Name: identifying the binding proteins of small ligands with the differential radial capillary action of ligand assay (dracala)
Uploaded: 2021-03-19T14:30:00
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この研究は、YEZへのNNFプロジェクトグラント(NNF19OC0058331)と、MLSへのマリー・スクウォトフスカ・キュリー交付金協定(Nº 801199)に基づく欧州連合(EU)のホライゾン2020研究・イノベーションプログラムによって支援されています。
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62331/62331img1.jpg">

1. 細胞全体のライセートの調製
<ol><li>大腸菌K-12 ASKA ORFeomeコレクションは、96ウェル深ウェルプレートに25 μg/mLクロラムフェニコールを含む15から1.5 mLリソジニーブロス(LB)を取り込みます。一晩(O/N)を30°Cで18時間成長させ、160rpmで振る。翌日、イソプロピルβ-d-1-チオガラクトピラノシド(IPTG)(最終0.5mM)をO/N培養物に加え、30°Cで6時間タンパク質発現を誘導する。</li>
	<...

<ol>
	<li>Kalia, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleotide,+c-di-GMP,+c-di-AMP,+cGMP,+cAMP,+(p)ppGpp+signaling+in+bacteria+and+implications+in+pathogenesis.">Nucleotide, c-di-GMP, c-di-AMP, cGMP, cAMP, (p)ppGpp signaling in bacteria and implications in pathogenesis.</a> Chemical Society Reviews. 42 (1), 305-341 (2013).</li><li>Camilli, A., Bassler, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+small-molecule+signaling+pathways.">Bacterial small-molecule signaling pathways.</a> Science. 311 (5764), 1113-1116 (2006).</li><li>Luo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cAMP+capture+compound+mass+spectrometry+as+a+novel+tool+for+targeting+cAMP-binding+proteins:+from+protein+kinase+A+to+potassium/sodium+hyperpolarization-activated+cyclic+nucleotide-gated+channels.">The cAMP capture compound mass spectrometry as a novel tool for targeting cAMP-binding proteins: from protein kinase A to potassium/sodium hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channels.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 8 (12), 2843-2856 (2009).</li><li>Nesper, J., Reinders, A., Glatter, T., Schmidt, A., Jenal, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+capture+compound+for+the+identification+and+analysis+of+cyclic+di-GMP+binding+proteins.">A novel capture compound for the identification and analysis of cyclic di-GMP binding proteins.</a> Journal of Proteomics. 75 (15), 4874-4878 (2012).</li><li>Laventie, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capture+compound+mass+spectrometry--a+powerful+tool+to+identify+novel+c-di-GMP+effector+proteins.">Capture compound mass spectrometry--a powerful tool to identify novel c-di-GMP effector proteins.</a> Journal of Visual Experiments. (97), e51404 (2015).</li><li>Roelofs, K. G., Wang, J., Sintim, H. O., Lee, V. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+radial+capillary+action+of+ligand+assay+for+high-throughput+detection+of+protein-metabolite+interactions.">Differential radial capillary action of ligand assay for high-throughput detection of protein-metabolite interactions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (37), 15528-15533 (2011).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+adaptation+of+the+essential+tRNA+methyltransferase+TrmD+to+the+signaling+molecule+3+',5+'-cAMP+in+bacteria.">Evolutionary adaptation of the essential tRNA methyltransferase TrmD to the signaling molecule 3 ',5 '-cAMP in bacteria.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (1), 313-327 (2017).</li><li>Corrigan, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+identification+of+conserved+bacterial+c-di-AMP+receptor+proteins.">Systematic identification of conserved bacterial c-di-AMP receptor proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (22), 9084-9089 (2013).</li><li>Roelofs, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+identification+of+cyclic-di-GMP+binding+proteins+in+Vibrio+cholerae+reveals+a+novel+class+of+cyclic-di-GMP-binding+ATPases+associated+with+type+II+secretion+systems.">Systematic identification of cyclic-di-GMP binding proteins in Vibrio cholerae reveals a novel class of cyclic-di-GMP-binding ATPases associated with type II secretion systems.</a> PLoS Pathogen. 11 (10), 1005232 (2015).</li><li>Fang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GIL,+a+new+c-di-GMP-binding+protein+domain+involved+in+regulation+of+cellulose+synthesis+in+enterobacteria.">GIL, a new c-di-GMP-binding protein domain involved in regulation of cellulose synthesis in enterobacteria.</a> Molecular Microbiology. 93 (3), 439-452 (2014).</li><li>Corrigan, R. M., Bellows, L. E., Wood, A., Grundling, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ppGpp+negatively+impacts+ribosome+assembly+affecting+growth+and+antimicrobial+tolerance+in+Gram-positive+bacteria.">ppGpp negatively impacts ribosome assembly affecting growth and antimicrobial tolerance in Gram-positive bacteria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1710-1719 (2016).</li><li>Zhang, Y., Zbornikova, E., Rejman, D., Gerdes, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+(p)ppGpp+binding+and+metabolizing+proteins+of+Escherichia+coli.">Novel (p)ppGpp binding and metabolizing proteins of Escherichia coli.</a> Mbio. 9 (2), 02188 (2018).</li><li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nucleotide+pGpp+acts+as+a+third+alarmone+in+Bacillus,+with+functions+distinct+from+those+of+(p)+ppGpp.">The nucleotide pGpp acts as a third alarmone in Bacillus, with functions distinct from those of (p) ppGpp.</a> Nature Communications. 11 (1), 5388 (2020).</li><li>Orr, M. W., Lee, V. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+radial+capillary+action+of+ligand+assay+(DRaCALA)+for+high-throughput+detection+of+protein-metabolite+interactions+in+bacteria.">Differential radial capillary action of ligand assay (DRaCALA) for high-throughput detection of protein-metabolite interactions in bacteria.</a> Methods in Molecular Biology. 1535, 25-41 (2017).</li><li>Kitagawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+set+of+ORF+clones+of+Escherichia+coli+ASKA+library+(A+complete+Set+of+E.+coli+K-12+ORF+archive):+Unique+resources+for+biological+research.">Complete set of ORF clones of Escherichia coli ASKA library (A complete Set of E. coli K-12 ORF archive): Unique resources for biological research.</a> DNA Research. 12 (5), 291-299 (2005).</li><li>Hochstadt-Ozer, J., Cashel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+purine+utilization+in+bacteria.+V.+Inhibition+of+purine+phosphoribosyltransferase+activities+and+purine+uptake+in+isolated+membrane+vesicles+by+guanosine+tetraphosphate.">The regulation of purine utilization in bacteria. V. Inhibition of purine phosphoribosyltransferase activities and purine uptake in isolated membrane vesicles by guanosine tetraphosphate.</a> Journal of Biological Chemistry. 247 (21), 7067-7072 (1972).</li><li>Zhang, Y. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p)ppGpp+regulates+a+bacterial+nucleosidase+by+an+allosteric+two-domain+switch.">p)ppGpp regulates a bacterial nucleosidase by an allosteric two-domain switch.</a> Molecular Cell. 74 (6), 1239-1249 (2019).</li><li>Wang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity-based+capture+and+identification+of+protein+effectors+of+the+growth+regulator+ppGpp.">Affinity-based capture and identification of protein effectors of the growth regulator ppGpp.</a> Nature Chemical Biology. 15 (2), 141-150 (2019).</li></ol>

DRaCALAスクリーニングを行う上で重要なステップの1つは、良好な全細胞のライセートを得る。まず、試験されたタンパク質を大量に、可溶性の形態で産生すべきである。第二に、細胞のリシスは完全であり、そして、リセートの粘度は最小限でなければならない。リソザイムの包含と凍結融解の3サイクルの使用は、多くの場合、細胞を完全にライゼするのに十分です。しかし、放出された染?...

細菌は、絶えず変化する環境1、2に適応するために、いくつかの小さなシグナル伝達分子を使用しています。例えば、オートインデューサーは、N-アシルホモセリンラクトンおよびそれらの改変オリゴペプチドと、集団行動を調整するために細菌間の細胞間通信を仲介し、クォーラムセンシング2として知られる現象である。小シグナル伝達分子の別のグループは、NSMであり、広く研究された環状アデノシン一リン酸(cAMP)、環状ジAMP、環状ジグアノシン一リン酸(環状ジGMP)、およびグアノシンペンタおよびテトラリン酸(p)ppGpp1を含む。細菌は、さまざまな異なるストレス状態に対する応答としてこれらのNSMを産生する。いったん産生されると、これらの分子は標的タンパク質に結合し、遭遇したストレスに対処し、細菌の生存を高めるためにいくつかの異なる生理学的および代謝経路を調節する。したがって、標的タンパク質の同定は、これらの小分子の分子機能を解読するための避けられない前提条件である。
過去10年間、これらの小さなシグナル伝達分子に関する知識のブームを目の当たりにしてきました, 主にこれらの小分子の標的タンパク質を発表したいくつかの技術革新.これらには、この論文で議論されるリガンドアッセイ(DRaCALA)6の捕捉化合物技術3、4、5、および微分径状毛細管作用が含まれる。
2011年6年にヴィンセント・リーと同僚によって発明されたDRaCALAは、ニトロセルロース膜の能力を、タンパク質結合リガンドを差し違いに隔離するために展開しています。タンパク質などの分子はニトロセルロース膜に拡散できず、NSMなどの小さなリガンドは拡散することができます。NSM(例えば、ppGpp)を検査するタンパク質と混合し、膜上でそれらを発見することによって、2つのシナリオが期待できる(図1):(p)ppGppがタンパク質に結合した場合、放射標識された(p)ppGppはタンパク質によってスポットの中央に保持され、外側に拡散せず、激しいドットを与える( 強い放射性信号)リンイメージャーの下で。しかし、(p)ppGppがタンパク質に結合しない場合、放射能シグナルの背景が均一な大きなスポットを作り出すために、自由に外側に拡散する。
さらに、DRaCALAは、タンパク質が十分な量で存在する場合、細胞全体のライセートにおける小分子と未精製タンパク質との相互作用を検出することができる。このシンプルさは、ORFeome発現ライブラリを使用して、タンパク質標的を迅速に同定する際にDRaCALAを使用することを可能にする。実際、cAMP7、環状di-AMP8、環状ジGMP9、10、および(p)ppGpp11、12、13の標的タンパク質は、DRaCALAを用いて系統的に同定されている。このビデオ記事では、(p)ppGpp を例として、DRaCALA スクリーニングを成功させるために重要な手順と考慮事項を示し、説明します。DRaCALA14の詳細については、DRaCALA を実行する前に、この記事と組み合わせて読むことを強くお勧めします。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62331/62331fig01.jpg"> 図1: ドラカラの原理(A) DRaCALAアッセイの概略図詳細については、テキストを参照してください。(B) 結合分数の定量化と計算。詳細については、テキストを参照してください。簡単に言えば、DRaCALAスポットは、スポット全体と内側の暗い点(すなわち、試験されたタンパク質の結合に起因する保持(p)ppGpp)を囲む2つの円を描くことによって分析される。特定結合信号は、非特異的なバックグラウンド信号を減算した後の内円(S1)の放射性信号(((S2-S ×1)/(A2-A1))で計算された非特異的なバックグラウンド信号(((S2-S1)/(A2-A1)です。 結合分率は、特定の結合信号を全放射性信号で割った(S2)。略語: DRaCALA = リガンドアッセイの差動ラジアル毛細管作用;(p)ppGpp =グアノシンペンタ-およびテトラリン酸塩;RT = 室温。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62331/62331fig01large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>32P-&#945;-GTP</td>
			<td>Perkinelmer</td>
			<td>BLU006X250UC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 x pin tool</td>
			<td>V&#38;P Scientific</td>
			<td>VP 404</td>
			<td>96 Bolt Replicator, on 9 mm centers, 4.2 mm Bolt Diameter, 24 mm long</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well V-bottom microtiter plate</td>
			<td>Sterilin</td>
			<td>MIC9004</td>
			<td>Sterilin Microplate V Well 611V96</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>OXOID - Thermo Fisher</td>
			<td>LP0011</td>
			<td>Agar no. 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ASKA collection strain</td>
			<td>NBRP, SHIGEN, JAPAN</td>
			<td></td>
			<td>Ref: DNA Research, Volume 12, Issue 5, 2005, Pages 291&#8211;299. https://doi.org/10.1093/dnares/dsi012</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>E1014-25KU</td>
			<td>genetically engineered endonuclease from Serratia marcescens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford Protein Assay Dye</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>5000006</td>
			<td>Reagent Concentrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D8418</td>
			<td>&#8805;99.9%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase 1</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>DN25-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gel filtration10x300 column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28990944</td>
			<td>contains 20% ethanol as preservative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>122329.1214</td>
			<td>Glycerol 87% for analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypercassette</td>
			<td>Amersham</td>
			<td>RPN 11647</td>
			<td>20 x 40 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>56750</td>
			<td>puriss. p.a., &#8805; 99.5% (GC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IP Storage Phosphor Screen</td>
			<td>FUJIFILM</td>
			<td>28956474</td>
			<td>BAS-MS 2040 20x 40 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>I6758</td>
			<td>Isopropyl &#946;-D-thiogalactoside</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysogeny Broth (LB)</td>
			<td>Invitrogen - Thermo Fisher</td>
			<td>12795027</td>
			<td>Miller&#39;s LB Broth Base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>L4949</td>
			<td>from chicken egg white; BioUltra, lyophilized powder, &#8805;98%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 (Magnesium chloride)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>208337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliQ water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ultrapure water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multichannel pipette</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>4661110</td>
			<td>F1 - Clip Tip; 1-10 ul, 8 x channels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>27810</td>
			<td>AnalaR NORMAPUR, ACS, Reag. Ph. Eur.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Agarose</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>30230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose Blotting Membrane</td>
			<td>Amersham Protran</td>
			<td>10600003</td>
			<td>Premium 0.45 um 300 mm x 4 m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>OXOID - Thermo Fisher</td>
			<td>BR0014G</td>
			<td>Phosphate buffered saline (Dulbecco A), Tablets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG3350 (Polyethylene glycol 3350)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>202444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>93482</td>
			<td>Phenylmethanesulfonyl fluoride solution - 0.1 M in ethanol (T)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphor-imager</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28955809</td>
			<td>Typhoon FLA-7000 Phosphor-imager</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips, filtered</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>94410040</td>
			<td>ClipTip 12.5 &#956;l nonsterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-Prep Chromatography column</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7311550</td>
			<td>polypropylene chromatography column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor Mini</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>A32955</td>
			<td>Tablets, EDTA-free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>screw cap tube</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3488</td>
			<td>Microcentifuge Tubes, 2.0 ml with screw cap, nonsterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SLS 96-deep Well plates</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>780285</td>
			<td>MASTERBLOCK, 2 ML, PP, V-Bottom, Natural</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spin column</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC500396</td>
			<td>Amicon Ultra -0.5 ml Centrifugal Filters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5382000015</td>
			<td>Thermomixer C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC plate (PEI-cellulose F TLC plates)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>105579</td>
			<td>DC PEI-cellulose F (20 x 20 cm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>BP152</td>
			<td>Tris Base for Molecular Biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P1379</td>
			<td>viscous non-ionic detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>M3148</td>
			<td>99% (GC/titration)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identifying the binding proteins of small ligands with the differential radial capillary action of ligand assay (dracala)

過去10年間、細菌生理学における小信号分子の理解は大きく進歩しています。特に、いくつかのヌクレオチド由来二次メッセンジャー(NSM)の標的タンパク質を体系的に同定し、モデル生物で研究されている。これらの成果は、主に、これらの小分子の標的タンパク質を体系的に同定するために使用されたリガンドアッセイ(DRaCALA)の捕獲化合物技術および微分径状毛細管作用を含むいくつかの新しい技術の開発によるものです。本論文では、DRaCALA技術の例及びビデオデモとして、NSM、グアノシンペンタおよびテトラリン酸(p)ppGppの使用について説明する。DRaCALAを用いて、(p)ppGppの20個の既知および12個の新しい標的タンパク質のうち9個がモデル生物 のエシェリヒア・コリ K-12で同定され、このアッセイの力を実証した。DRaCALAは、原理的に、放射性同位体や蛍光色素によって標識できる小さなリガンドの研究に使用できます。この手法のさらなる応用のために、DRaCALA の重要なステップ、長所、および短所について説明します。

上記のプロトコルに従うと、通常は2種類の結果が得られます(図3)。
図3Aは、大部分のウェルからのバックグラウンド結合信号(0.025<結合分率)が比較的低いプレートを示す。ウェルH3からの正の結合シグナルは、他のウェルに対して観察されたものよりもはるかに高い〜0.35の結合分率を与える。定量化がなくても、H3が顕著であ?...

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Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay DRaCALA

リガンドアッセイの微小径径毛管作用(DRaCALA)は、ORFeomeライブラリを使用して生物の小さなリガンド結合タンパク質を同定するために使用できます。

リガンドアッセイの微小径毛管作用による小リガンドの結合タンパク質の同定(DRaCALA)

The past decade has seen tremendous progress in the understanding of small signaling molecules in bacterial physiology. In particular, the target proteins ...

小シグナル伝達分子は、細菌の毒性およびヒト生物学を制御するために、様々なエフェクタータンパク質を標的とする。しかし、これらのエフェクタータンパク質は同定するのが難しい。システム生物学ツールとして、DRaCALAはOViumライブラリを使用して、未知のエフェクタータンパク質の実現可能かつ迅速かつ高感度な同定を可能にします。DRaCALAは、放射性同位体または蛍光色素のいずれかで標識できる限り、任意の小さなシグナル伝達分子を研究するために使用することができます。大腸菌を1.5ミリリットルのLBに接種し、96ウェルの深いウェルプレートの各ウェルに1ミリリットルのクロラムフェニコールあたり25マイクログラムを加え、摂氏30度と毎分160回転で一晩インキュベーションを行います。翌朝、500マイクロモルIPTGで一晩培養した培養物を摂氏30度で6時間処理し、タンパク質発現を誘導する。インキュベーションの終わりに、遠心分離によって細胞をペレットにし、上清を取り除き、サンプルをマイナス80°Cで凍結する。リシスを開始するには、150マイクロリットルのライシスバッファーでペレットを1ウェルあたり1回再中断し、マイナス80°Cで30分のインキュベーションを行い、セルを摂氏37度で20分間解凍します。ライセートは、使用前にマイナス80°Cで保存する必要があります。過剰発現タンパク質を含む細胞のリシスを完了するには、氷冷ライシスバッファー2の40ミリリットルでサンプルを再中断し、8分間4秒間2秒間で60%振幅でサンプルを超音波処理し、遠心分離によってリセートをクリアします。サンプルが遠心分離されている間、均質化ニッケルNTA樹脂の500マイクロリットルを立ち位置のポリプロピレンクロマトグラフィーカラムに加えます。15分後、15ミリリットルの超純水で落ち着いた樹脂を2回洗浄し、15ミリリットルの溶精緩衝液2で1回洗浄します。遠心分離の終わりに、クリアしたlysate上清をカラムにロードします。すべてのライセートがカラムを流れたとき、30ミリリットルの洗浄バッファーでカラムを洗います。タンパク質を溶出させるために、400マイクロリットルの溶出バッファーをカラムに加え、溶出を3回繰り返します。溶出バッファーの別の 300 マイクロリットルの体積は溶出を 3 回繰り返し、溶出したタンパク質を最終的な体積 700 マイクロリットルに結合します。溶出した試料のゲル濾過については、調製したゲル濾過バッファーの25ミリリットルでサイズ排除カラムを洗浄した後、500マイクロリットルのループを用いて溶出したタンパク質の全容をカラムにロードする。1分あたり500マイクロリットルで実行し、それぞれのタンパク質の2〜3つの500マイクロリットル体積分率を収集します。次に、個々のスピンカラムを使用して各タンパク質を濃縮し、ブラッドフォードアッセイキットを使用して、標準的なプロトコルに従ってタンパク質濃度を測定します。五リン酸グアノシンとラベル付けされたリン32を合成するには、テーブルに概説されているようにねじキャップチューブに小規模なRelseq反応を組み立て、ThermoMixerで反応を摂氏37度で1時間、摂氏95度で5分間インキュベートし、氷の上で5分間インキュベートします。インキュベーションの終わりに、遠心分離によって沈殿したタンパク質をスピンダウンし、上澄み物を含む合成リン32標識されたグアノシンペンタリン酸を新しいスクリューキャップチューブに移す。リン32グアノシンテトラリン酸合成の場合、新しいねじキャップチューブにグアノシンペンタリン酸製品とラベル付けされたリン32の半分に1つのマイクロモルGppAを加え、37°Cで10分間、摂氏95度で5分、氷上で5分間反応をインキュベートします。インキュベーションの終わりに、遠心分離によって沈殿をスピンダウンし、上清を含むグアノシン四リン酸を標識したリン32を新しいチューブに移す。単離された標的タンパク質を分析するには、移動相として1.5モルモノカリウムリン酸を使用して、薄層クロマトグラフィープレート上で各サンプルの1マイクロリットルを実行します。分析後、乾燥したプレートを透明なプラスチックフォルダに入れ、5分間保管用の蛍光体スクリーンにプレートを露出させてから、蛍光体の画像装置上のデータを視覚化して定量します。標的タンパク質のDRaCALAスクリーニングでは、解凍した卸売ライセートの20マイクロリットルを95ウェルVボトムマイクロタイタープレートの個々のウェルに追加し、各ウェルにセラチア・マルセセンス・エンドヌクレアーゼの2.5単位を追加します。摂氏37度で15分後、氷の上に20分間ライセートを置きます。次に、五リン酸グアノシンとグアノシンテトラリン酸と標識したリン32の等量を混合し、1X溶解バッファーを混合物に加えて、4ナノモルグアノシン五タンリン酸溶液を得る。マルチチャンネルピペットとフィルター処理されたピペットチップを使用して、グアノシンペンタリン酸混合物の10マイクロリットルを細胞リセートと混合し、室温で5分間インキュベーションします。インキュベーションの最後に、96Xピンツールを非イオン洗剤の0.01%溶液で3回30秒間洗浄し、その後、96ウェルサンプルプレートにピンツールを入れる前に、1回のペーパータオルで30秒間乾燥します。30秒後、ピンツールをまっすぐ上に持ち上げ、ニトロセルロース膜の上に30秒間まっすぐ下に置きます。5分間の乾燥の後、ニトロセルロース膜を透明なプラスチックフォルダに入れて、蛍光体スクリーン暴露を記憶し、示すように蛍光体イメージングによる可視化を行います。潜在的な標的タンパク質を定量化して同定するために、蛍光体イメージャーに関連付けられた解析ソフトウェアで、視覚化されたプレートのゲルファイルを開きます。分析するスポットを定義するには、配列分析関数を使用して、12 列を 8 行グリッドで設定します。穴のスポットの外側のエッジを囲むには、大きな円を定義し、ボリュームと定義された大きな円の背景と面積をスプレッドシートにエクスポートします。小さな内側のドットを囲むには、定義された円を下にサイズ設定し、定義された小さな円のボリュームと背景と領域をエクスポートし、スプレッドシートにすべてのデータを保存します。必要に応じて、円をスポットと重なるように配置し、実際のスポットよりもわずかに大きいサイズを変更します。数式を使用して、スプレッドシート内の結合分数を計算し、データをプロットします。次に、他のウェルの大部分と比較して高い結合画分を示すウェル内の潜在的な結合タンパク質を同定する。この代表的な分析では、ほとんどのウェルで比較的低いバックグラウンド結合信号を有するプレートが観察される。ウェルH3における陽性結合シグナルは、グアノシンペンタリン酸結合タンパク質Hptの過剰発現により他のウェルについて観察されたものよりもはるかに高い結合分率を示した。代表的なプレートでは、いくつかのウェルは、多くのウェルで観察される比較的強い内ドットによって示されるように比較的高いバックグラウンド結合信号を示し、定量後に観察された一貫して高い結合画分を示した。特に、一部のターゲットは、偽陽性などの可変的な結合分数を与えました。さらに明確にするために、研究者は精製タンパク質を使用して結合を再びテストしました。標的タンパク質が同定されると、タンパク質を均質に精製し、DRaCALA、等温滴定熱量測定、またはその他の方法を使用して相互作用強度と特異性を確認することができます。小シグナル伝達分子の標的タンパク質を同定することは、細菌性毒性からヒト生物学に至る役割の詳細な理解への道を開く。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay (DRaCALA)

Identification of Small Molecule-binding Proteins in a Native Cellular Environment by Live-cell Photoaffinity Labeling

ライブセル光親和性標識によって、ネイティブの細胞環境における小分子結合タンパク質の同定

Identifying the molecular target(s) of small molecules is a challenging but necessary step towards understanding their mechanism of action. While several ...

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

HCN1とTRIP8bの間のタンパク質 - タンパク質相互作用の小分子阻害剤を同定するための方法

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Measuring Biomolecular DSC Profiles with Thermolabile Ligands to Rapidly Characterize Folding and Binding Interactions

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Differential scanning calorimetry (DSC) is a powerful technique for quantifying thermodynamic parameters governing biomolecular folding and binding ...

Nitrogen Cavitation and Differential Centrifugation Allows for Monitoring the Distribution of Peripheral Membrane Proteins in Cultured Cells

窒素キャビテーションと差動遠心分離培養細胞の周辺膜蛋白質の分布を監視することができます。

Cultured cells are useful for studying the subcellular distribution of proteins, including peripheral membrane proteins. Genetically encoded fluorescently ...

Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

SDS ページを用いたリン酸 binding タグ LRRK2 活動によって Rab10 リン酸化検出

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

Capturing the Interaction Kinetics of an Ion Channel Protein with Small Molecules by the Bio-layer Interferometry Assay

バイオ層干渉法による小分子とイオン チャネル蛋白質の相互作用の動力学をキャプチャ

The bio-layer interferometry (BLI) assay is a valuable tool for measuring protein-protein and protein-small molecule interactions. Here, we first describe ...

Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain

高効率巻き戻しと受容体リガンド結合領域の浄化法

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be ...

Detection of Small GTPase Prenylation and GTP Binding Using Membrane Fractionation and  GTPase-linked Immunosorbent Assay

小さい gtp アーゼ プレニル化および分子量 GTP 結合を使用して膜分画と gtp アーゼ抗体法の検出

The Rho GTPase family belongs to the Ras superfamily and includes approximately 20 members in humans. Rho GTPases are important in the regulation of ...

Analysis of AtHIRD11 Intrinsic Disorder and Binding Towards Metal Ions by Capillary Gel Electrophoresis and Affinity Capillary Electrophoresis

AtHIRD11 本質的な障害とキャピラリー電気泳動と親和性キャピラリー電気泳動による金属イオンへの結合の解析

Plants are strongly dependent on their environment. In order to adjust to stressful changes (e.g., drought and high salinity), higher plants evolve ...

A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors

低分子阻害剤スクリーニングのためのNADH結合ATPaseアッセイの半高スループット適応

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would ...