Name: identifying the binding proteins of small ligands with the differential radial capillary action of ligand assay (dracala)
Uploaded: 2021-03-19T14:30:00
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इस काम को एनएनएफ प्रोजेक्ट ग्रांट (NNF19OC0058331) द्वारा वाईईजेड को समर्थन दिया जाता है, और यूरोपीय संघ के क्षितिज 2020 अनुसंधान और नवाचार कार्यक्रम मैरी स्कालोडोवस्का-क्यूरी अनुदान समझौते (एनओडी 801199) के तहत एमएलएस को समर्थन दिया जाता है।
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62331/62331img1.jpg">

1. पूरे सेल की तैयारी
<ol><li>ई. कोलाई कश्मीर-12 ASKA ORFeome संग्रह15 में उपभेदों १.५ mL Lysogeny शोरबा (पौंड) ९६ में 25 μg/एमएल क्लोराम्फेनिकोल युक्त-अच्छी तरह से गहरी अच्छी तरह से प्लेटें । 160 आरपीएम पर मिलाते हुए 30 ड?...

<ol>
	<li>Kalia, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleotide,+c-di-GMP,+c-di-AMP,+cGMP,+cAMP,+(p)ppGpp+signaling+in+bacteria+and+implications+in+pathogenesis.">Nucleotide, c-di-GMP, c-di-AMP, cGMP, cAMP, (p)ppGpp signaling in bacteria and implications in pathogenesis.</a> Chemical Society Reviews. 42 (1), 305-341 (2013).</li><li>Camilli, A., Bassler, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+small-molecule+signaling+pathways.">Bacterial small-molecule signaling pathways.</a> Science. 311 (5764), 1113-1116 (2006).</li><li>Luo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cAMP+capture+compound+mass+spectrometry+as+a+novel+tool+for+targeting+cAMP-binding+proteins:+from+protein+kinase+A+to+potassium/sodium+hyperpolarization-activated+cyclic+nucleotide-gated+channels.">The cAMP capture compound mass spectrometry as a novel tool for targeting cAMP-binding proteins: from protein kinase A to potassium/sodium hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channels.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 8 (12), 2843-2856 (2009).</li><li>Nesper, J., Reinders, A., Glatter, T., Schmidt, A., Jenal, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+capture+compound+for+the+identification+and+analysis+of+cyclic+di-GMP+binding+proteins.">A novel capture compound for the identification and analysis of cyclic di-GMP binding proteins.</a> Journal of Proteomics. 75 (15), 4874-4878 (2012).</li><li>Laventie, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capture+compound+mass+spectrometry--a+powerful+tool+to+identify+novel+c-di-GMP+effector+proteins.">Capture compound mass spectrometry--a powerful tool to identify novel c-di-GMP effector proteins.</a> Journal of Visual Experiments. (97), e51404 (2015).</li><li>Roelofs, K. G., Wang, J., Sintim, H. O., Lee, V. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+radial+capillary+action+of+ligand+assay+for+high-throughput+detection+of+protein-metabolite+interactions.">Differential radial capillary action of ligand assay for high-throughput detection of protein-metabolite interactions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (37), 15528-15533 (2011).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+adaptation+of+the+essential+tRNA+methyltransferase+TrmD+to+the+signaling+molecule+3+',5+'-cAMP+in+bacteria.">Evolutionary adaptation of the essential tRNA methyltransferase TrmD to the signaling molecule 3 ',5 '-cAMP in bacteria.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (1), 313-327 (2017).</li><li>Corrigan, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+identification+of+conserved+bacterial+c-di-AMP+receptor+proteins.">Systematic identification of conserved bacterial c-di-AMP receptor proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (22), 9084-9089 (2013).</li><li>Roelofs, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+identification+of+cyclic-di-GMP+binding+proteins+in+Vibrio+cholerae+reveals+a+novel+class+of+cyclic-di-GMP-binding+ATPases+associated+with+type+II+secretion+systems.">Systematic identification of cyclic-di-GMP binding proteins in Vibrio cholerae reveals a novel class of cyclic-di-GMP-binding ATPases associated with type II secretion systems.</a> PLoS Pathogen. 11 (10), 1005232 (2015).</li><li>Fang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GIL,+a+new+c-di-GMP-binding+protein+domain+involved+in+regulation+of+cellulose+synthesis+in+enterobacteria.">GIL, a new c-di-GMP-binding protein domain involved in regulation of cellulose synthesis in enterobacteria.</a> Molecular Microbiology. 93 (3), 439-452 (2014).</li><li>Corrigan, R. M., Bellows, L. E., Wood, A., Grundling, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ppGpp+negatively+impacts+ribosome+assembly+affecting+growth+and+antimicrobial+tolerance+in+Gram-positive+bacteria.">ppGpp negatively impacts ribosome assembly affecting growth and antimicrobial tolerance in Gram-positive bacteria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1710-1719 (2016).</li><li>Zhang, Y., Zbornikova, E., Rejman, D., Gerdes, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+(p)ppGpp+binding+and+metabolizing+proteins+of+Escherichia+coli.">Novel (p)ppGpp binding and metabolizing proteins of Escherichia coli.</a> Mbio. 9 (2), 02188 (2018).</li><li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nucleotide+pGpp+acts+as+a+third+alarmone+in+Bacillus,+with+functions+distinct+from+those+of+(p)+ppGpp.">The nucleotide pGpp acts as a third alarmone in Bacillus, with functions distinct from those of (p) ppGpp.</a> Nature Communications. 11 (1), 5388 (2020).</li><li>Orr, M. W., Lee, V. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+radial+capillary+action+of+ligand+assay+(DRaCALA)+for+high-throughput+detection+of+protein-metabolite+interactions+in+bacteria.">Differential radial capillary action of ligand assay (DRaCALA) for high-throughput detection of protein-metabolite interactions in bacteria.</a> Methods in Molecular Biology. 1535, 25-41 (2017).</li><li>Kitagawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+set+of+ORF+clones+of+Escherichia+coli+ASKA+library+(A+complete+Set+of+E.+coli+K-12+ORF+archive):+Unique+resources+for+biological+research.">Complete set of ORF clones of Escherichia coli ASKA library (A complete Set of E. coli K-12 ORF archive): Unique resources for biological research.</a> DNA Research. 12 (5), 291-299 (2005).</li><li>Hochstadt-Ozer, J., Cashel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+purine+utilization+in+bacteria.+V.+Inhibition+of+purine+phosphoribosyltransferase+activities+and+purine+uptake+in+isolated+membrane+vesicles+by+guanosine+tetraphosphate.">The regulation of purine utilization in bacteria. V. Inhibition of purine phosphoribosyltransferase activities and purine uptake in isolated membrane vesicles by guanosine tetraphosphate.</a> Journal of Biological Chemistry. 247 (21), 7067-7072 (1972).</li><li>Zhang, Y. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p)ppGpp+regulates+a+bacterial+nucleosidase+by+an+allosteric+two-domain+switch.">p)ppGpp regulates a bacterial nucleosidase by an allosteric two-domain switch.</a> Molecular Cell. 74 (6), 1239-1249 (2019).</li><li>Wang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity-based+capture+and+identification+of+protein+effectors+of+the+growth+regulator+ppGpp.">Affinity-based capture and identification of protein effectors of the growth regulator ppGpp.</a> Nature Chemical Biology. 15 (2), 141-150 (2019).</li></ol>

DRaCALA स्क्रीनिंग प्रदर्शन में महत्वपूर्ण चरणों में से एक अच्छा पूरे सेल lysates प्राप्त करने के लिए है । सबसे पहले, परीक्षण प्रोटीन बड़ी मात्रा में और घुलनशील रूपों में उत्पादित किया जाना चाहिए। दूसरा, कोशिक?...

बैक्टीरिया लगातार बदलते वातावरण के अनुकूल होने के लिए कई छोटे संकेत अणुओं का उपयोग करते हैं1,2. उदाहरण के लिए, ऑटोइंडर्स, एन-एकिलहोमोसेरीन लैक्टोन और उनके संशोधित ओलिगोपेप्टाइड्स, जनसंख्या व्यवहार को समन्वित करने के लिए बैक्टीरिया के बीच अंतरकोशिकीय संचार में मध्यस्थता करते हैं, एक घटना जिसे कोरम संवेदन2के रूप में जाना जाता है। छोटे सिग्नलिंग अणुओं का एक अन्य समूह एनएसएम है, जिसमें व्यापक रूप से अध्ययन किया गया साइक्लिक एडेनोसाइन मोनोफोस्फेट (सीएएमपी), चक्रीय डी-एएमपी, साइक्लिक डी-ग्वानोसाइन मोनोफॉस्फेट (चक्रीय डी-जीएमपी), और ग्वानोसाइन पेंटा-और टेट्रा फॉस्फेट (पी) पीपीजीपी1शामिल हैं। बैक्टीरिया विभिन्न तनाव की स्थिति की एक प्रतिक्रिया के रूप में इन NSMs का उत्पादन। एक बार उत्पादित होने के बाद, ये अणु अपने लक्षित प्रोटीन से बांधते हैं और सामने आए तनावों से निपटने और बैक्टीरियल अस्तित्व को बढ़ाने के लिए कई अलग-अलग शारीरिक और मेटाबोलिक रास्तों को विनियमित करते हैं। इसलिए, इन छोटे अणुओं के आणविक कार्यों को समझने के लिए लक्षित प्रोटीन की पहचान एक अपरिहार्य शर्त है ।
पिछले दशक में इन छोटे संकेत अणुओं के ज्ञान का बूम देखा गया है, मुख्य रूप से कई तकनीकी नवाचारों के कारण है कि इन छोटे अणुओं के लक्ष्य प्रोटीन का अनावरण किया । इनमें कैप्चर कंपाउंड तकनीक3,4,5,और लिगांड परख (DRaCALA) 6 की अंतर रेडियल केशिका कार्रवाईशामिल है जो इस पेपर में चर्चा की जानी है।
20116में विंसेंट ली और सह-कार्यकर्ताओं द्वारा आविष्कार किया गया, DRaCALA एक नाइट्रोसेल्यूलोस झिल्ली की क्षमता को अलग-अलग तनहा मुक्त और प्रोटीन-बाध्य लिगांड के लिए तैनात करता है। प्रोटीन जैसे अणु नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली पर फैला नहीं सकते, जबकि एनएसएम जैसे छोटे लिगामेंट्स कर सकते हैं । एनएसएम(जैसे,पीपीजीपी) को प्रोटीन के साथ मिलाकर, दो परिदृश्यों की उम्मीद की जा सकती है(चित्र 1): यदि(पी) पीपीजीपी प्रोटीन से बांधता है, तो रेडियोलेबल (पी) पीपीजीपी को प्रोटीन द्वारा स्थान के केंद्र में रखा जाएगा और बाहरी रूप से फैलाना नहीं होगा, जिससे एक तीव्र छोटी डॉट(यानी., एक फॉस्फोरमगर के नीचे मजबूत रेडियोधर्मी संकेत) । हालांकि, अगर (पी) ppGpp प्रोटीन के लिए बाध्य नहीं करता है, यह स्वतंत्र रूप से जावक फैलाना करने के लिए एक समान पृष्ठभूमि रेडियोधर्मी संकेत के साथ एक बड़े स्थान का उत्पादन होगा ।
इसके अलावा, DRaCALA एक छोटे से अणु और एक पूरी कोशिका में एक अशुद्ध प्रोटीन के बीच बातचीत का पता लगा सकते है अगर प्रोटीन एक पर्याप्त मात्रा में मौजूद है । यह सादगी एक ORFeome अभिव्यक्ति पुस्तकालय का उपयोग करके तेजी से प्रोटीन लक्ष्यों की पहचान करने में DRaCALA के उपयोग की अनुमति देता है । दरअसल, DRACALA का उपयोग करके सीएएएमपी7,चक्रीय डी-एएमपी8,चक्रीय दी-जीएमपी9,10,और (पी) पीपीजीपी11,12,13 के लक्षित प्रोटीन को व्यवस्थित रूप से पहचाना गया है। यह वीडियो लेख एक सफल DRaCALA स्क्रीनिंग प्रदर्शन में महत्वपूर्ण कदमों और विचारों को प्रदर्शित करने और वर्णन करने के लिए एक उदाहरण के रूप में (पी) पीपीजीपीपी का उपयोग करता है। ध्यान दें, DRaCALA14 का अधिक गहन विवरण DRaCALA प्रदर्शन करने से पहले इस लेख के साथ संयोजन में पढ़ने की अत्यधिक सिफारिश की जाती है।
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62331/62331fig01.jpg"> चित्रा 1:DRaCALA का सिद्धांत। (A)DRaCALA परख की योजनाबद्ध । विवरण के लिए पाठ देखें। (ख)बाध्यकारी अंश की मात्राकरण और गणना । विवरण के लिए पाठ देखें। संक्षेप में, DRaCALA स्पॉट दो हलकों कि पूरे स्थान और भीतरी अंधेरे डॉट(यानी, बनाए रखा (पी) परीक्षण प्रोटीन के बाध्यकारी के कारण ppGpp परिमाक्रय ड्राइंग द्वारा विश्लेषण किया जाएगा । विशिष्ट बाध्यकारी संकेत गैर-विशिष्ट पृष्ठभूमि संकेत को घटाने के बाद इनर सर्कल (S1) का रेडियोधर्मी संकेत है (एक1 × ((एस 2-एस1)/(ए2-ए1))))द्वारा गणना की जाती है। बाध्यकारी अंश कुल रेडियोधर्मी संकेत (S2) द्वारा विभाजित विशिष्ट बाध्यकारी संकेत है। संक्षिप्त नाम: DRaCALA = लिगांड परख की अंतर रेडियल केशिका कार्रवाई; (p)ppGpp = गुआनोसिन पेंटा- और टेट्राफस्फेट; आर टी = कमरे का तापमान। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62331/62331fig01large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>32P-&#945;-GTP</td>
			<td>Perkinelmer</td>
			<td>BLU006X250UC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 x pin tool</td>
			<td>V&#38;P Scientific</td>
			<td>VP 404</td>
			<td>96 Bolt Replicator, on 9 mm centers, 4.2 mm Bolt Diameter, 24 mm long</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well V-bottom microtiter plate</td>
			<td>Sterilin</td>
			<td>MIC9004</td>
			<td>Sterilin Microplate V Well 611V96</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>OXOID - Thermo Fisher</td>
			<td>LP0011</td>
			<td>Agar no. 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ASKA collection strain</td>
			<td>NBRP, SHIGEN, JAPAN</td>
			<td></td>
			<td>Ref: DNA Research, Volume 12, Issue 5, 2005, Pages 291&#8211;299. https://doi.org/10.1093/dnares/dsi012</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>E1014-25KU</td>
			<td>genetically engineered endonuclease from Serratia marcescens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford Protein Assay Dye</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>5000006</td>
			<td>Reagent Concentrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D8418</td>
			<td>&#8805;99.9%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase 1</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>DN25-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gel filtration10x300 column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28990944</td>
			<td>contains 20% ethanol as preservative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>122329.1214</td>
			<td>Glycerol 87% for analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypercassette</td>
			<td>Amersham</td>
			<td>RPN 11647</td>
			<td>20 x 40 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>56750</td>
			<td>puriss. p.a., &#8805; 99.5% (GC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IP Storage Phosphor Screen</td>
			<td>FUJIFILM</td>
			<td>28956474</td>
			<td>BAS-MS 2040 20x 40 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>I6758</td>
			<td>Isopropyl &#946;-D-thiogalactoside</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysogeny Broth (LB)</td>
			<td>Invitrogen - Thermo Fisher</td>
			<td>12795027</td>
			<td>Miller&#39;s LB Broth Base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>L4949</td>
			<td>from chicken egg white; BioUltra, lyophilized powder, &#8805;98%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 (Magnesium chloride)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>208337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliQ water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ultrapure water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multichannel pipette</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>4661110</td>
			<td>F1 - Clip Tip; 1-10 ul, 8 x channels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>27810</td>
			<td>AnalaR NORMAPUR, ACS, Reag. Ph. Eur.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Agarose</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>30230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose Blotting Membrane</td>
			<td>Amersham Protran</td>
			<td>10600003</td>
			<td>Premium 0.45 um 300 mm x 4 m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>OXOID - Thermo Fisher</td>
			<td>BR0014G</td>
			<td>Phosphate buffered saline (Dulbecco A), Tablets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG3350 (Polyethylene glycol 3350)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>202444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>93482</td>
			<td>Phenylmethanesulfonyl fluoride solution - 0.1 M in ethanol (T)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphor-imager</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28955809</td>
			<td>Typhoon FLA-7000 Phosphor-imager</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips, filtered</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>94410040</td>
			<td>ClipTip 12.5 &#956;l nonsterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-Prep Chromatography column</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7311550</td>
			<td>polypropylene chromatography column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor Mini</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>A32955</td>
			<td>Tablets, EDTA-free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>screw cap tube</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3488</td>
			<td>Microcentifuge Tubes, 2.0 ml with screw cap, nonsterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SLS 96-deep Well plates</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>780285</td>
			<td>MASTERBLOCK, 2 ML, PP, V-Bottom, Natural</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spin column</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC500396</td>
			<td>Amicon Ultra -0.5 ml Centrifugal Filters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5382000015</td>
			<td>Thermomixer C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC plate (PEI-cellulose F TLC plates)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>105579</td>
			<td>DC PEI-cellulose F (20 x 20 cm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>BP152</td>
			<td>Tris Base for Molecular Biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P1379</td>
			<td>viscous non-ionic detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>M3148</td>
			<td>99% (GC/titration)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identifying the binding proteins of small ligands with the differential radial capillary action of ligand assay (dracala)

पिछले दशक में बैक्टीरियल फिजियोलॉजी में छोटे सिग्नलिंग अणुओं की समझ में जबरदस्त प्रगति देखी गई है । विशेष रूप से, कई न्यूक्लियोटाइड-व्युत्पन्न माध्यमिक दूतों (एनएसएम) के लक्षित प्रोटीन की व्यवस्थित रूप से पहचान की गई है और मॉडल जीवों में अध्ययन किया गया है। ये उपलब्धियां मुख्य रूप से कैप्चर कंपाउंड तकनीक और लिगांड परख (DRaCALA) की अंतर रेडियल केशिका कार्रवाई सहित कई नई तकनीकों के विकास के कारण हैं, जिनका उपयोग इन छोटे अणुओं के लक्षित प्रोटीन की व्यवस्थित रूप से पहचान करने के लिए किया जाता था। यह पत्र DRaCALA तकनीक के उदाहरण और वीडियो प्रदर्शन के रूप में एनएसएम, ग्वानोसाइन पेंटा-और टेट्राफॉस्फेट (पी) पीपीजीपीपी के उपयोग का वर्णन करता है। DRaCALA का उपयोग करना, 20 ज्ञात में से 9 ज्ञात और (पी) पीपीजीपीपी के 12 नए लक्ष्य प्रोटीन मॉडल जीव, एस्चेरिचिया कोलाई K-12 में पहचाने गए थे, जो इस परख की शक्ति का प्रदर्शन करते हैं। सिद्धांत रूप में, DRaCALA का उपयोग छोटे लिगामेंट्स का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है जिन्हें रेडियोधर्मी आइसोटोप या फ्लोरोसेंट रंगों द्वारा लेबल किया जा सकता है। इस तकनीक के आगे आवेदन के लिए DRaCALA के महत्वपूर्ण कदम, पेशेवरों और विपक्ष पर चर्चा की जाती है।

उपर्युक्त प्रोटोकॉल के बाद आमतौर पर दो प्रकार के परिणाममिलेंगे (चित्र 3)।
चित्रा 3A कुओं के बहुमत से अपेक्षाकृत कम पृष्ठभूमि बाध्यकारी संकेतों (बाध्यकारी अंश < ०.०२५) के ?...

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Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay DRaCALA

लिगांड परख (DRaCALA) के अंतर रेडियल केशिलरी एक्शन का उपयोग ओआरफेम लाइब्रेरी का उपयोग करके किसी जीव के छोटे लिगांड बाध्यकारी प्रोटीन की पहचान करने के लिए किया जा सकता है।

लिगांड परख (DRaCALA) के अंतर रेडियल केशिलरी एक्शन के साथ छोटे लिगांड के बाध्यकारी प्रोटीन की पहचान करना

The past decade has seen tremendous progress in the understanding of small signaling molecules in bacterial physiology. In particular, the target proteins ...

छोटे सिग्नलिंग अणु बैक्टीरियल उग्रता और मानव जीव विज्ञान को नियंत्रित करने के लिए विभिन्न प्रभावक प्रोटीन को लक्षित करते हैं। हालांकि, ये इफेक्टर प्रोटीन की पहचान करना चुनौतीपूर्ण है। सिस्टम जीव विज्ञान उपकरण के रूप में, DRaCALA ओवियम लाइब्रेरी का उपयोग करके अज्ञात प्रभावक प्रोटीन की एक व्यवहार्य, तेजी से और अत्यधिक संवेदनशील पहचान की अनुमति देता है।DRaCALA का उपयोग किसी भी छोटे सिग्नलिंग अणु का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है जब तक कि इसे रेडियोधर्मी आइसोटोप या फ्लोरोसेंट रंगों के साथ लेबल किया जा सकता है। 30 डिग्री सेल्सियस और प्रति मिनट 160 घूर्णन पर एक रात के इनक्यूबेशन के लिए 96-अच्छी तरह से गहरी अच्छी तरह से प्लेटों के प्रत्येक कुएं में 25 माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर क्लोरम्फेनिकोल के साथ पूरक पौंड के 1.5 मिलीलीटर में ई.कोलाई को इनोक्यूलेट करके शुरू करें। अगली सुबह, प्रोटीन अभिव्यक्ति को प्रेरित करने के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर छह घंटे के लिए ५०० माइक्रोमोलर आईपीटीजी के साथ रात भर संस्कृतियों का इलाज करें ।इनक्यूबेशन के अंत में, अपकेंद्री द्वारा कोशिकाओं को गोली मार, सुपरनेट को हटा दें, और नमूनों को शून्य से 80 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज करें। लाइसिस शुरू करने के लिए, लाइसिस बफर के 150 माइक्रोलीटर में छर्रों को 30 मिनट के इनक्यूबेशन के लिए माइनस 80 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट तक चलने से पहले फिर से खर्च करें। इसके बाद इस्तेमाल से पहले lysate को माइनस 80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर किया जाना चाहिए।अधिक प्रयोग वाले प्रोटीन के साथ कोशिकाओं की लाइसिस को पूरा करने के लिए, 40 मिलीलीटर बर्फ की ठंड में नमूनों को फिर से खर्च करें और नमूनों को आठ मिनट के लिए चार सेकंड पर दो सेकंड में 60% आयाम पर रखें, फिर अपकेंद्री द्वारा लाइसिस को साफ करें। जबकि नमूनों को अपकेंद्रित्र किया जा रहा है, एक खड़े पॉलीप्रोपाइलीन क्रोमेटोग्राफी कॉलम में समरूप निकल-एनटीए राल के ५०० माइक्रोलीटर जोड़ें । 15 मिनट के बाद, बसे राल को दो बार अल्ट्रापुरे पानी के 15 मिलीलीटर और एक बार लाइसिस बफर दो के 15 मिलीलीटर के साथ धोएं।अपकेंद्रित्र के अंत में, कॉलम पर क्लीयर किए गए lysate सुपरनेट को लोड करें। जब सभी lysate कॉलम के माध्यम से प्रवाहित हो गया है, धोने बफर के 30 मिलीलीटर के साथ कॉलम धोने । प्रोटीन को स्पष्ट करने के लिए, कॉलम में एल्यूशन बफर की 400 माइक्रोलीटर मात्रा जोड़ें और तीन बार एल्यूशन दोहराएं।एल्यूशन बफर की एक और 300 माइक्रोलीटर मात्रा तीन बार एल्यूशन दोहराने के लिए और 700 माइक्रोलीटर की अंतिम मात्रा में eluted प्रोटीन गठबंधन। eluted नमूने के जेल छानने का काम करने के लिए, हौसले से तैयार जेल छानने का काम बफर के 25 मिलीलीटर के साथ एक आकार अपवर्जन कॉलम धोने के बाद, एक 500 माइक्रोलीटर लूप का उपयोग करके कॉलम पर eluted प्रोटीन की पूरी मात्रा लोड। प्रति मिनट 500 माइक्रोलीटर पर चलाएं और संबंधित प्रोटीन के दो से तीन 500 माइक्रोलीटर वॉल्यूम अंश एकत्र करें।फिर प्रत्येक प्रोटीन को केंद्रित करने के लिए व्यक्तिगत स्पिन कॉलम का उपयोग करें और मानक प्रोटोकॉल के अनुसार प्रोटीन सांद्रता को मापने के लिए ब्रैडफोर्ड परख किट का उपयोग करें। फास्फोरस 32 लेबल ग्वानोसाइन पेंटाफॉस्फेट को संश्लेषित करने के लिए, टेबल में उल्लिखित एक स्क्रू कैप्ड ट्यूब में एक छोटे पैमाने पर रिलेक्यू प्रतिक्रिया को इकट्ठा करें और थर्मोमिक्सर में 37 डिग्री सेल्सियस और पांच मिनट 95 डिग्री सेल्सियस पर एक घंटे के लिए प्रतिक्रिया को इनक्यूबेट करें, इसके बाद बर्फ पर पांच मिनट। ऊष्मायन के अंत में, अपकेंद्रित्र द्वारा उपजी प्रोटीन को स्पिन करें और संश्लेषित फास्फोरस 32 लेबल वाले ग्वानोसाइन पेंटाफॉस्फेट को स्थानांतरित करें जिसमें एक नए स्क्रू कैप्ड ट्यूब में सुपरनेटेंट होता है।फास्फोरस 32 ग्वानोसाइन टेट्राफस्फेट संश्लेषण के लिए, एक माइक्रोमोलर जीपीए को फास्फोरस 32 लेबल वाले ग्वानोसाइन पेंटाफॉस्फेट उत्पाद के आधे हिस्से में एक नए स्क्रू कैप्ड ट्यूब में जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए प्रतिक्रिया को इनक्यूबेट करें, 95 डिग्री सेल्सियस पर पांच मिनट और बर्फ पर पांच मिनट। इनक्यूबेशन के अंत में, अपकेंद्रित्र द्वारा तेज़ नीचे स्पिन और फास्फोरस 32 लेबल गुआनोसिन टेट्राफस्फेट एक नई ट्यूब के लिए सुपरनेटेंट युक्त हस्तांतरण। अलग लक्ष्य प्रोटीन का विश्लेषण करने के लिए, मोबाइल चरण के रूप में 1.5 मोलर मोनोपोटेसियम फॉस्फेट का उपयोग करके एक पतली परत क्रोमेटोग्राफी प्लेट पर प्रत्येक नमूने का एक माइक्रोलीटर चलाएं।विश्लेषण के बाद, सूखे प्लेट को एक पारदर्शी प्लास्टिक फ़ोल्डर में रखें और प्लेट को फास्फोर इमेजर पर डेटा की कल्पना और मात्रा निर्धारित करने से पहले पांच मिनट के लिए एक भंडारण फॉस्फोर स्क्रीन पर बेनकाब करें। टारगेट प्रोटीन की डीसीएएलए स्क्रीनिंग के लिए 95-वेल वी-बॉटम माइक्रोटिटर प्लेट के अलग-अलग कुओं में गल थोक के 20 माइक्रोलीटर डालें और प्रत्येक कुएं में सेराटिया मार्सेसेन्स एंडोक्यूक्लिज की 2.5 यूनिट जोड़ें। 15 मिनट के बाद 37 डिग्री सेल्सियस पर, 20 मिनट के लिए बर्फ पर lysates जगह है।इसके बाद, फास्फोरस 32 लेबल वाले ग्वानोसाइन पेंटाफोस्फेट और ग्वानोसाइन टेट्राफोस्फेट की बराबर मात्रा मिलाएं और चार नैनोमोलर ग्वानोसाइन पेंटाफॉस्फेट समाधान प्राप्त करने के लिए मिश्रण में 1X लाइसिस बफर एक जोड़ें। मल्टी-चैनल पिपेट और फ़िल्टर किए गए पिपेट टिप्स का उपयोग करके, ग्वानोसाइन पेंटाफॉस्फेट मिश्रण के 10 माइक्रोलीटर को कमरे के तापमान पर पांच मिनट के इनक्यूबेशन के लिए सेल लिसेट के साथ मिलाएं। इनक्यूबेशन के अंत में, 30 सेकंड के लिए गैर-आयनिक डिटर्जेंट के 0.01% समाधान में तीन बार 96X पिन टूल धोएं, इसके बाद 96-अच्छी नमूना प्लेट में पिन टूल रखने से पहले प्रति वॉश पेपर तौलिया पर 30 सेकंड सुखाने के बाद।30 सेकंड के बाद, पिन टूल को सीधे ऊपर उठाएं और इसे सीधे 30 सेकंड के लिए नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली पर रखें। पांच मिनट के सूखने के बाद, नाइट्रोसेल्यूलोस झिल्ली को फास्फोर इमेजिंग द्वारा स्टोरेज फॉस्फोर स्क्रीन एक्सपोजर और विज़ुअलाइज़ेशन के लिए एक पारदर्शी प्लास्टिक फ़ोल्डर में रखें जैसा कि प्रदर्शन किया गया है। फॉस्फोर इमेजर से जुड़े विश्लेषण सॉफ्टवेयर में संभावित लक्ष्य प्रोटीन की मात्रा निर्धारित करने और पहचानने के लिए, कल्पना प्लेटों की जेल फ़ाइल खोलें।विश्लेषण किए जाने वाले स्थानों को परिभाषित करने के लिए, आठ पंक्ति ग्रिड द्वारा 12 कॉलम स्थापित करने के लिए सरणी विश्लेषण फ़ंक्शन का उपयोग करें। छेद धब्बे के बाहरी किनारे को दरकिनार करने के लिए, बड़े हलकों को परिभाषित करें, वॉल्यूम प्लस पृष्ठभूमि और परिभाषित बड़े हलकों के क्षेत्र को स्प्रेडशीट में निर्यात करें। छोटे आंतरिक बिंदुओं को दरकिनार करने के लिए, परिभाषित हलकों को आकार दें, वॉल्यूम प्लस पृष्ठभूमि और परिभाषित छोटे हलकों के क्षेत्र का निर्यात करें और स्प्रेडशीट में सभी डेटा को सहेजें।स्थिति हलकों के रूप में आवश्यक स्थानों के साथ ओवरलैप करने के लिए, वास्तविक स्थानों की तुलना में थोड़ा बड़ा आकार । स्प्रेडशीट में बाध्यकारी अंशों की गणना करने और डेटा की साजिश करने के लिए समीकरण का उपयोग करें। फिर कुओं में संभावित बाध्यकारी प्रोटीन की पहचान करें जो अन्य कुओं के बहुमत की तुलना में उच्च बाध्यकारी अंश दिखाते हैं।इस प्रतिनिधि विश्लेषण में, अधिकांश कुओं में अपेक्षाकृत कम पृष्ठभूमि बाध्यकारी संकेतों के साथ एक प्लेट देखी जा सकती है। अच्छी तरह से एच 3 में सकारात्मक बाध्यकारी संकेत ने एक बाध्यकारी अंश का प्रदर्शन किया जो ग्वानोसाइन पेंटाफॉस्फेट बाध्यकारी प्रोटीन एचपीटी के अतिव्यक्तता के कारण अन्य कुओं के लिए मनाए गए हिस्से की तुलना में बहुत अधिक था। प्रतिनिधि प्लेटों में, कई कुओं ने अपेक्षाकृत उच्च पृष्ठभूमि बाध्यकारी संकेतों को दिखाया जैसा कि कई कुओं में देखे गए अपेक्षाकृत मजबूत आंतरिक बिंदुओं द्वारा संकेत दिया गया है, साथ ही मात्राकरण के बाद लगातार उच्च बाध्यकारी अंश ों को भी दिखाया गया है।विशेष रूप से, कुछ लक्ष्यों ने झूठी सकारात्मक जैसे चर बाध्यकारी अंश भी दिए। आगे स्पष्ट करने के लिए शोधकर्ताओं ने फिर से बाइंडिंग का परीक्षण करने के लिए शुद्ध प्रोटीन का इस्तेमाल किया । एक बार जब लक्ष्य प्रोटीन की पहचान कर ली जाती है, तो कोई भी उन्हें एकरूपता के लिए शुद्ध कर सकता है और DRaCALA, इसोथमल टिटरेशन कैलोरीमेट्री, या अन्य तरीकों का उपयोग करके बातचीत की ताकत और विशिष्टता की पुष्टि कर सकता है।छोटे संकेत अणुओं के लक्षित प्रोटीन की पहचान करने से जीवाणु उग्रता से मानव जीव विज्ञान तक उभरने वाली भूमिकाओं की गहराई से समझ का मार्ग प्रशस्त होता है ।

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay (DRaCALA)

Identification of Small Molecule-binding Proteins in a Native Cellular Environment by Live-cell Photoaffinity Labeling

लाइव सेल Photoaffinity लेबल द्वारा एक मूल निवासी सेलुलर वातावरण में छोटे अणु-बाध्यकारी प्रोटीन की पहचान

Identifying the molecular target(s) of small molecules is a challenging but necessary step towards understanding their mechanism of action. While several ...

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

HCN1 और TRIP8b बीच प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत के छोटे अणु inhibitors की पहचान के लिए विधि

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Measuring Biomolecular DSC Profiles with Thermolabile Ligands to Rapidly Characterize Folding and Binding Interactions

मापने Thermolabile लाइगैंडों के साथ आणविक डीएससी प्रोफाइल तेजी से तह और बाध्यकारी बातचीत की विशेषता के लिए

Differential scanning calorimetry (DSC) is a powerful technique for quantifying thermodynamic parameters governing biomolecular folding and binding ...

Nitrogen Cavitation and Differential Centrifugation Allows for Monitoring the Distribution of Peripheral Membrane Proteins in Cultured Cells

नाइट्रोजन Cavitation और अवकलन केंद्रापसारक संस्कृतिपूर्ण कोशिकाओं में परिधीय झिल्ली प्रोटीन के वितरण की निगरानी के लिए अनुमति देता है

Cultured cells are useful for studying the subcellular distribution of proteins, including peripheral membrane proteins. Genetically encoded fluorescently ...

Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

एसडीएस-पृष्ठ के साथ एक फॉस्फेट-बाइंडिंग टैग का उपयोग करके LRRK2 गतिविधि द्वारा फास्फारिलीकरण डिटेक्शन Rab10

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

Capturing the Interaction Kinetics of an Ion Channel Protein with Small Molecules by the Bio-layer Interferometry Assay

जैव परत Interferometry परख द्वारा छोटे अणुओं के साथ एक आयन चैनल प्रोटीन के संपर्क कैनेटीक्स पर कब्जा

The bio-layer interferometry (BLI) assay is a valuable tool for measuring protein-protein and protein-small molecule interactions. Here, we first describe ...

Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain

Chemoreceptor Ligand बाइंडिंग डोमेन के कुशल रिसामने और शुद्धिकरण के लिए विधि

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be ...

Detection of Small GTPase Prenylation and GTP Binding Using Membrane Fractionation and  GTPase-linked Immunosorbent Assay

छोटे GTPase Prenylation और GTP झिल्ली अंश और GTPase से जुड़े Immunosorbent परख का उपयोग बाध्यकारी का पता लगाने

The Rho GTPase family belongs to the Ras superfamily and includes approximately 20 members in humans. Rho GTPases are important in the regulation of ...

Analysis of AtHIRD11 Intrinsic Disorder and Binding Towards Metal Ions by Capillary Gel Electrophoresis and Affinity Capillary Electrophoresis

AtHIRD11 आंतरिक विकार का विश्लेषण और धातु आयनों की ओर बाध्यकारी केशिका जेल ट्रो और अपनत्व केशिका ट्रो

Plants are strongly dependent on their environment. In order to adjust to stressful changes (e.g., drought and high salinity), higher plants evolve ...

A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors

स्क्रीनिंग छोटे अणु अवरोधकों के लिए NADH-युग्मित ATPase परख के एक अर्द्ध उच्च Throughput अनुकूलन

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would ...