Formen hergestellt werden. Zweitens sollte die Lyse der Zellen vollständig sein und die Viskosität des Lysats muss minimal sein. Die Einbeziehung von Lysozym und die Verwendung von drei Gefrier-Tau-Zyklen reichen oft aus, um Zellen vollständig zu lysieren. Die freigesetzte chromosomale DNA macht das Lysat jedoch ...

Bakterien verwenden mehrere kleine Signalmoleküle, um sich an sich ständig ändernde Umgebungen anzupassen1,2. Zum Beispiel vermitteln die Autoinduzierer, N-Acylhomoserinlactone und ihre modifizierten Oligopeptide, die interzelluläre Kommunikation zwischen Bakterien, um das Populationsverhalten zu koordinieren, ein Phänomen, das als Quorum Sensing bekanntist 2. Eine weitere Gruppe kleiner Signalmoleküle sind die NSMs, darunter das umfassend untersuchte zyklische Adenosinmonophosphat (cAMP), cyclisches Di-AMP, cyclisches Di-Guanosinmonophosphat (cyclisches Di-GMP) und Guanosin-Penta- und Tetraphosphate (p)ppGpp1. Bakterien produzieren diese NSMs als Reaktion auf eine Vielzahl von verschiedenen Stressbedingungen. Einmal produziert, binden diese Moleküle an ihre Zielproteine und regulieren mehrere verschiedene physiologische und metabolische Wege, um den angetroffenen Belastungen standzuhalten und das Überleben der Bakterien zu verbessern. Daher ist die Identifizierung der Zielproteine eine unumgängliche Voraussetzung, um die molekularen Funktionen dieser kleinen Moleküle zu entschlüsseln.
In den letzten zehn Jahren gab es einen Wissensboom über diese kleinen Signalmoleküle, hauptsächlich aufgrund mehrerer technischer Innovationen, die die Zielproteine dieser kleinen Moleküle enthüllten. Dazu gehören die Capture-Compound-Technik3,4,5und die differentielle radiale Kapillarwirkung des Ligandenassays (DRaCALA)6, die in diesem Artikel diskutiert werden soll.
DRaCALA wurde 2011 von Vincent Lee und Mitarbeitern6erfunden und nutzt die Fähigkeit einer Nitrocellulosemembran, freie und proteingebundene Liganden differentiell zu sequestriert. Moleküle wie Proteine können nicht auf einer Nitrocellulosemembran diffundieren, während kleine Liganden wie die NSMs dazu in der Lage sind. Durch Mischen des NSM (z. B., ppGpp) mit dem zu testenden Protein und Aufträgen auf der Membran sind zwei Szenarien zu erwarten (Abbildung 1): Wenn (p)ppGpp an das Protein bindet, wird das radioaktiv markierte (p)ppGpp vom Protein in der Mitte des Flecks zurückgehalten und diffundiert nicht nach außen, wodurch ein intensiver kleiner Punkt (d.h. B. starkes radioaktives Signal) unter einem Phosphorimager. Wenn (p)ppGpp jedoch nicht an das Protein bindet, diffundiert es frei nach außen, um einen großen Fleck mit gleichmäßigem radioaktivem Hintergrundsignal zu erzeugen.
Darüber hinaus kann DRaCALA die Wechselwirkung zwischen einem kleinen Molekül und einem ungereinigten Protein in einem ganzen Zelllysat nachweisen, wenn das Protein in ausreichender Menge vorhanden ist. Diese Einfachheit ermöglicht die Verwendung von DRaCALA bei der schnellen Identifizierung von Proteinzielen mithilfe einer ORFeome-Expressionsbibliothek. Tatsächlich wurden Zielproteine von cAMP7, cyclischem di-AMP8, cyclischem di-GMP9,10und (p)ppGpp11,12,13 systematisch unter Verwendung von DRaCALA identifiziert. Dieser Videoartikel verwendet (p)ppGpp als Beispiel, um die kritischen Schritte und Überlegungen bei der Durchführung eines erfolgreichen DRaCALA-Screenings zu demonstrieren und zu beschreiben. Es wird dringend empfohlen, eine ausführlichere Beschreibung von DRaCALA14 in Kombination mit diesem Artikel zu lesen, bevor Sie DRaCALA durchführen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62331/62331fig01.jpg"> Abbildung 1: Das Prinzip von DRaCALA. (A) Schematische Darstellung des DRaCALA-Assays. Weitere Informationen finden Sie im Text. (B) Quantifizierung und Berechnung des Bindungsanteils. Weitere Informationen finden Sie im Text. Kurz gesagt, die DRaCALA-Flecken werden analysiert, indem zwei Kreise gezeichnet werden, die den gesamten Fleck und den inneren dunklen Punkt(dhdas zurückgehaltene (p) ppGpp aufgrund der Bindung des getesteten Proteins) umschreiben. Das spezifische Bindungssignal ist das radioaktive Signal des inneren Kreises (S1) nach Subtraktierung des unspezifischen Hintergrundsignals (berechnet durch A1 × ((S2 -S1)/(A2-A1))). Der Bindungsanteil ist das spezifische Bindungssignal dividiert durch das gesamte radioaktive Signal (S2). Abkürzungen: DRaCALA = Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay; (p)ppGpp = Guanosinpenta- und Tetraphosphate; RT = Raumtemperatur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62331/62331fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>32P-&#945;-GTP</td>
			<td>Perkinelmer</td>
			<td>BLU006X250UC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 x pin tool</td>
			<td>V&#38;P Scientific</td>
			<td>VP 404</td>
			<td>96 Bolt Replicator, on 9 mm centers, 4.2 mm Bolt Diameter, 24 mm long</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well V-bottom microtiter plate</td>
			<td>Sterilin</td>
			<td>MIC9004</td>
			<td>Sterilin Microplate V Well 611V96</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>OXOID - Thermo Fisher</td>
			<td>LP0011</td>
			<td>Agar no. 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ASKA collection strain</td>
			<td>NBRP, SHIGEN, JAPAN</td>
			<td></td>
			<td>Ref: DNA Research, Volume 12, Issue 5, 2005, Pages 291&#8211;299. https://doi.org/10.1093/dnares/dsi012</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>E1014-25KU</td>
			<td>genetically engineered endonuclease from Serratia marcescens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford Protein Assay Dye</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>5000006</td>
			<td>Reagent Concentrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D8418</td>
			<td>&#8805;99.9%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase 1</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>DN25-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gel filtration10x300 column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28990944</td>
			<td>contains 20% ethanol as preservative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>122329.1214</td>
			<td>Glycerol 87% for analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypercassette</td>
			<td>Amersham</td>
			<td>RPN 11647</td>
			<td>20 x 40 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>56750</td>
			<td>puriss. p.a., &#8805; 99.5% (GC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IP Storage Phosphor Screen</td>
			<td>FUJIFILM</td>
			<td>28956474</td>
			<td>BAS-MS 2040 20x 40 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>I6758</td>
			<td>Isopropyl &#946;-D-thiogalactoside</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysogeny Broth (LB)</td>
			<td>Invitrogen - Thermo Fisher</td>
			<td>12795027</td>
			<td>Miller&#39;s LB Broth Base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>L4949</td>
			<td>from chicken egg white; BioUltra, lyophilized powder, &#8805;98%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 (Magnesium chloride)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>208337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliQ water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ultrapure water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multichannel pipette</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>4661110</td>
			<td>F1 - Clip Tip; 1-10 ul, 8 x channels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>27810</td>
			<td>AnalaR NORMAPUR, ACS, Reag. Ph. Eur.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Agarose</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>30230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose Blotting Membrane</td>
			<td>Amersham Protran</td>
			<td>10600003</td>
			<td>Premium 0.45 um 300 mm x 4 m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>OXOID - Thermo Fisher</td>
			<td>BR0014G</td>
			<td>Phosphate buffered saline (Dulbecco A), Tablets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG3350 (Polyethylene glycol 3350)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>202444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>93482</td>
			<td>Phenylmethanesulfonyl fluoride solution - 0.1 M in ethanol (T)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphor-imager</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28955809</td>
			<td>Typhoon FLA-7000 Phosphor-imager</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips, filtered</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>94410040</td>
			<td>ClipTip 12.5 &#956;l nonsterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-Prep Chromatography column</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7311550</td>
			<td>polypropylene chromatography column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor Mini</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>A32955</td>
			<td>Tablets, EDTA-free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>screw cap tube</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3488</td>
			<td>Microcentifuge Tubes, 2.0 ml with screw cap, nonsterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SLS 96-deep Well plates</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>780285</td>
			<td>MASTERBLOCK, 2 ML, PP, V-Bottom, Natural</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spin column</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC500396</td>
			<td>Amicon Ultra -0.5 ml Centrifugal Filters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5382000015</td>
			<td>Thermomixer C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC plate (PEI-cellulose F TLC plates)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>105579</td>
			<td>DC PEI-cellulose F (20 x 20 cm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>BP152</td>
			<td>Tris Base for Molecular Biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P1379</td>
			<td>viscous non-ionic detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>M3148</td>
			<td>99% (GC/titration)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identifying the binding proteins of small ligands with the differential radial capillary action of ligand assay (dracala)

In den letzten zehn Jahren gab es enorme Fortschritte beim Verständnis kleiner Signalmoleküle in der bakteriellen Physiologie. Insbesondere die Zielproteine mehrerer nukleotid-abgeleiteter Sekundärbotenstoffe (NSMs) wurden systematisch identifiziert und in Modellorganismen untersucht. Diese Erfolge sind hauptsächlich auf die Entwicklung mehrerer neuer Techniken zurückzuführen, darunter die Capture-Compound-Technik und die differentielle radiale Kapillarwirkung des Ligandenassays (DRaCALA), mit denen Zielproteine dieser kleinen Moleküle systematisch identifiziert wurden. Dieser Artikel beschreibt die Verwendung der NSMs, Guanosinpenta- und Tetraphosphate (p)ppGpp, als Beispiel und Videodemonstration der DRaCALA-Technik. Unter Verwendung von DRaCALA wurden 9 von 20 bekannten und 12 neuen Zielproteinen von (p)ppGpp im Modellorganismus Escherichia coli K-12 identifiziert, was die Leistungsfähigkeit dieses Assays demonstriert. Prinzipiell könnte DRaCALA zur Untersuchung kleiner Liganden verwendet werden, die durch radioaktive Isotope oder Fluoreszenzfarbstoffe markiert werden können. Die kritischen Schritte, Vor- und Nachteile von DRaCALA werden hier für die weitere Anwendung dieser Technik diskutiert.

Das Befolgen des oben beschriebenen Protokolls führt in der Regel zu zwei Arten von Ergebnissen (Abbildung 3).
Abbildung 3A zeigt eine Platte mit relativ geringen Hintergrundbindungssignalen (Bindungsfraktionen < 0,025) aus der Mehrzahl der Vertiefungen. Das positive Bindungssignal der Bohrung H3 ergibt einen Bindungsanteil von ~0,35, der viel höher ist als der, der für die anderen Vertiefungen beobachtet wurde. Selbst ohne Quantif...

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Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay DRaCALA

Der Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay (DRaCALA) kann verwendet werden, um kleine ligandenbindende Proteine eines Organismus unter Verwendung einer ORFeome-Bibliothek zu identifizieren.

Identifizierung der Bindungsproteine kleiner Liganden mit der differentiellen radialen Kapillarwirkung des Ligandenassays (DRaCALA)

The past decade has seen tremendous progress in the understanding of small signaling molecules in bacterial physiology. In particular, the target proteins ...

Kleine Signalmoleküle zielen auf verschiedene Effektorproteine ab, um die bakterielle Virulenz und die menschliche Biologie zu kontrollieren. Diese Effektorproteine sind jedoch schwierig zu identifizieren. Als systembiologisches Werkzeug ermöglicht DRaCALA eine praktikable, schnelle und hochempfindliche Identifizierung der unbekannten Effektorproteine unter Verwendung einer OVium-Bibliothek.DRaCALA könnte verwendet werden, um jedes kleine Signalmolekül zu untersuchen, solange es entweder mit radioaktiven Isotopen oder fluoreszierenden Farbstoffen markiert werden kann. Beginnen Sie mit der Impfung von E.coli in 1,5 Milliliter LB, ergänzt mit 25 Mikrogramm pro Milliliter Chloramphenicol in jeder Vertiefung von 96-Well-Tiefbrunnenplatten für eine Nachtinkubation bei 30 Grad Celsius und 160 Umdrehungen pro Minute. Am nächsten Morgen die Nachtkulturen sechs Stunden lang bei 30 Grad Celsius mit 500 mikromolaren IPTG behandeln, um die Proteinexpression zu induzieren.Am Ende der Inkubation die Zellen durch Zentrifugation pelletieren, den Überstand entfernen und die Proben bei minus 80 Grad Celsius einfrieren. Um die Lyse einzuleiten, resuspendieren Sie die Pellets in 150 Mikroliter Lysepuffer pro Vertiefung für eine 30-minütige Inkubation bei minus 80 Grad Celsius, bevor Sie die Zellen für 20 Minuten bei 37 Grad Celsius auftauen. Das Lysat sollte dann vor Gebrauch bei minus 80 Grad Celsius gelagert werden.Um die Lyse von Zellen mit überexprimierten Proteinen abzuschließen, resuspendieren Sie die Proben in 40 Milliliter eiskaltem Lysepuffer zwei und beschallen Sie die Proben mit einer Amplitude von 60% bei zwei Sekunden auf vier Sekunden für acht Minuten, dann löschen Sie die Lysate durch Zentrifugation. Während die Proben zentrifugiert werden, fügen Sie 500 Mikroliter homogenisiertes Nickel-NTA-Harz zu einer stehenden Polypropylenchromatographiesäule hinzu. Nach 15 Minuten das abgesetzte Harz zweimal mit 15 Millilitern Reinstwasser und einmal mit 15 Millilitern Lysepuffer zwei waschen.Am Ende der Zentrifugation den geklärten Lysatüberstand auf die Säule laden. Wenn das gesamte Lysat durch die Säule geflossen ist, waschen Sie die Säule mit 30 Millilitern Waschpuffer. Um die Proteine zu eluieren, fügen Sie 400 Mikroliter Volumen Elutionspuffer in die Säule und wiederholen Sie die Elution dreimal.Weitere 300 Mikroliter Volumen des Elutionspuffers, um die Elution dreimal zu wiederholen und die eluierten Proteine in einem Endvolumen von 700 Mikrolitern zu kombinieren. Für die Gelfiltration der eluierten Probe laden Sie nach dem Waschen einer Größenausschlusssäule mit 25 Millilitern frisch zubereitetem Gelfiltrationspuffer das gesamte Volumen des eluierten Proteins mit einer 500-Mikroliter-Schleife auf die Säule. Laufen Sie mit 500 Mikrolitern pro Minute und sammeln Sie zwei bis drei 500 Mikroliter Volumenfraktionen der jeweiligen Proteine.Verwenden Sie dann einzelne Spinsäulen, um jedes Protein zu konzentrieren, und verwenden Sie das Bradford-Assay-Kit, um die Proteinkonzentrationen gemäß standardisierten Protokollen zu messen. Um das phosphor-32-markierte Guanosinpentaphosphat zu synthetisieren, bauen Sie eine kleine Relseq-Reaktion in einem schraubbedeckten Rohr zusammen, wie in der Tabelle beschrieben, und inkubieren Sie die Reaktion in einem ThermoMixer für eine Stunde bei 37 Grad Celsius und fünf Minuten bei 95 Grad Celsius, gefolgt von fünf Minuten auf Eis. Am Ende der Inkubationen das ausgefällte Protein durch Zentrifugation herunterspinnen und das synthetisierte Phosphor 32 markierte Guanosinpentaphosphat, das Überstand enthält, in ein neues schraubbedecktes Röhrchen übertragen.Für die Phosphor-32-Guanosintetraphosphatsynthese fügen Sie der Hälfte des phosphor-32-markierten Guanosinpentaphosphatprodukts in einem neuen schraubbedeckten Röhrchen ein mikromolares GppA hinzu und inkubieren sie die Reaktion für 10 Minuten bei 37 Grad Celsius, fünf Minuten bei 95 Grad Celsius und fünf Minuten auf Eis. Am Ende der Inkubation den Niederschlag durch Zentrifugation herunterspinnen und das phosphor-32-markierte Guanosintetraphosphat, das überstandshaltig enthält, in ein neues Röhrchen übertragen. Um die isolierten Zielproteine zu analysieren, führen Sie einen Mikroliter jeder Probe auf einer Dünnschichtchromatographieplatte mit 1,5 molarem Monokaliumphosphat als mobile Phase aus.Legen Sie nach der Analyse die getrocknete Platte in eine transparente Kunststoffmappe und setzen Sie die Platte fünf Minuten lang einem Speicherphosphorsb aus, bevor Sie die Daten auf einem Phosphor-Imager visualisieren und quantifizieren. Für das DRaCALA-Screening der Zielproteine werden 20 Mikroliter der aufgetauten Großhandelslysate zu einzelnen Vertiefungen einer 95-Well-V-Boden-Mikrotiterplatte hinzugefügt und 2,5 Einheiten Serratia marcescens Endonuklease zu jeder Vertiefung hinzugefügt. Nach 15 Minuten bei 37 Grad Celsius die Lysate für 20 Minuten auf Eis legen.Als nächstes mischen Sie gleiche Mengen phosphor 32 markiertes Guanosinpentaphosphat und Guanosintetraphosphat und fügen Sie 1X Lysepuffer eins zu der Mischung hinzu, um eine vier nanomolare Guanosinpentaphosphatlösung zu erhalten. Mischen Sie mit einer Mehrkanalpipette und gefilterten Pipettenspitzen 10 Mikroliter der Guanosinpentaphosphatmischung mit dem Zelllysat für eine fünfminütige Inkubation bei Raumtemperatur. Am Ende der Inkubation waschen Sie ein 96X-Pin-Werkzeug dreimal in einer 0,01% igen Lösung von nichtionischem Reinigungsmittel für 30 Sekunden, gefolgt von 30 Sekunden Trocknen auf einem Papiertuch pro Waschgang, bevor Sie das Pin-Werkzeug in die 96-Well-Probenplatte legen.Heben Sie das Stiftwerkzeug nach 30 Sekunden gerade nach oben und legen Sie es für 30 Sekunden gerade auf eine Nitrocellulosemembran. Nach fünf Minuten Trocknung legen Sie die Nitrocellulosemembran in eine transparente Kunststoffmappe zur Speicherung von Phosphor und zur Visualisierung durch Phosphorbildgebung, wie gezeigt. Um potenzielle Zielproteine zu quantifizieren und zu identifizieren, öffnen Sie in der Analysesoftware, die mit dem Phosphor-Imager verbunden ist, die Geldatei der visualisierten Platten.Um die zu analysierenden Punkte zu definieren, verwenden Sie die Array-Analysefunktion, um ein 12-spaltend mit acht Zeilen einzurichten. Um den äußeren Rand der Lochpunkte einzukreisen, definieren Sie große Kreise, exportieren Sie das Volumen plus Hintergrund und Fläche der definierten großen Kreise in eine Tabelle. Um die kleinen inneren Punkte einzuschließen, verkleinern Sie die definierten Kreise, exportieren Sie das Volumen plus Hintergrund und Fläche der definierten kleinen Kreise und speichern Sie alle Daten in der Tabelle.Positionieren Sie Kreise so, dass sie sich bei Bedarf mit Punkten überlappen, und erhöhen Sie die Größe der etwas größeren als die tatsächlichen Flecken. Verwenden Sie die Gleichung, um die Bindungsbrüche in der Tabelle zu berechnen und die Daten zu plotten. Identifizieren Sie dann die potenziellen Bindungsproteine in den Vertiefungen, die im Vergleich zu den meisten anderen Vertiefungen hohe Bindungsfraktionen aufweisen.Bei dieser repräsentativen Analyse kann in den meisten Vertiefungen eine Platte mit relativ geringen Hintergrundbindungssignalen beobachtet werden. Das positive Bindungssignal in Bohrung H3 zeigte eine Bindungsfraktion, die aufgrund der Überexpression des Guanosinpentaphosphat-bindenden Proteins Hpt viel höher war als bei den anderen Vertiefungen. In den repräsentativen Platten zeigten mehrere Vertiefungen ein relativ höheres Hintergrundbindungssignal, wie die relativ starken inneren Punkte, die in vielen Vertiefungen beobachtet wurden, sowie die nach der Quantifizierung beobachteten konstant hohen Bindungsfraktionen zeigen.Bemerkenswerterweise ergaben einige Ziele auch variable Bindungsbrüche, wie z. B. die falsch positiven Ergebnisse. Zur weiteren Klärung verwendeten die Forscher gereinigte Proteine, um die Bindung erneut zu testen. Sobald die Zielproteine identifiziert sind, kann man sie auf Homogenität reinigen und Die Interaktionsstärke und -spezifität bestätigen, indem man entweder DRaCALA, isotherme Titrationskalorimetrie oder andere Methoden verwendet.Die Identifizierung der Zielproteine kleiner Signalmoleküle ebnet den Weg zu einem tiefen Verständnis der Rollen, die sich von der bakteriellen Virulenz bis zur menschlichen Biologie ergeben.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay (DRaCALA)

Identification of Small Molecule-binding Proteins in a Native Cellular Environment by Live-cell Photoaffinity Labeling

Identifizierung von kleinen Molekülen-bindende Proteine ​​in nativer zellulären Umgebung von lebenden Zellen Photoaffinitatsmarkierung

Identifying the molecular target(s) of small molecules is a challenging but necessary step towards understanding their mechanism of action. While several ...

Forschung

Biochemie

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Verfahren zur Identifizierung von niedermolekularen Inhibitoren des Protein-Protein-Wechselwirkung zwischen HCN1- und TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Measuring Biomolecular DSC Profiles with Thermolabile Ligands to Rapidly Characterize Folding and Binding Interactions

Messprofile biomolekularen DSC mit thermolabilen Liganden schnell zu charakterisieren, Falt- und bindende Wechselwirkungen

Differential scanning calorimetry (DSC) is a powerful technique for quantifying thermodynamic parameters governing biomolecular folding and binding ...

Nitrogen Cavitation and Differential Centrifugation Allows for Monitoring the Distribution of Peripheral Membrane Proteins in Cultured Cells

Stickstoff-Kavitation und differentielle Zentrifugation ermöglicht eine Überwachung der Verteilung von peripheren Membranproteinen in kultivierten Zellen

Cultured cells are useful for studying the subcellular distribution of proteins, including peripheral membrane proteins. Genetically encoded fluorescently ...

Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

Rab10 Phosphorylierung Erkennung von LRRK2 Aktivität mit SDS-PAGE mit einem Phosphat-Bindung

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

Capturing the Interaction Kinetics of an Ion Channel Protein with Small Molecules by the Bio-layer Interferometry Assay

Erfassung der Interaktion Kinetics eines Ionenkanals Proteins mit kleinen Molekülen durch die Bio-Schicht Interferometrie Assay

The bio-layer interferometry (BLI) assay is a valuable tool for measuring protein-protein and protein-small molecule interactions. Here, we first describe ...

Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain

Methode für effiziente Umfaltung und Reinigung des Chemorezeptor-Liganden-bindende Domäne

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be ...

Detection of Small GTPase Prenylation and GTP Binding Using Membrane Fractionation and  GTPase-linked Immunosorbent Assay

Erkennung von kleine GTPase Prenylation und GTP binden mit Membran Fraktionierung und GTPase verbundene Immunosorbentprobe Assay

The Rho GTPase family belongs to the Ras superfamily and includes approximately 20 members in humans. Rho GTPases are important in the regulation of ...

Analysis of AtHIRD11 Intrinsic Disorder and Binding Towards Metal Ions by Capillary Gel Electrophoresis and Affinity Capillary Electrophoresis

Analyse der AtHIRD11 inneren Unordnung und Bindung in Richtung Metallionen durch Kapillare Gelelektrophorese und Affinität Kapillarelektrophorese

Plants are strongly dependent on their environment. In order to adjust to stressful changes (e.g., drought and high salinity), higher plants evolve ...

A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors

Eine semi-High-Throughput-Anpassung des NADH-gekoppelten ATPase-Assays zum Screening kleiner Molekülinhibitoren

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would ...