Name: identifying the binding proteins of small ligands with the differential radial capillary action of ligand assay (dracala)
Uploaded: 2021-03-19T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay DRaCALA at JoVE.com

Il lavoro è supportato da una sovvenzione del progetto NNF (NNF19OC0058331) a YEZ e dal programma di ricerca e innovazione Horizon 2020 dell'Unione europea nell'ambito della convenzione di sovvenzione Marie Skłodowska-Curie (Nº 801199) a MLS.
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62331/62331img1.jpg">

1. Preparazione di lizzati a cellule intere
<ol><li>Inoculare i ceppi di raccolta E. coli K-12 ASKA ORFeome15 in 1,5 mL di brodo di lisogenia (LB) contenente 25 μg/mL di cloramfenicolo in piastre di pozzetti profondi 96 pozzetti. Crescere durante la notte (O/N) per 18 ore a 30 °C con agitazione a 160 giri/min. Il giorno successivo, aggiungere isopropil β-d-1-tiogalattosiranoside (IPTG) (0,5 mM finale) alle colture O/N per indurre l'espressione proteica a 30 °C per 6 ore.</li>
	<li>C...

<ol>
	<li>Kalia, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleotide,+c-di-GMP,+c-di-AMP,+cGMP,+cAMP,+(p)ppGpp+signaling+in+bacteria+and+implications+in+pathogenesis.">Nucleotide, c-di-GMP, c-di-AMP, cGMP, cAMP, (p)ppGpp signaling in bacteria and implications in pathogenesis.</a> Chemical Society Reviews. 42 (1), 305-341 (2013).</li><li>Camilli, A., Bassler, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+small-molecule+signaling+pathways.">Bacterial small-molecule signaling pathways.</a> Science. 311 (5764), 1113-1116 (2006).</li><li>Luo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cAMP+capture+compound+mass+spectrometry+as+a+novel+tool+for+targeting+cAMP-binding+proteins:+from+protein+kinase+A+to+potassium/sodium+hyperpolarization-activated+cyclic+nucleotide-gated+channels.">The cAMP capture compound mass spectrometry as a novel tool for targeting cAMP-binding proteins: from protein kinase A to potassium/sodium hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channels.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 8 (12), 2843-2856 (2009).</li><li>Nesper, J., Reinders, A., Glatter, T., Schmidt, A., Jenal, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+capture+compound+for+the+identification+and+analysis+of+cyclic+di-GMP+binding+proteins.">A novel capture compound for the identification and analysis of cyclic di-GMP binding proteins.</a> Journal of Proteomics. 75 (15), 4874-4878 (2012).</li><li>Laventie, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capture+compound+mass+spectrometry--a+powerful+tool+to+identify+novel+c-di-GMP+effector+proteins.">Capture compound mass spectrometry--a powerful tool to identify novel c-di-GMP effector proteins.</a> Journal of Visual Experiments. (97), e51404 (2015).</li><li>Roelofs, K. G., Wang, J., Sintim, H. O., Lee, V. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+radial+capillary+action+of+ligand+assay+for+high-throughput+detection+of+protein-metabolite+interactions.">Differential radial capillary action of ligand assay for high-throughput detection of protein-metabolite interactions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (37), 15528-15533 (2011).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+adaptation+of+the+essential+tRNA+methyltransferase+TrmD+to+the+signaling+molecule+3+',5+'-cAMP+in+bacteria.">Evolutionary adaptation of the essential tRNA methyltransferase TrmD to the signaling molecule 3 ',5 '-cAMP in bacteria.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (1), 313-327 (2017).</li><li>Corrigan, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+identification+of+conserved+bacterial+c-di-AMP+receptor+proteins.">Systematic identification of conserved bacterial c-di-AMP receptor proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (22), 9084-9089 (2013).</li><li>Roelofs, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+identification+of+cyclic-di-GMP+binding+proteins+in+Vibrio+cholerae+reveals+a+novel+class+of+cyclic-di-GMP-binding+ATPases+associated+with+type+II+secretion+systems.">Systematic identification of cyclic-di-GMP binding proteins in Vibrio cholerae reveals a novel class of cyclic-di-GMP-binding ATPases associated with type II secretion systems.</a> PLoS Pathogen. 11 (10), 1005232 (2015).</li><li>Fang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GIL,+a+new+c-di-GMP-binding+protein+domain+involved+in+regulation+of+cellulose+synthesis+in+enterobacteria.">GIL, a new c-di-GMP-binding protein domain involved in regulation of cellulose synthesis in enterobacteria.</a> Molecular Microbiology. 93 (3), 439-452 (2014).</li><li>Corrigan, R. M., Bellows, L. E., Wood, A., Grundling, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ppGpp+negatively+impacts+ribosome+assembly+affecting+growth+and+antimicrobial+tolerance+in+Gram-positive+bacteria.">ppGpp negatively impacts ribosome assembly affecting growth and antimicrobial tolerance in Gram-positive bacteria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1710-1719 (2016).</li><li>Zhang, Y., Zbornikova, E., Rejman, D., Gerdes, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+(p)ppGpp+binding+and+metabolizing+proteins+of+Escherichia+coli.">Novel (p)ppGpp binding and metabolizing proteins of Escherichia coli.</a> Mbio. 9 (2), 02188 (2018).</li><li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nucleotide+pGpp+acts+as+a+third+alarmone+in+Bacillus,+with+functions+distinct+from+those+of+(p)+ppGpp.">The nucleotide pGpp acts as a third alarmone in Bacillus, with functions distinct from those of (p) ppGpp.</a> Nature Communications. 11 (1), 5388 (2020).</li><li>Orr, M. W., Lee, V. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+radial+capillary+action+of+ligand+assay+(DRaCALA)+for+high-throughput+detection+of+protein-metabolite+interactions+in+bacteria.">Differential radial capillary action of ligand assay (DRaCALA) for high-throughput detection of protein-metabolite interactions in bacteria.</a> Methods in Molecular Biology. 1535, 25-41 (2017).</li><li>Kitagawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+set+of+ORF+clones+of+Escherichia+coli+ASKA+library+(A+complete+Set+of+E.+coli+K-12+ORF+archive):+Unique+resources+for+biological+research.">Complete set of ORF clones of Escherichia coli ASKA library (A complete Set of E. coli K-12 ORF archive): Unique resources for biological research.</a> DNA Research. 12 (5), 291-299 (2005).</li><li>Hochstadt-Ozer, J., Cashel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+purine+utilization+in+bacteria.+V.+Inhibition+of+purine+phosphoribosyltransferase+activities+and+purine+uptake+in+isolated+membrane+vesicles+by+guanosine+tetraphosphate.">The regulation of purine utilization in bacteria. V. Inhibition of purine phosphoribosyltransferase activities and purine uptake in isolated membrane vesicles by guanosine tetraphosphate.</a> Journal of Biological Chemistry. 247 (21), 7067-7072 (1972).</li><li>Zhang, Y. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p)ppGpp+regulates+a+bacterial+nucleosidase+by+an+allosteric+two-domain+switch.">p)ppGpp regulates a bacterial nucleosidase by an allosteric two-domain switch.</a> Molecular Cell. 74 (6), 1239-1249 (2019).</li><li>Wang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity-based+capture+and+identification+of+protein+effectors+of+the+growth+regulator+ppGpp.">Affinity-based capture and identification of protein effectors of the growth regulator ppGpp.</a> Nature Chemical Biology. 15 (2), 141-150 (2019).</li></ol>

Uno dei passaggi critici nell'esecuzione dello screening DRaCALA è quello di ottenere buoni lasati a cellule intere. In primo luogo, le proteine testate dovrebbero essere prodotte in grandi quantità e in forme solubili. In secondo luogo, la lisi delle cellule dovrebbe essere completa e la viscosità del lizzate deve essere minima. L'inclusione del lisozima e l'uso di tre cicli di congelamento-disgelo sono spesso sufficienti per far lisi completamente le cellule. Tuttavia, il DNA cromosomico rilasciato rende viscoso il ...

I batteri utilizzano diverse piccole molecole di segnalazione per adattarsi ad ambienti in costante cambiamento1,2. Ad esempio, gli autoindoduttori, i lattoni N-acilomoserina e i loro oligopeptidi modificati, mediano la comunicazione intercellulare tra i batteri per coordinare il comportamento della popolazione, un fenomeno noto come quorum sensing2. Un altro gruppo di piccole molecole di segnalazione sono gli NSM, tra cui l'adenosina monofosfato ciclico (cAMP), il di-AMP ciclico, il monofosfato ciclico di di-guanosina (di-GMP ciclico) e i guanosina penta- e tetra fosfati (p)ppGpp1. I batteri producono questi NSM come risposta a una varietà di diverse condizioni di stress. Una volta prodotte, queste molecole si legano alle loro proteine bersaglio e regolano diverse vie fisiologiche e metaboliche per far fronte agli stress incontrati e migliorare la sopravvivenza batterica. Pertanto, l'identificazione delle proteine bersaglio è un prerequisito inevitabile per decifrare le funzioni molecolari di queste piccole molecole.
L'ultimo decennio ha visto un boom di conoscenza di queste piccole molecole di segnalazione, principalmente a causa di diverse innovazioni tecniche che hanno svelato le proteine bersaglio di queste piccole molecole. Questi includono la tecnica del composto di cattura3,4,5e l'azione capillare radiale differenziale del saggio del ligando (DRaCALA)6 da discutere in questo articolo.
Inventato da Vincent Lee e colleghi nel 20116,DRaCALA utilizza la capacità di una membrana nitrocellulosa di sequestrare in modo differenziale ligandi liberi e legati alle proteine. Molecole come le proteine non possono diffondersi su una membrana nitrocellulosa, mentre piccoli ligandi, come gli NSM, sono in grado di farlo. Mescolando l'NSM(ad esempio,ppGpp) con la proteina da testare e individuandoli sulla membrana, ci si possono aspettare due scenari (Figura 1): Se (p)ppGpp si lega alla proteina, il (p)ppGpp radiomarcato sarà trattenuto al centro dello spot dalla proteina e non si diffonderà verso l'esterno, dando un piccolo punto intenso (cioè., forte segnale radioattivo) sotto un fosforiger. Tuttavia, se (p)ppGpp non si lega alla proteina, si diffonderà liberamente verso l'esterno per produrre una grande macchia con segnale radioattivo di fondo uniforme.
Inoltre, DRaCALA può rilevare l'interazione tra una piccola molecola e una proteina nonpurata in un intero lisi cellulare se la proteina è presente in quantità sufficiente. Questa semplicità consente l'uso di DRaCALA nell'identificazione rapida di bersagli proteici utilizzando una libreria di espressioni ORFeome. Infatti, le proteine bersaglio di cAMP7, di-AMPciclico 8, ciclico di-GMP9,10e (p) ppGpp11,12,13 sono state sistematicamente identificate utilizzando DRaCALA. Questo articolo video utilizza (p)ppGpp come esempio per dimostrare e descrivere i passaggi critici e le considerazioni per eseguire uno screening DRaCALA di successo. Da notare, una descrizione più approfondita di DRaCALA14 è altamente raccomandata da leggere in combinazione con questo articolo prima di eseguire DRaCALA.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62331/62331fig01.jpg"> Figura 1: Il principio di DRaCALA. (A) Schema del saggio DRaCALA. Vedi il testo per i dettagli. (B) Quantificazione e calcolo della frazione vincolante. Vedi il testo per i dettagli. In breve, le macchie DRaCALA saranno analizzate disegnando due cerchi che circoscrivono l'intero punto e il punto scuro interno(cioèil (p)ppGpp trattenuto a causa del legame della proteina testata). Il segnale di legame specifico è il segnale radioattivo del cerchio interno (S1) dopo aver sottratto il segnale di fondo non specifico (calcolato da A1 × ((S2-S1)/(A2-A1))). La frazione di legame è il segnale di legame specifico diviso per il segnale radioattivo totale (S2). Abbreviazioni: DRaCALA = Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay; (p)ppGpp = guanosina penta- e tetrafosfati; RT = temperatura ambiente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62331/62331fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>32P-&#945;-GTP</td>
			<td>Perkinelmer</td>
			<td>BLU006X250UC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 x pin tool</td>
			<td>V&#38;P Scientific</td>
			<td>VP 404</td>
			<td>96 Bolt Replicator, on 9 mm centers, 4.2 mm Bolt Diameter, 24 mm long</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well V-bottom microtiter plate</td>
			<td>Sterilin</td>
			<td>MIC9004</td>
			<td>Sterilin Microplate V Well 611V96</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>OXOID - Thermo Fisher</td>
			<td>LP0011</td>
			<td>Agar no. 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ASKA collection strain</td>
			<td>NBRP, SHIGEN, JAPAN</td>
			<td></td>
			<td>Ref: DNA Research, Volume 12, Issue 5, 2005, Pages 291&#8211;299. https://doi.org/10.1093/dnares/dsi012</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>E1014-25KU</td>
			<td>genetically engineered endonuclease from Serratia marcescens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford Protein Assay Dye</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>5000006</td>
			<td>Reagent Concentrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D8418</td>
			<td>&#8805;99.9%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase 1</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>DN25-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gel filtration10x300 column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28990944</td>
			<td>contains 20% ethanol as preservative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>122329.1214</td>
			<td>Glycerol 87% for analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypercassette</td>
			<td>Amersham</td>
			<td>RPN 11647</td>
			<td>20 x 40 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>56750</td>
			<td>puriss. p.a., &#8805; 99.5% (GC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IP Storage Phosphor Screen</td>
			<td>FUJIFILM</td>
			<td>28956474</td>
			<td>BAS-MS 2040 20x 40 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>I6758</td>
			<td>Isopropyl &#946;-D-thiogalactoside</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysogeny Broth (LB)</td>
			<td>Invitrogen - Thermo Fisher</td>
			<td>12795027</td>
			<td>Miller&#39;s LB Broth Base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>L4949</td>
			<td>from chicken egg white; BioUltra, lyophilized powder, &#8805;98%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 (Magnesium chloride)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>208337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliQ water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ultrapure water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multichannel pipette</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>4661110</td>
			<td>F1 - Clip Tip; 1-10 ul, 8 x channels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>27810</td>
			<td>AnalaR NORMAPUR, ACS, Reag. Ph. Eur.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Agarose</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>30230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose Blotting Membrane</td>
			<td>Amersham Protran</td>
			<td>10600003</td>
			<td>Premium 0.45 um 300 mm x 4 m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>OXOID - Thermo Fisher</td>
			<td>BR0014G</td>
			<td>Phosphate buffered saline (Dulbecco A), Tablets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG3350 (Polyethylene glycol 3350)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>202444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>93482</td>
			<td>Phenylmethanesulfonyl fluoride solution - 0.1 M in ethanol (T)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphor-imager</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28955809</td>
			<td>Typhoon FLA-7000 Phosphor-imager</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips, filtered</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>94410040</td>
			<td>ClipTip 12.5 &#956;l nonsterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-Prep Chromatography column</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7311550</td>
			<td>polypropylene chromatography column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor Mini</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>A32955</td>
			<td>Tablets, EDTA-free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>screw cap tube</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3488</td>
			<td>Microcentifuge Tubes, 2.0 ml with screw cap, nonsterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SLS 96-deep Well plates</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>780285</td>
			<td>MASTERBLOCK, 2 ML, PP, V-Bottom, Natural</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spin column</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC500396</td>
			<td>Amicon Ultra -0.5 ml Centrifugal Filters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5382000015</td>
			<td>Thermomixer C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC plate (PEI-cellulose F TLC plates)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>105579</td>
			<td>DC PEI-cellulose F (20 x 20 cm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>BP152</td>
			<td>Tris Base for Molecular Biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P1379</td>
			<td>viscous non-ionic detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>M3148</td>
			<td>99% (GC/titration)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identifying the binding proteins of small ligands with the differential radial capillary action of ligand assay (dracala)

L'ultimo decennio ha visto enormi progressi nella comprensione di piccole molecole di segnalazione nella fisiologia batterica. In particolare, le proteine bersaglio di diversi messaggeri secondari derivati da nucleotidi (NSM) sono state sistematicamente identificate e studiate in organismi modello. Questi risultati sono dovuti principalmente allo sviluppo di diverse nuove tecniche tra cui la tecnica del composto di cattura e l'azione capillare radiale differenziale del saggio del ligando (DRaCALA), che sono state utilizzate per identificare sistematicamente le proteine bersaglio di queste piccole molecole. Questo documento descrive l'uso di NSM, guanosina penta- e tetrafosfati (p)ppGpp, come esempio e dimostrazione video della tecnica DRaCALA. Utilizzando DRaCALA, 9 su 20 note e 12 nuove proteine bersaglio di (p)ppGpp sono state identificate nell'organismo modello, Escherichia coli K-12, dimostrando la potenza di questo test. In linea di principio, DRaCALA potrebbe essere utilizzato per studiare piccoli ligandi che possono essere etichettati da isotopi radioattivi o coloranti fluorescenti. I passaggi critici, i pro e i contro di DRaCALA sono discussi qui per un'ulteriore applicazione di questa tecnica.

Seguendo il protocollo sopra descritto si produrranno in genere due tipi di risultati (Figura 3).
La Figura 3A mostra una piastra con segnali di legame di fondo relativamente bassi (frazioni di legame < 0,025) dalla maggior parte dei pozzi. Il segnale di legame positivo dal pozzo H3 dà una frazione di legame di ~0,35 che è molto più alta di quella osservata per gli altri pozzi. Anche senza quantificazione, beh H3 è notevole, sugge...

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Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay DRaCALA

Il Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay (DRaCALA) può essere utilizzato per identificare piccole proteine leganti il ligando di un organismo utilizzando una libreria ORFeome.

Identificazione delle proteine leganti di piccoli ligandi con l'azione capillare radiale differenziale del ligando Assay (DRaCALA)

The past decade has seen tremendous progress in the understanding of small signaling molecules in bacterial physiology. In particular, the target proteins ...

Piccole molecole di segnalazione prendono di mira varie proteine emozionali per controllare la virulenza batterica e la biologia umana. Tuttavia, queste proteine emozionali sono difficili da identificare. Come strumento di biologia dei sistemi, DRaCALA consente un'identificazione fattibile, rapida e altamente sensibile delle proteine emozionali sconosciute utilizzando una libreria OVium.DRaCALA potrebbe essere usato per studiare qualsiasi piccola molecola di segnalazione purché possa essere etichettata con isotopi radioattivi o coloranti fluorescenti. Inizia inoculando E.coli in 1,5 millilitri di LB integrati con 25 microgrammi per millilitro cloramfenicolo in ogni pozzetto di piastre di pozzo profonde 96 pozzetti per un'incubazione notturna a 30 gradi Celsius e 160 rotazioni al minuto. La mattina successiva, trattare le colture notturne con 500 IPTG micromolari per sei ore a 30 gradi Celsius per indurre l'espressione proteica.Alla fine dell'incubazione, pellettare le cellule mediante centrifugazione, rimuovere il surnatante e congelare i campioni a meno 80 gradi Celsius. Per avviare la lisi, risuscidere i pellet in 150 microlitri di tampone di lisi uno per pozzetti per un'incubazione di 30 minuti a meno 80 gradi Celsius prima di scongelare le cellule per 20 minuti a 37 gradi Celsius. Il lisirato deve quindi essere conservato a meno 80 gradi Celsius prima dell'uso.Per completare la lisi delle cellule con proteine sovraespresse, risospendare i campioni in 40 millilitri di tampone di lisi ghiacciata due e sonicare i campioni a un'ampiezza del 60% a due secondi su quattro secondi per otto minuti, quindi eliminare i lasati mediante centrifugazione. Mentre i campioni vengono centrifugati, aggiungere 500 microlitri di resina nichel-NTA omogeneizzata a una colonna di cromatografia in polipropilene in piedi. Dopo 15 minuti, lavare la resina depositata due volte con 15 millilitri di acqua ultrapura e una volta con 15 millilitri di tampone di lisi due.Al termine della centrifugazione, caricare il surnatante di lisi eliminato sulla colonna. Quando tutto il lisiato è fluito attraverso la colonna, lavare la colonna con 30 millilitri di tampone di lavaggio. Per eluire le proteine, aggiungere un volume di 400 microlitri di tampone di eluizione alla colonna e ripetere l'eluizione tre volte.Un altro volume di 300 microlitri del tampone di eluizione per ripetere l'eluizione tre volte e combinare le proteine eluite in un volume finale di 700 microlitri. Per la filtrazione su gel del campione eluito, dopo aver lavato una colonna di esclusione dimensionale con 25 millilitri di tampone di filtrazione in gel appena preparato, caricare l'intero volume di proteine eluite sulla colonna utilizzando un anello da 500 microlitri. Eseguire a 500 microlitri al minuto e raccogliere da due a tre frazioni di volume da 500 microlitri delle rispettive proteine.Quindi utilizzare singole colonne di spin per concentrare ciascuna proteina e utilizzare il kit di analisi Bradford per misurare le concentrazioni proteiche secondo protocolli standard. Per sintetizzare il fosforo 32 etichettato guanosina pentafosfato, assemblare una reazione di Relseq su piccola scala in un tubo con tappo a vite come indicato nella tabella e incubare la reazione in un Bimbyer per un'ora a 37 gradi Celsius e cinque minuti a 95 gradi Celsius, seguita da cinque minuti sul ghiaccio. Alla fine delle incubazioni, far girare la proteina precipitata per centrifugazione e trasferire il fosforo sintetizzato 32 etichettato guanosina pentafosfato contenente surnatante in un nuovo tubo tappo a vite.Per la sintesi di fosforo 32 guanosina tetrafosfato, aggiungere un GppA micromolare a metà del prodotto di guanosina pentafosfato etichettato fosforo 32 in un nuovo tubo tappo a vite e incubare la reazione per 10 minuti a 37 gradi Celsius, cinque minuti a 95 gradi Celsius e cinque minuti sul ghiaccio. Alla fine dell'incubazione, ruotare il precipitato per centrifugazione e trasferire il fosforo 32 etichettato guanosina tetrafosfato contenente surnatante in un nuovo tubo. Per analizzare le proteine bersaglio isolate, eseguire un microlitro di ciascun campione su una piastra cromatografica a strato sottile utilizzando 1,5 fosfato monopotassico molare come fase mobile.Dopo l'analisi, posizionare la piastra essiccata in una cartella di plastica trasparente ed esporre la piastra a uno schermo di fosforo di stoccaggio per cinque minuti prima di visualizzare e quantificare i dati su un imager al fosforo. Per lo screening DRaCALA delle proteine bersaglio, aggiungere 20 microlitri dei lasati all'ingrosso scongelati ai singoli pozzetti di una piastra di microtitolato a V a 95 pozzetti e aggiungere 2,5 unità di endonucleasi Serratia marcescens a ciascun pozzetto. Dopo 15 minuti a 37 gradi Celsius, posizionare i lasati sul ghiaccio per 20 minuti.Quindi, mescolare volumi uguali di fosforo 32 guanosina pentafosfato e guanosina tetrafosfato etichettati e aggiungere 1X tampone di lisi uno alla miscela per ottenere una soluzione di guanosina pentafosfato a quattro nanomolari. Utilizzando una pipetta multicanale e punte di pipette filtrate, mescolare 10 microlitri della miscela di guanosina pentafosfato con il lisato cellulare per un'incubazione di cinque minuti a temperatura ambiente. Alla fine dell'incubazione, lavare tre volte uno strumento a perno 96X in una soluzione allo 0,01% di detergente non ionico per 30 secondi, seguito da 30 secondi di asciugatura su un asciugamano di carta per lavaggio prima di posizionare lo strumento pin nella piastra campione a 96 pozzetti.Dopo 30 secondi, sollevare l'utensile pin verso l'alto e posizionarlo direttamente su una membrana di nitrocellulosa per 30 secondi. Dopo cinque minuti di essiccazione, posizionare la membrana di nitrocellulosa in una cartella di plastica trasparente per l'esposizione allo schermo al fosforo di stoccaggio e la visualizzazione mediante imaging al fosforo, come dimostrato. Per quantificare e identificare potenziali proteine bersaglio, nel software di analisi associato all'imager del fosforo, aprire il file gel delle piastre visualizzate.Per definire i punti da analizzare, utilizzare la funzione di analisi della matrice per impostare una griglia di 12 colonne per otto righe. Per circoscrivere il bordo esterno dei punti del foro, definite cerchi grandi, esportate il volume più lo sfondo e l'area dei grandi cerchi definiti in un foglio di calcolo. Per circoscrivere i piccoli punti interni, ridimensionare i cerchi definiti, esportare il volume più lo sfondo e l'area dei piccoli cerchi definiti e salvare tutti i dati nel foglio di calcolo.Posiziona i cerchi in modo che si sovrappongano ai punti se necessario, ridimensionando i punti leggermente più grandi di quelli effettivi. Utilizzare l'equazione per calcolare le frazioni di associazione nel foglio di calcolo e tracciare i dati. Quindi identificare le potenziali proteine leganti nei pozzi che mostrano elevate frazioni di legame rispetto alla maggior parte degli altri pozzi.In questa analisi rappresentativa, si può osservare una piastra con segnali di legame di fondo relativamente bassi nella maggior parte dei pozzi. Il segnale di legame positivo nel pozzo H3 ha mostrato una frazione di legame molto più alta di quella osservata per gli altri pozzetti a causa della sovraespressione della proteina legante la guanosina pentafosfato Hpt. Nelle placche rappresentative, diversi pozzi hanno mostrato segnali di legame di fondo relativamente più alti, come indicato dai punti interni relativamente forti osservati in molti pozzi, così come le frazioni di legame costantemente elevate osservate dopo la quantificazione.In particolare, alcuni target hanno anche fornito frazioni di legame variabili, come i falsi positivi. Per chiarire ulteriormente, i ricercatori hanno utilizzato proteine purificate per testare nuovamente il legame. Una volta identificate le proteine bersaglio, è possibile purificarle in omogeneità e confermare la forza e la specificità dell'interazione utilizzando DRaCALA, calorimetria di titolazione isotermica o altri metodi.L'identificazione delle proteine bersaglio di piccole molecole di segnalazione apre la strada a una comprensione approfondita dei ruoli che emergono dalla virulenza batterica alla biologia umana.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay (DRaCALA)

Identification of Small Molecule-binding Proteins in a Native Cellular Environment by Live-cell Photoaffinity Labeling

L&#39;identificazione di piccole proteine ​​che legano molecole in un nativo Cellular ambiente da Live-cell Photoaffinity Etichettatura

Identifying the molecular target(s) of small molecules is a challenging but necessary step towards understanding their mechanism of action. While several ...

Ricerca

Biochimica

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

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