Name: identifying the binding proteins of small ligands with the differential radial capillary action of ligand assay (dracala)
Uploaded: 2021-03-19T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay DRaCALA at JoVE.com

העבודה נתמכת על ידי מענק פרויקט NNF (NNF19OC0058331) ל- YEZ, ותוכנית המחקר והחדשנות Horizon 2020 של האיחוד האירופי במסגרת הסכם המענקים מארי Skłodowska-Curie (Nº 801199) ל- MLS.
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62331/62331img1.jpg">

1. הכנת lysates תא שלם
<ol><li>לחסן את E. coli K-12 ASKA ORFeome אוסף זנים15 לתוך 1.5 מ"ל ציר ליסוגניה (LB) המכיל 25 מיקרוגרם / מ"ל כלורמפניקול ב 96 היטב לוחות באר עמוקה. לגדול לילה (O / N) עבור 18 שעות ב 30 °C (50 °F) עם רועד ב 160 סל"ד. למחרת, להוסיף איזופרופיל β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) (0.5 מ"מ סופי) לתרבויות O/N כדי לגר?...

<ol>
	<li>Kalia, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleotide,+c-di-GMP,+c-di-AMP,+cGMP,+cAMP,+(p)ppGpp+signaling+in+bacteria+and+implications+in+pathogenesis.">Nucleotide, c-di-GMP, c-di-AMP, cGMP, cAMP, (p)ppGpp signaling in bacteria and implications in pathogenesis.</a> Chemical Society Reviews. 42 (1), 305-341 (2013).</li><li>Camilli, A., Bassler, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+small-molecule+signaling+pathways.">Bacterial small-molecule signaling pathways.</a> Science. 311 (5764), 1113-1116 (2006).</li><li>Luo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cAMP+capture+compound+mass+spectrometry+as+a+novel+tool+for+targeting+cAMP-binding+proteins:+from+protein+kinase+A+to+potassium/sodium+hyperpolarization-activated+cyclic+nucleotide-gated+channels.">The cAMP capture compound mass spectrometry as a novel tool for targeting cAMP-binding proteins: from protein kinase A to potassium/sodium hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channels.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 8 (12), 2843-2856 (2009).</li><li>Nesper, J., Reinders, A., Glatter, T., Schmidt, A., Jenal, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+capture+compound+for+the+identification+and+analysis+of+cyclic+di-GMP+binding+proteins.">A novel capture compound for the identification and analysis of cyclic di-GMP binding proteins.</a> Journal of Proteomics. 75 (15), 4874-4878 (2012).</li><li>Laventie, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capture+compound+mass+spectrometry--a+powerful+tool+to+identify+novel+c-di-GMP+effector+proteins.">Capture compound mass spectrometry--a powerful tool to identify novel c-di-GMP effector proteins.</a> Journal of Visual Experiments. (97), e51404 (2015).</li><li>Roelofs, K. G., Wang, J., Sintim, H. O., Lee, V. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+radial+capillary+action+of+ligand+assay+for+high-throughput+detection+of+protein-metabolite+interactions.">Differential radial capillary action of ligand assay for high-throughput detection of protein-metabolite interactions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (37), 15528-15533 (2011).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+adaptation+of+the+essential+tRNA+methyltransferase+TrmD+to+the+signaling+molecule+3+',5+'-cAMP+in+bacteria.">Evolutionary adaptation of the essential tRNA methyltransferase TrmD to the signaling molecule 3 ',5 '-cAMP in bacteria.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (1), 313-327 (2017).</li><li>Corrigan, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+identification+of+conserved+bacterial+c-di-AMP+receptor+proteins.">Systematic identification of conserved bacterial c-di-AMP receptor proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (22), 9084-9089 (2013).</li><li>Roelofs, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+identification+of+cyclic-di-GMP+binding+proteins+in+Vibrio+cholerae+reveals+a+novel+class+of+cyclic-di-GMP-binding+ATPases+associated+with+type+II+secretion+systems.">Systematic identification of cyclic-di-GMP binding proteins in Vibrio cholerae reveals a novel class of cyclic-di-GMP-binding ATPases associated with type II secretion systems.</a> PLoS Pathogen. 11 (10), 1005232 (2015).</li><li>Fang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GIL,+a+new+c-di-GMP-binding+protein+domain+involved+in+regulation+of+cellulose+synthesis+in+enterobacteria.">GIL, a new c-di-GMP-binding protein domain involved in regulation of cellulose synthesis in enterobacteria.</a> Molecular Microbiology. 93 (3), 439-452 (2014).</li><li>Corrigan, R. M., Bellows, L. E., Wood, A., Grundling, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ppGpp+negatively+impacts+ribosome+assembly+affecting+growth+and+antimicrobial+tolerance+in+Gram-positive+bacteria.">ppGpp negatively impacts ribosome assembly affecting growth and antimicrobial tolerance in Gram-positive bacteria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1710-1719 (2016).</li><li>Zhang, Y., Zbornikova, E., Rejman, D., Gerdes, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+(p)ppGpp+binding+and+metabolizing+proteins+of+Escherichia+coli.">Novel (p)ppGpp binding and metabolizing proteins of Escherichia coli.</a> Mbio. 9 (2), 02188 (2018).</li><li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nucleotide+pGpp+acts+as+a+third+alarmone+in+Bacillus,+with+functions+distinct+from+those+of+(p)+ppGpp.">The nucleotide pGpp acts as a third alarmone in Bacillus, with functions distinct from those of (p) ppGpp.</a> Nature Communications. 11 (1), 5388 (2020).</li><li>Orr, M. W., Lee, V. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+radial+capillary+action+of+ligand+assay+(DRaCALA)+for+high-throughput+detection+of+protein-metabolite+interactions+in+bacteria.">Differential radial capillary action of ligand assay (DRaCALA) for high-throughput detection of protein-metabolite interactions in bacteria.</a> Methods in Molecular Biology. 1535, 25-41 (2017).</li><li>Kitagawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+set+of+ORF+clones+of+Escherichia+coli+ASKA+library+(A+complete+Set+of+E.+coli+K-12+ORF+archive):+Unique+resources+for+biological+research.">Complete set of ORF clones of Escherichia coli ASKA library (A complete Set of E. coli K-12 ORF archive): Unique resources for biological research.</a> DNA Research. 12 (5), 291-299 (2005).</li><li>Hochstadt-Ozer, J., Cashel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+purine+utilization+in+bacteria.+V.+Inhibition+of+purine+phosphoribosyltransferase+activities+and+purine+uptake+in+isolated+membrane+vesicles+by+guanosine+tetraphosphate.">The regulation of purine utilization in bacteria. V. Inhibition of purine phosphoribosyltransferase activities and purine uptake in isolated membrane vesicles by guanosine tetraphosphate.</a> Journal of Biological Chemistry. 247 (21), 7067-7072 (1972).</li><li>Zhang, Y. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p)ppGpp+regulates+a+bacterial+nucleosidase+by+an+allosteric+two-domain+switch.">p)ppGpp regulates a bacterial nucleosidase by an allosteric two-domain switch.</a> Molecular Cell. 74 (6), 1239-1249 (2019).</li><li>Wang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity-based+capture+and+identification+of+protein+effectors+of+the+growth+regulator+ppGpp.">Affinity-based capture and identification of protein effectors of the growth regulator ppGpp.</a> Nature Chemical Biology. 15 (2), 141-150 (2019).</li></ol>

אחד השלבים הקריטיים בביצוע הקרנת DRaCALA הוא להשיג lysates תא שלם טוב. ראשית, החלבונים שנבדקו צריכים להיות מיוצרים בכמויות גדולות ובצורות מסיסות. שנית, התמותה של התאים צריכה להיות שלמה, ואת הצמיגות של lysate חייב להיות מינימלי. הכללת lysozyme ושימוש בשלושה מחזורים של הפשרת הקפאה הם לעתים קרובות מספיק כד...

חיידקים משתמשים במספר מולקולות איתות קטנות כדי להסתגל לסביבות המשתנות כל הזמן1,2. לדוגמה, יצרני הרכב, לקטוניםN-acylhomoserine ואוליגופפטידים מותאמים שלהם, לתווך את התקשורת הבין תאית בין חיידקים כדי לתאם את התנהגות האוכלוסייה, תופעה המכונה מניין חישה2. קבוצה נוספת של מולקולות איתות קטנות היא ה- NSMs, כולל המונופוספט אדנוסין מחזורי הנחקר הנחקר (cAMP), די-AMP מחזורי, מונופוספט די-גואנוסין מחזורי (di-GMP מחזורי), וגואנוסין פנטה וטטרה פוספטים (p)ppGpp1. חיידקים מייצרים NSMs אלה כתגובה למגוון של תנאי לחץ שונים. לאחר הייצור, מולקולות אלה נקשרות לחלבוני היעד שלהן ומווסתות מספר מסלולים פיזיולוגיים ומטבוליים שונים כדי להתמודד עם הלחצים שנתקלו ולשפר את הישרדות החיידקים. לכן, זיהוי חלבוני היעד הוא תנאי מוקדם בלתי נמנע לפענוח הפונקציות המולקולריות של מולקולות קטנות אלה.
העשור האחרון היה עד לפריחה של ידע על מולקולות איתות קטנות אלה, בעיקר בשל מספר חידושים טכניים שחשפו את חלבוני היעד של מולקולות קטנות אלה. אלה כוללים את טכניקת תרכובת לכידה3,4,5, ואת הפעולה נימי רדיאלי דיפרנציאלי של ליגנד אסאי (DRaCALA)6 כדי לדון במאמר זה.
הומצא על ידי וינסנט לי ושותפיו לעבודה בשנת 20116,DRaCALA פורס את היכולת של קרום ניטרוצלולוז לבודד דיפרנציאלי ללא ליגנדים הקשורים לחלבון. מולקולות כגון חלבונים אינן יכולות לפזר על קרום ניטרוצלולוז, בעוד ליגנדים קטנים, כגון NSMs, מסוגלים. על ידי ערבוב ה- NSM (למשל,ppGpp) עם החלבון שייבדק וזיהוים על הממברנה, ניתן לצפות לשני תרחישים (איור 1):אם (p)ppGpp נקשר לחלבון, ה- radiolabeled (p)ppGpp יישמר במרכז המקום על ידי החלבון ולא יפזר כלפי חוץ, וייתן נקודה קטנה ואינטנסיבית (כלומר. אות רדיואקטיבי חזק) תחת זרחן. עם זאת, אם (p)pppp אינו נקשר לחלבון, הוא יפזר בחופשיות כלפי חוץ כדי לייצר נקודה גדולה עם אות רדיואקטיבי ברקע אחיד.
יתר על כן, DRaCALA יכול לזהות את האינטראקציה בין מולקולה קטנה וחלבון לא מנוצל בתא שלם ליסייט אם החלבון קיים בכמות מספקת. פשטות זו מאפשרת שימוש ב- DRaCALA בזיהוי מהיר של מטרות חלבון באמצעות ספריית ביטוי ORFeome. ואכן, חלבוני היעד של cAMP7, די-AMPמחזורי 8, די-GMP מחזורי9,10, ו (p)ppGpp11,12,13 זוהו באופן שיטתי באמצעות DRaCALA. מאמר וידאו זה משתמש (p)ppGpp כדוגמה כדי להדגים ולתאר את השלבים והשיקולים הקריטיים בביצוע הקרנת DRaCALA מוצלחת. הערה, תיאור יסודי יותר של DRaCALA14 מומלץ מאוד לקרוא בשילוב עם מאמר זה לפני ביצוע DRaCALA.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62331/62331fig01.jpg"> איור 1: העיקרון של DRaCALA. (א)סכמטי של תפילת DRaCALA. עיין בטקסט לקבלת פרטים. (B)כימות וחישוב של שבר האיגוד. עיין בטקסט לקבלת פרטים. בקצרה, כתמי DRaCALA ינותחו על ידי ציור שני עיגולים שמגבילים את כל הנקודה ואת הנקודה הכהה הפנימית (כלומר,נשמר (p)pppp עקב כריכת החלבון שנבדק). אות האיגוד הספציפי הוא האות הרדיואקטיבי של המעגל הפנימי (S1) לאחר חיסור אות הרקע הלא ספציפי (מחושב על-ידי A1 × ((S2-S1)/(A2-A1))). שבר האיגוד הוא אות האיגוד הספציפי חלקי האות הרדיואקטיבי הכולל (S2). קיצורים: DRaCALA = פעולה נימית רדיאלית דיפרנציאלית של ליגנד אסאי; (p)ppGpp = גואנוסין פנטה וטטרפוספטים; RT = טמפרטורת החדר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62331/62331fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>32P-&#945;-GTP</td>
			<td>Perkinelmer</td>
			<td>BLU006X250UC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 x pin tool</td>
			<td>V&#38;P Scientific</td>
			<td>VP 404</td>
			<td>96 Bolt Replicator, on 9 mm centers, 4.2 mm Bolt Diameter, 24 mm long</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well V-bottom microtiter plate</td>
			<td>Sterilin</td>
			<td>MIC9004</td>
			<td>Sterilin Microplate V Well 611V96</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>OXOID - Thermo Fisher</td>
			<td>LP0011</td>
			<td>Agar no. 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ASKA collection strain</td>
			<td>NBRP, SHIGEN, JAPAN</td>
			<td></td>
			<td>Ref: DNA Research, Volume 12, Issue 5, 2005, Pages 291&#8211;299. https://doi.org/10.1093/dnares/dsi012</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>E1014-25KU</td>
			<td>genetically engineered endonuclease from Serratia marcescens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford Protein Assay Dye</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>5000006</td>
			<td>Reagent Concentrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D8418</td>
			<td>&#8805;99.9%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase 1</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>DN25-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gel filtration10x300 column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28990944</td>
			<td>contains 20% ethanol as preservative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>122329.1214</td>
			<td>Glycerol 87% for analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypercassette</td>
			<td>Amersham</td>
			<td>RPN 11647</td>
			<td>20 x 40 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>56750</td>
			<td>puriss. p.a., &#8805; 99.5% (GC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IP Storage Phosphor Screen</td>
			<td>FUJIFILM</td>
			<td>28956474</td>
			<td>BAS-MS 2040 20x 40 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>I6758</td>
			<td>Isopropyl &#946;-D-thiogalactoside</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysogeny Broth (LB)</td>
			<td>Invitrogen - Thermo Fisher</td>
			<td>12795027</td>
			<td>Miller&#39;s LB Broth Base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>L4949</td>
			<td>from chicken egg white; BioUltra, lyophilized powder, &#8805;98%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 (Magnesium chloride)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>208337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliQ water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ultrapure water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multichannel pipette</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>4661110</td>
			<td>F1 - Clip Tip; 1-10 ul, 8 x channels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>27810</td>
			<td>AnalaR NORMAPUR, ACS, Reag. Ph. Eur.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Agarose</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>30230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose Blotting Membrane</td>
			<td>Amersham Protran</td>
			<td>10600003</td>
			<td>Premium 0.45 um 300 mm x 4 m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>OXOID - Thermo Fisher</td>
			<td>BR0014G</td>
			<td>Phosphate buffered saline (Dulbecco A), Tablets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG3350 (Polyethylene glycol 3350)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>202444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>93482</td>
			<td>Phenylmethanesulfonyl fluoride solution - 0.1 M in ethanol (T)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphor-imager</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28955809</td>
			<td>Typhoon FLA-7000 Phosphor-imager</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips, filtered</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>94410040</td>
			<td>ClipTip 12.5 &#956;l nonsterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-Prep Chromatography column</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7311550</td>
			<td>polypropylene chromatography column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor Mini</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>A32955</td>
			<td>Tablets, EDTA-free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>screw cap tube</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3488</td>
			<td>Microcentifuge Tubes, 2.0 ml with screw cap, nonsterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SLS 96-deep Well plates</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>780285</td>
			<td>MASTERBLOCK, 2 ML, PP, V-Bottom, Natural</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spin column</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC500396</td>
			<td>Amicon Ultra -0.5 ml Centrifugal Filters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5382000015</td>
			<td>Thermomixer C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC plate (PEI-cellulose F TLC plates)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>105579</td>
			<td>DC PEI-cellulose F (20 x 20 cm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>BP152</td>
			<td>Tris Base for Molecular Biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P1379</td>
			<td>viscous non-ionic detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>M3148</td>
			<td>99% (GC/titration)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identifying the binding proteins of small ligands with the differential radial capillary action of ligand assay (dracala)

בעשור האחרון חלה התקדמות עצומה בהבנת מולקולות איתות קטנות בפיזיולוגיה חיידקית. בפרט, חלבוני היעד של מספר שליחים משניים שמקורם בנוקלאוטידים (NSMs) זוהו ונחקרו באופן שיטתי באורגניזמים לדוגמה. הישגים אלה נובעים בעיקר מהתפתחות של מספר טכניקות חדשות, כולל טכניקת תרכובת הלכידה והפעולה הרדיאלית הרדיאלית הדיפרנציאלית של ליגנד אסאי (DRaCALA), אשר שימשו לזיהוי שיטתי של חלבוני יעד של מולקולות קטנות אלה. מאמר זה מתאר את השימוש ב- NSMs, גואנוסין פנטה וטטרפוספטים (p)ppGpp, כדוגמה והדגמת וידאו של טכניקת DRaCALA. באמצעות DRaCALA, 9 מתוך 20 ידוע ו -12 חלבוני יעד חדשים של (p)ppGpp זוהו באורגניזם המודל, Escherichia coli K-12, מדגים את כוחו של מבחנים אלה. באופן עקרוני, DRaCALA יכול לשמש לחקר ליגנדים קטנים שניתן לתייג על ידי איזוטופים רדיואקטיביים או צבעים פלואורסצנטיים. הצעדים הקריטיים, היתרונות והחסרונות של DRaCALA נדונים כאן ליישום נוסף של טכניקה זו.

ביצוע הפרוטוקול המתואר לעיל יניב בדרך כלל שני סוגי תוצאות (איור 3).
איור 3A מציג לוח עם אותות כריכה נמוכים יחסית ברקע (שברים מחייבים < 0.025) מרוב בארות. אות האיגוד החיובי מהבאר H3 נותן שבר מחייב של ~ 0.35 שהוא הרבה יותר גבוה מזה שנצפה עבור בארות אחרות. ?...

Watch this Scientific Journal Video about Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay DRaCALA at JoVE.com

Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay DRaCALA

הפעולה הרדיאלית הרדיאלית של Ligand Assay (DRaCALA) יכולה לשמש לזיהוי חלבונים קטנים מחייבים ליגנד של אורגניזם באמצעות ספריית ORFeome.

זיהוי החלבונים המחייבים של ליגנדים קטנים עם הפעולה הרדיאלית הרדיאלית הדיפרנציאלית של ליגנד אסאי (DRaCALA)

The past decade has seen tremendous progress in the understanding of small signaling molecules in bacterial physiology. In particular, the target proteins ...

מולקולות איתות קטנות מכוונות לחלבונים משפיעים שונים כדי לשלוט בנדיפות החיידקים ובביולוגיה האנושית. עם זאת, חלבונים משפיעים אלה מאתגרים לזיהוי. ככלי ביולוגי של מערכות, DRaCALA מאפשר זיהוי ריאלי, מהיר ורגיש מאוד של חלבונים משפיעים לא ידועים באמצעות ספריית OVium.DRaCALA יכול לשמש כדי ללמוד כל מולקולת איתות קטנה כל עוד זה יכול להיות מתויג עם איזוטופ רדיואקטיבי או צבעים פלואורסצנטיים. התחל על ידי חנק E.coli לתוך 1.5 מיליליטר של LB בתוספת עם 25 מיקרוגרם למיליליטר כלורמפניקול בכל באר של 96 היטב צלחות באר עמוקה עבור דגירה לילה ב 30 מעלות צלזיוס ו 160 סיבובים לדקה. למחרת בבוקר, לטפל בתרביות הלילה עם 500 IPTG מיקרומולרי במשך שש שעות ב 30 מעלות צלזיוס כדי לגרום ביטוי חלבון.בסוף הדגירה, גלולה את התאים על ידי centrifugation, להסיר את supernatant, ולהקפיא את הדגימות במינוס 80 מעלות צלזיוס. כדי ליזום תמוגה, resuspend הכדורים ב 150 microliters של חוצץ תמוגה אחד לכל באר עבור דגירה של 30 דקות במינוס 80 מעלות צלזיוס לפני הפשרת התאים במשך 20 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן יש לאחסן את ה- lysate במינוס 80 מעלות צלזיוס לפני השימוש.כדי להשלים את התמוגה של תאים עם חלבונים בלחץ יתר, resuspened הדגימות ב 40 מיליליטר של חיץ תמוגה קר קרח שני sonicate הדגימות ב 60% משרעת בשתי שניות על ארבע שניות את במשך שמונה דקות, ולאחר מכן לנקות את lysates על ידי צנטריפוגה. בזמן שהדגימות נמצאות בצנטריפוגה, הוסיפו 500 מיקרוליטרים של שרף ניקל-NTA הומוגני לעמודה עומדת של כרומטוגרפיה פוליפרופילן. לאחר 15 דקות, לשטוף את השרף מיושב פעמיים עם 15 מיליליטר של מים אולטרה-תותים ופעם אחת עם 15 מיליליטר של חיץ תמיס שני.בסוף המאה, טען את הסופר-נט המנוקה על העמוד. כאשר כל lysate זרם דרך העמודה, לשטוף את העמודה עם 30 מיליליטר של חוצץ כביסה. כדי לחמוק מהחלבונים, הוסיפו לטור נפח של 400 מיקרוליטר של חיץ אלוטיון וחזרו על ההבחנה שלוש פעמים.עוד 300 נפח מיקרוליטר של מאגר האלוטיון כדי לחזור על ההעפרה שלוש פעמים ולשלב את החלבונים הנבהרים בנפח סופי של 700 מיקרוליטרים. לסינון ג'ל של הדגימה הנבהרת, לאחר שטיפת עמודת אי-הכללה בגודל עם 25 מיליליטר של מאגר סינון ג'ל שהוכן זה עתה, העמיסו את כל הנפח של חלבון מלוטש על העמוד באמצעות לולאת מיקרוליטר של 500. הפעל ב 500 microliters לדקה ולאסוף שניים עד שלושה שברי נפח microliter 500 של החלבונים המתאימים.לאחר מכן השתמש בעמודי ספין בודדים כדי לרכז כל חלבון ולהשתמש בערכת ההסתה של ברדפורד כדי למדוד את ריכוזי החלבון על פי פרוטוקולים סטנדרטיים. כדי לסנתז את הזרחן 32 שכותרתו גואנוסין פנטפוספט, להרכיב תגובת Relseq בקנה מידה קטן בצינור כתר בורג כפי שמתואר בטבלה ודגרה התגובה ThermoMixer במשך שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס וחמש דקות ב 95 מעלות צלזיוס, ואחריו חמש דקות על קרח. בסוף הדגירה, לסובב את החלבון זירוז על ידי צנטריפוגה ולהעביר את זרחן מסונתז 32 שכותרתו גואנוסין פנטפוספט המכיל supernatant לצינור בורג חדש capped.עבור זרחן 32 גואנוסין טטרפוספט סינתזה, להוסיף GppA מיקרומולר אחד למחצית של זרחן 32 מסומן גואנוסין פנטפוספט המוצר בצינור בורג חדש כתרים לדגור את התגובה במשך 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, חמש דקות ב 95 מעלות צלזיוס, וחמש דקות על קרח. בסוף הדגירה, לסובב את המשקעים על ידי צנטריפוגה ולהעביר את הזרחן 32 שכותרתו גואנוסין טטרפוספט המכיל supernatant לצינור חדש. כדי לנתח את חלבוני היעד המבודדים, הפעל מיקרוליטר אחד של כל דגימה על צלחת כרומטוגרפיה שכבה דקה באמצעות 1.5 מונפוטסיום פוספט טוחנת כשלב הנייד.לאחר הניתוח, מניחים את הצלחת היבשה בתיקיית פלסטיק שקופה וחושפים את הצלחת למסך זרחן אחסון למשך חמש דקות לפני שהם מדמים ומכומתים את הנתונים על צלם זרחן. להקרנת DRaCALA של חלבוני היעד, הוסיפו 20 מיקרוליטרים של ליסאטים סיטונאיים מופשרים לבארות בודדות של צלחת מיקרוטיטר V-תחתון 95 טובה והוסיפו 2.5 יחידות של Serratia marcescens אנדונוצ'לאז לכל באר. לאחר 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, מניחים את lysates על קרח במשך 20 דקות.לאחר מכן, מערבבים כמויות שוות של זרחן 32 שכותרתו גואנוסין פנטפוספט וגואנוסין טטרפוספט ולהוסיף 1X תמוגה חוצץ אחד לתערובת כדי לקבל פתרון פנטפוספט גואנוסין ארבעה ננומולר. בעזרת פיפטה רב-ערוצית וטיפים מסוננים של פיפטה, מערבבים 10 מיקרוליטרים של תערובת הגואנוסין פנטפוספט עם התא ליסייט לדגירה של חמש דקות בטמפרטורת החדר. בסוף הדגירה, לשטוף כלי פין 96X שלוש פעמים בתמיסה 0.01%של חומר ניקוי לא יוני במשך 30 שניות, ואחריו 30 שניות של ייבוש על מגבת נייר לכל לשטוף לפני הצבת כלי הסיכה בצלחת מדגם 96 היטב.לאחר 30 שניות, הרם את כלי הסיכה ישר למעלה והנח אותו ישר למטה על קרום ניטרוצלולוז במשך 30 שניות. לאחר חמש דקות של ייבוש, מניחים את קרום הניטרוצלולוז בתיקיית פלסטיק שקופה לחשיפה למסך זרחן לאחסון והדמיה על ידי הדמיית זרחן כפי שהודגם. כדי לכמת ולזהות חלבוני יעד פוטנציאליים, בתוכנת הניתוח המשויכת לדימוי הזרחן, פתח את קובץ הג'ל של הלוחות החזותיים.כדי להגדיר את הכתמים שיש לנתח, השתמש בפונקציית ניתוח המערך כדי להגדיר רשת שורות של 12 עמודות בשמונה. כדי להגביל את הקצה החיצוני של נקודות החור, הגדר עיגולים גדולים, יצא את עוצמת הקול ואת האזור של העיגולים הגדולים המוגדרים לגיליון אלקטרוני. כדי להגביל את הנקודות הפנימיות הקטנות, הגדל את העיגולים המוגדרים, יצא את אמצעי האחסון ואת האזור של העיגולים הקטנים המוגדרים ושמור את כל הנתונים בגיליון האלקטרוני.מקם עיגולים לחפיפה עם כתמים לפי הצורך, שינוי גודל של כתמים מעט גדולים יותר מאשר כתמים בפועל. השתמש במשוואה כדי לחשב את שברי האיגוד בגיליון האלקטרוני ולתוות את הנתונים. לאחר מכן לזהות את החלבונים הכרוכים הפוטנציאליים בבארות המציגים שברים מחייבים גבוהים בהשוואה לרוב בארות אחרות.בניתוח מייצג זה, צלחת עם אותות כריכה רקע נמוך יחסית ברוב בארות ניתן לראות. אות הכריכה החיובי ב- H3 הציג שבר מחייב שהיה גבוה בהרבה מזה שנצפה עבור בארות אחרות עקב ביטוי יתר של חלבון מחייב גואנוסין פנטפוספט Hpt. בלוחות הייצוגיים, מספר בארות הראו אותות כריכה גבוהים יחסית ברקע כפי שצוין על ידי הנקודות הפנימיות החזקות יחסית שנצפו בבארות רבות, כמו גם את שברי הכריכה הגבוהים בעקביות שנצפו לאחר הכימות.ראוי לציין כי חלק מהיעדים גם נתנו שברי איגוד משתנים, כגון תוצאות חיוביות שגויות. כדי להבהיר עוד יותר, החוקרים השתמשו חלבונים מטוהרים כדי לבדוק את הכריכה שוב. ברגע שחלבוני היעד מזוהים, אפשר לטהר אותם להומוגניות ולאשר כוח וספציפיות אינטראקציה באמצעות DRaCALA, קלורימטריה איזותרמית או שיטות אחרות.זיהוי חלבוני היעד של מולקולות איתות קטנות סולל את הדרך להבנה מעמיקה של התפקידים העולים מארס חיידקים לביולוגיה אנושית.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay (DRaCALA)

Identification of Small Molecule-binding Proteins in a Native Cellular Environment by Live-cell Photoaffinity Labeling

זיהוי של חלבונים קושרי מולקולה קטנים בסביבה נייד Native ידי תיוג Live- תא Photoaffinity

Identifying the molecular target(s) of small molecules is a challenging but necessary step towards understanding their mechanism of action. While several ...

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

שיטה לזיהוי מולקולה קטנה מעכבים של האינטראקציה בין החלבונים בין HCN1 ו TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Measuring Biomolecular DSC Profiles with Thermolabile Ligands to Rapidly Characterize Folding and Binding Interactions

מדידת למערכות ביולוגיות DSC פרופילים עם Thermolabile ליגנדים לאפיין במהירות קיפול ואיגוד אינטראקציות

Differential scanning calorimetry (DSC) is a powerful technique for quantifying thermodynamic parameters governing biomolecular folding and binding ...

Nitrogen Cavitation and Differential Centrifugation Allows for Monitoring the Distribution of Peripheral Membrane Proteins in Cultured Cells

קוויטציה חנקן, צנטריפוגה דיפרנציאלית מאפשר ניטור ההתפלגות של חלבוני ממברנה פריפריאלי בתאים בתרבית

Cultured cells are useful for studying the subcellular distribution of proteins, including peripheral membrane proteins. Genetically encoded fluorescently ...

Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

Rab10 זיהוי זרחון על-ידי פעילות LRRK2 באמצעות מרחביות-דף עם תג מחייב פוספט

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

Capturing the Interaction Kinetics of an Ion Channel Protein with Small Molecules by the Bio-layer Interferometry Assay

לכידת את האינטראקציה קינטיקה החלבון תעלת יונים עם מולקולות קטנות על ידי וזמינותו אינטרפרומטריה ביו-שכבה

The bio-layer interferometry (BLI) assay is a valuable tool for measuring protein-protein and protein-small molecule interactions. Here, we first describe ...

Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain

שיטת Refolding יעילה וטיהור של ליגנד Chemoreceptor מחייב תחום

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be ...

Detection of Small GTPase Prenylation and GTP Binding Using Membrane Fractionation and  GTPase-linked Immunosorbent Assay

זיהוי של GTPase Prenylation קטן ו GTP איגוד באמצעות ממברנה Fractionation ו GTPase-מקושרים Immunosorbent Assay

The Rho GTPase family belongs to the Ras superfamily and includes approximately 20 members in humans. Rho GTPases are important in the regulation of ...

Analysis of AtHIRD11 Intrinsic Disorder and Binding Towards Metal Ions by Capillary Gel Electrophoresis and Affinity Capillary Electrophoresis

ניתוח של הפרעה פנימית AtHIRD11 ואיגוד לקראת יוני מתכת על ידי נימי אלקטרופורזה בג'ל אלקטרופורזה נימי זיקה

Plants are strongly dependent on their environment. In order to adjust to stressful changes (e.g., drought and high salinity), higher plants evolve ...

A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors

הסתגלות למחצה בתפוקה גבוהה של מעכבי הנדח ביחד לסינון מולקולה קטנה

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would ...