Name: identifying the binding proteins of small ligands with the differential radial capillary action of ligand assay (dracala)
Uploaded: 2021-03-19T14:30:00
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이 작품은 NNF 프로젝트 보조금(NNF19OC00058331)이 YEZ에 지원하고, MLS에 마리 Skłodowska-Curie 보조금 계약 (Nº 801199)에 따라 유럽 연합의 호라이즌 2020 연구 및 혁신 프로그램에 의해 지원됩니다.
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62331/62331img1.jpg">

1. 전체 세포 리스의 준비
<ol><li>대장균 K-12 ASKA ORFeome 컬렉션 균주15 에 1.5 mL 리소제니 국물 (LB) 포함 25 μg/mL 클로람페니콜 96 잘 깊은 우물 플레이트. 160 rpm에서 흔들리면 30 °C에서 18 시간 동안 하룻밤 (O / N)으로 성장하십시오. 다음 날, O/N 배양에 이소프로필 β-d-1-티오갈라크토피라노사이드(최종 0.5mMMM)를 첨가하여 단백질 발현을 6시간 동안 30°C로 유도한다.</li>
	<li>펠릿 ?...

<ol>
	<li>Kalia, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleotide,+c-di-GMP,+c-di-AMP,+cGMP,+cAMP,+(p)ppGpp+signaling+in+bacteria+and+implications+in+pathogenesis.">Nucleotide, c-di-GMP, c-di-AMP, cGMP, cAMP, (p)ppGpp signaling in bacteria and implications in pathogenesis.</a> Chemical Society Reviews. 42 (1), 305-341 (2013).</li><li>Camilli, A., Bassler, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+small-molecule+signaling+pathways.">Bacterial small-molecule signaling pathways.</a> Science. 311 (5764), 1113-1116 (2006).</li><li>Luo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cAMP+capture+compound+mass+spectrometry+as+a+novel+tool+for+targeting+cAMP-binding+proteins:+from+protein+kinase+A+to+potassium/sodium+hyperpolarization-activated+cyclic+nucleotide-gated+channels.">The cAMP capture compound mass spectrometry as a novel tool for targeting cAMP-binding proteins: from protein kinase A to potassium/sodium hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channels.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 8 (12), 2843-2856 (2009).</li><li>Nesper, J., Reinders, A., Glatter, T., Schmidt, A., Jenal, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+capture+compound+for+the+identification+and+analysis+of+cyclic+di-GMP+binding+proteins.">A novel capture compound for the identification and analysis of cyclic di-GMP binding proteins.</a> Journal of Proteomics. 75 (15), 4874-4878 (2012).</li><li>Laventie, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capture+compound+mass+spectrometry--a+powerful+tool+to+identify+novel+c-di-GMP+effector+proteins.">Capture compound mass spectrometry--a powerful tool to identify novel c-di-GMP effector proteins.</a> Journal of Visual Experiments. (97), e51404 (2015).</li><li>Roelofs, K. G., Wang, J., Sintim, H. O., Lee, V. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+radial+capillary+action+of+ligand+assay+for+high-throughput+detection+of+protein-metabolite+interactions.">Differential radial capillary action of ligand assay for high-throughput detection of protein-metabolite interactions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (37), 15528-15533 (2011).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+adaptation+of+the+essential+tRNA+methyltransferase+TrmD+to+the+signaling+molecule+3+',5+'-cAMP+in+bacteria.">Evolutionary adaptation of the essential tRNA methyltransferase TrmD to the signaling molecule 3 ',5 '-cAMP in bacteria.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (1), 313-327 (2017).</li><li>Corrigan, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+identification+of+conserved+bacterial+c-di-AMP+receptor+proteins.">Systematic identification of conserved bacterial c-di-AMP receptor proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (22), 9084-9089 (2013).</li><li>Roelofs, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+identification+of+cyclic-di-GMP+binding+proteins+in+Vibrio+cholerae+reveals+a+novel+class+of+cyclic-di-GMP-binding+ATPases+associated+with+type+II+secretion+systems.">Systematic identification of cyclic-di-GMP binding proteins in Vibrio cholerae reveals a novel class of cyclic-di-GMP-binding ATPases associated with type II secretion systems.</a> PLoS Pathogen. 11 (10), 1005232 (2015).</li><li>Fang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GIL,+a+new+c-di-GMP-binding+protein+domain+involved+in+regulation+of+cellulose+synthesis+in+enterobacteria.">GIL, a new c-di-GMP-binding protein domain involved in regulation of cellulose synthesis in enterobacteria.</a> Molecular Microbiology. 93 (3), 439-452 (2014).</li><li>Corrigan, R. M., Bellows, L. E., Wood, A., Grundling, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ppGpp+negatively+impacts+ribosome+assembly+affecting+growth+and+antimicrobial+tolerance+in+Gram-positive+bacteria.">ppGpp negatively impacts ribosome assembly affecting growth and antimicrobial tolerance in Gram-positive bacteria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1710-1719 (2016).</li><li>Zhang, Y., Zbornikova, E., Rejman, D., Gerdes, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+(p)ppGpp+binding+and+metabolizing+proteins+of+Escherichia+coli.">Novel (p)ppGpp binding and metabolizing proteins of Escherichia coli.</a> Mbio. 9 (2), 02188 (2018).</li><li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nucleotide+pGpp+acts+as+a+third+alarmone+in+Bacillus,+with+functions+distinct+from+those+of+(p)+ppGpp.">The nucleotide pGpp acts as a third alarmone in Bacillus, with functions distinct from those of (p) ppGpp.</a> Nature Communications. 11 (1), 5388 (2020).</li><li>Orr, M. W., Lee, V. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+radial+capillary+action+of+ligand+assay+(DRaCALA)+for+high-throughput+detection+of+protein-metabolite+interactions+in+bacteria.">Differential radial capillary action of ligand assay (DRaCALA) for high-throughput detection of protein-metabolite interactions in bacteria.</a> Methods in Molecular Biology. 1535, 25-41 (2017).</li><li>Kitagawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+set+of+ORF+clones+of+Escherichia+coli+ASKA+library+(A+complete+Set+of+E.+coli+K-12+ORF+archive):+Unique+resources+for+biological+research.">Complete set of ORF clones of Escherichia coli ASKA library (A complete Set of E. coli K-12 ORF archive): Unique resources for biological research.</a> DNA Research. 12 (5), 291-299 (2005).</li><li>Hochstadt-Ozer, J., Cashel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+purine+utilization+in+bacteria.+V.+Inhibition+of+purine+phosphoribosyltransferase+activities+and+purine+uptake+in+isolated+membrane+vesicles+by+guanosine+tetraphosphate.">The regulation of purine utilization in bacteria. V. Inhibition of purine phosphoribosyltransferase activities and purine uptake in isolated membrane vesicles by guanosine tetraphosphate.</a> Journal of Biological Chemistry. 247 (21), 7067-7072 (1972).</li><li>Zhang, Y. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p)ppGpp+regulates+a+bacterial+nucleosidase+by+an+allosteric+two-domain+switch.">p)ppGpp regulates a bacterial nucleosidase by an allosteric two-domain switch.</a> Molecular Cell. 74 (6), 1239-1249 (2019).</li><li>Wang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity-based+capture+and+identification+of+protein+effectors+of+the+growth+regulator+ppGpp.">Affinity-based capture and identification of protein effectors of the growth regulator ppGpp.</a> Nature Chemical Biology. 15 (2), 141-150 (2019).</li></ol>

DRaCALA 스크리닝을 수행하는 중요한 단계 중 하나는 좋은 전체 세포 리스를 얻는 것입니다. 첫째, 테스트된 단백질은 다량과 수용성 형태로 생산되어야 합니다. 둘째, 세포의 용해가 완료되어야하며, 용물의 점도는 최소화해야합니다. 리소지메의 포함과 동결 해동의 세 주기의 사용은 종종 완전히 세포를 lyse 충분하다. 그러나, 방출된 염색체 DNA는 용액점성 및 높은 배경 결합 신호를 생성하여 <stron...

박테리아는 끊임없이 변화하는 환경에 적응하기 위해 여러 개의 작은 신호 분자를 사용1,2. 예를 들어, 자가유도기, N-아실모케린 락톤 및 수정된 올리고펩티드, 박테리아 간의 세포간 통신을 중재하여 인구 거동, 쿼럼 센싱2로알려진 현상을 조정한다. 작은 신호 분자의 또 다른 그룹은 널리 연구 된 순환 아데노신 모노 포스 페이트 (cAMP), 순환 디-AMP, 순환 디 구아노신 모노 인산염 (순환 디-GMP), 및 구아노신 펜타 및 테트라 인산염(ppp)을 포함하여 NSM입니다. 박테리아는 다양한 스트레스 조건에 대한 응답으로 이러한 NSM을 생산합니다. 일단 생성되면, 이 분자는 그들의 표적 단백질에 결합하고 만나는 응고에 대처하고 세균성 생존을 강화하기 위하여 몇몇 다른 생리적이고 신진 대사 통로를 조절합니다. 따라서, 표적 단백질의 식별은 이 작은 분자의 분자 기능을 해독하기 위한 피할 수 없는 전제 조건이다.
지난 10 년은 이 작은 분자의 표적 단백질을 공개한 몇몇 기술 혁신 때문에 주로 이 작은 신호 분자의 지식의 붐을 목격했습니다. 이들 로는 이 논문에서 논의될 리간 분석(DRaCALA)6의 포획 화합물 기술3,4,5,및 차동 방사형 모세관 작용을 포함한다.
2011년6년빈센트 리와 동료들이 발명한 DRaCALA는 니트로셀룰로오스 막의 능력을 차별화적으로 분리하여 무료 및 단백질 바운드 리간드에 배치합니다. 단백질과 같은 분자는 니트로셀룰로오스 막에서 확산될 수 없으며, NSM과 같은 작은 리간드는 확산될 수 있습니다. NSM(예를들어,ppGpp)을 시험할 단백질과 혼합하여 멤브레인에서 이를 발견하면 2가지 시나리오를 기대할 수있습니다(그림 1):(p)ppGpp가 단백질에 결합하면, 방사성 라벨(p)ppGpp는 단백질에 의해 그 자리의 중앙에 유지되고, 강렬한 작은 점(i.i.) 강한 방사성 신호) 인산화증하에서. 그러나(p)ppGpp가 단백질에 결합하지 않으면, 균일한 배경 방사성 신호로 큰 지점을 생성하기 위해 자유롭게 바깥쪽으로 확산된다.
더욱이, DRaCALA는 단백질이 충분한 양으로 존재하는 경우에 전체 세포 용액에 있는 작은 분자와 불정제 단백질 사이 상호 작용을 검출할 수 있습니다. 이러한 단순성으로 ORFeome 발현 라이브러리를 사용하여 단백질 표적을 빠르게 식별할 수 있는 DRaCALA를 사용할 수 있습니다. 실제로, cAMP7,순환 디-암8,순환 디-GMP9,10,및 (p)ppGpp11,12,13의 표적 단백질은 DRaCALA를 사용하여 체계적으로 확인되었다. 이 비디오 문서에서는 (p) ppGpp를 예로 사용하여 성공적인 DRaCALA 스크리닝을 수행하는 데 중요한 단계와 고려 사항을 설명하고 설명합니다. 참고, DRaCALA의 더 철저한 설명14 는 DRaCALA를 수행 하기 전에이 문서와 함께 읽는 것이 좋습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62331/62331fig01.jpg"> 그림 1: DRaCALA의 원리. (A)DRaCALA 분석의 회로도. 자세한 내용은 텍스트를 참조하십시오. (B)바인딩 분획의 정량화 및 계산. 자세한 내용은 텍스트를 참조하십시오. 간단히, DRaCALA 반점은 전체 반점과 내부 다크닷(즉,테스트된 단백질의 결합으로 인해 유지된(p)ppGpp를 둘레에 두 개의 원을 그려 분석될 것이다. 특이적 결합 신호는 비특이적 배경 신호(A1 ×(S 2-S 1)/(A2-A1)에의해계산된)를 빼낸 후 내부 원(S1)의 방사성 신호이다. 결합 분획은 총 방사성 신호(S2)로 나눈 특정 결합 신호이다. 약어: DRaCALA = 리간드 분석의 차동 방사형 모세관 작용; (p)ppGpp = 구아노신 펜타 및 테트라포산염; RT = 실온. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62331/62331fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>32P-&#945;-GTP</td>
			<td>Perkinelmer</td>
			<td>BLU006X250UC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 x pin tool</td>
			<td>V&#38;P Scientific</td>
			<td>VP 404</td>
			<td>96 Bolt Replicator, on 9 mm centers, 4.2 mm Bolt Diameter, 24 mm long</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well V-bottom microtiter plate</td>
			<td>Sterilin</td>
			<td>MIC9004</td>
			<td>Sterilin Microplate V Well 611V96</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>OXOID - Thermo Fisher</td>
			<td>LP0011</td>
			<td>Agar no. 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ASKA collection strain</td>
			<td>NBRP, SHIGEN, JAPAN</td>
			<td></td>
			<td>Ref: DNA Research, Volume 12, Issue 5, 2005, Pages 291&#8211;299. https://doi.org/10.1093/dnares/dsi012</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>E1014-25KU</td>
			<td>genetically engineered endonuclease from Serratia marcescens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford Protein Assay Dye</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>5000006</td>
			<td>Reagent Concentrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D8418</td>
			<td>&#8805;99.9%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase 1</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>DN25-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gel filtration10x300 column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28990944</td>
			<td>contains 20% ethanol as preservative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>122329.1214</td>
			<td>Glycerol 87% for analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypercassette</td>
			<td>Amersham</td>
			<td>RPN 11647</td>
			<td>20 x 40 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>56750</td>
			<td>puriss. p.a., &#8805; 99.5% (GC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IP Storage Phosphor Screen</td>
			<td>FUJIFILM</td>
			<td>28956474</td>
			<td>BAS-MS 2040 20x 40 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>I6758</td>
			<td>Isopropyl &#946;-D-thiogalactoside</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysogeny Broth (LB)</td>
			<td>Invitrogen - Thermo Fisher</td>
			<td>12795027</td>
			<td>Miller&#39;s LB Broth Base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>L4949</td>
			<td>from chicken egg white; BioUltra, lyophilized powder, &#8805;98%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 (Magnesium chloride)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>208337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliQ water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ultrapure water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multichannel pipette</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>4661110</td>
			<td>F1 - Clip Tip; 1-10 ul, 8 x channels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>27810</td>
			<td>AnalaR NORMAPUR, ACS, Reag. Ph. Eur.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Agarose</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>30230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose Blotting Membrane</td>
			<td>Amersham Protran</td>
			<td>10600003</td>
			<td>Premium 0.45 um 300 mm x 4 m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>OXOID - Thermo Fisher</td>
			<td>BR0014G</td>
			<td>Phosphate buffered saline (Dulbecco A), Tablets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG3350 (Polyethylene glycol 3350)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>202444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>93482</td>
			<td>Phenylmethanesulfonyl fluoride solution - 0.1 M in ethanol (T)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphor-imager</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28955809</td>
			<td>Typhoon FLA-7000 Phosphor-imager</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips, filtered</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>94410040</td>
			<td>ClipTip 12.5 &#956;l nonsterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-Prep Chromatography column</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7311550</td>
			<td>polypropylene chromatography column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor Mini</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>A32955</td>
			<td>Tablets, EDTA-free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>screw cap tube</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3488</td>
			<td>Microcentifuge Tubes, 2.0 ml with screw cap, nonsterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SLS 96-deep Well plates</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>780285</td>
			<td>MASTERBLOCK, 2 ML, PP, V-Bottom, Natural</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spin column</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC500396</td>
			<td>Amicon Ultra -0.5 ml Centrifugal Filters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5382000015</td>
			<td>Thermomixer C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC plate (PEI-cellulose F TLC plates)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>105579</td>
			<td>DC PEI-cellulose F (20 x 20 cm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>BP152</td>
			<td>Tris Base for Molecular Biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P1379</td>
			<td>viscous non-ionic detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>M3148</td>
			<td>99% (GC/titration)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identifying the binding proteins of small ligands with the differential radial capillary action of ligand assay (dracala)

지난 10 년 세균성 생리학에 있는 작은 신호 분자의 이해에 있는 엄청난 진전을 보았습니다. 특히, 여러 뉴클레오티드 유래 이차 메신저(NSM)의 표적 단백질은 모델 유기체에서 체계적으로 확인되고 연구되었다. 이러한 성과는 주로 이러한 소분자의 표적 단백질을 체계적으로 식별하는 데 사용되었던 리간드 분석시(DRaCALA)의 포획 화합물 기술과 차동 적대모세 혈관 작용을 포함한 몇 가지 새로운 기술의 개발 때문입니다. 이 논문은 DRaCALA 기술의 예 및 비디오 데모로 NSM, 과노신 펜타 및 테트라포산염(p)ppGpp의 사용을 설명합니다. DRaCALA를 사용하여, 20명 중 9개 및 12개의 새로운 표적 단백질(p)ppGpp가 모델 유기체, 대장균 K-12에서 확인되었으며, 이 분석의 힘을 입증하였다. 원칙적으로, DRaCALA는 방사성 동위원소 또는 형광 염료에 의해 표시될 수 있는 작은 리간드를 공부하기 위하여 이용될 수 있었습니다. DRaCALA의 중요한 단계, 장단점 및 단점은 이 기술을 추가로 적용하기 위해 여기에서 논의됩니다.

전술한 프로토콜에 따라 일반적으로 두 가지 유형의 결과를 산출한다(그림3).
도 3A는 대부분의 우물에서 상대적으로 낮은 배경 바인딩 신호(바인딩 분획 < 0.025)를 가진 플레이트를 나타낸다. 웰 H3의 양수 결합 신호는 다른 우물에서 관찰된 것보다 훨씬 높은 ~0.35의 결합 분획을 제공합니다. 정량화없이도, 잘 H3는 놀라운, 잘 H3에서 ?...

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Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay DRaCALA

리간드 분석(DRaCALA)의 차동 적개 모세관 작용은 ORFeome 라이브러리를 사용하여 유기체의 작은 리간 결합 단백질을 식별하는 데 사용될 수 있다.

리간드 분석의 차동 방사형 모세관 작용으로 작은 리간드의 결합 단백질 식별 (DRaCALA)

The past decade has seen tremendous progress in the understanding of small signaling molecules in bacterial physiology. In particular, the target proteins ...

작은 신호 분자는 세균성 독성 및 인간 생물학을 통제하기 위하여 각종 이펙터 단백질을 표적으로 합니다. 그러나, 이 효력제 단백질은 확인하기 어렵습니다. 시스템 생물학 도구로서 DRaCALA는 OVium 라이브러리를 사용하여 알 수 없는 이펙터 단백질을 실현 가능하고 빠르며 매우 민감한 식별할 수 있습니다.DRaCALA는 방사성 동위원소 또는 형광염으로 표시될 수 있는 한 작은 신호 분자를 연구하는 데 사용될 수 있습니다. E.coli를 LB의 1.5 밀리리터로 접종하여 96°C의 각 웰에서 밀리리터 클로람페니콜당 25마이크로그램으로 보충하여 1박 배양시 30도, 분당 160회 회전합니다. 다음날 아침, 단백질 발현을 유도하기 위해 섭씨 30도에서 6시간 동안 500 마이크로몰라 IPTG로 야간 배양을 치료한다.인큐베이션의 끝에서, 원심분리에 의해 세포를 펠릿, 상체를 제거하고, 영하 80도에서 샘플을 동결. 용해를 시작하려면, 37섭씨에서 20분 동안 세포를 해동하기 전에 30분 간 영하 80도에서 30분 간 잠복하는 동안 잘 150마이크로리터의 용해 완충제에서 펠릿을 다시 분리한다. 그런 다음 lysate를 사용하기 전에 영하 80도에 보관해야합니다.과발현 된 단백질로 세포의 용액을 완료하려면, 얼음 차가운 용해 버퍼 2의 40 밀리리터에서 샘플을 다시 중단하고 8 분 동안 4 초 에 60 %진폭에서 샘플을 초음파 처리 한 다음 원심 분리에 의해 lysates를 취소합니다. 시료가 원심분리되는 동안, 상질화된 니켈-NTA 수지 500마이크로리터를 서있는 폴리프로필렌 크로마토그래피 컬럼에 추가합니다. 15분 후, 정착수지15밀리리터의 초순수로 2회, 1회 15밀리리터의 리시스 버퍼 2로 세척합니다.원심 분리가 끝나면 클리어된 리자테 상체를 열에 로드합니다. 모든 lysate가 컬럼을 통해 흐르는 경우, 세척 버퍼의 30 밀리리터로 열을 세척. 단백질을 용인하기 위해, 열에 용출 버퍼의 400 마이크로 리터 볼륨을 추가하고 세 번 용출을 반복합니다.용출 버퍼의 또 다른 300 마이크로 리터 부피는 용출을 세 번 반복하고 700 마이크로 리터의 최종 부피로 용출 단백질을 결합합니다. 용출된 시료의 겔 여과를 위해, 갓 준비된 젤 여과 버퍼25밀리리터로 크기 배제 컬럼을 세척한 후, 500 마이크로리터 루프를 사용하여 용출된 단백질의 전체 부피를 컬럼에 적재한다. 분당 500 마이크로리터로 실행하고 각 단백질의 2~3개의 500마이크로리터 부피 분획을 수집합니다.그런 다음 개별 스핀 컬럼을 사용하여 각 단백질을 농축하고 브래드포드 분석 키트를 사용하여 표준 프로토콜에 따라 단백질 농도를 측정합니다. 구아노신 펜타포스페이트(guanosine pentaphosphate)라고 표시된 인(32)을 합성하기 위해 테이블에 설명된 대로 나사 로크 튜브에 작은 규모의 Relseq 반응을 조립하고 온도 섭씨 37도에서 1시간, 섭씨 95도에서 5분 동안 ThermoMixer에서 반응을 배양하고 얼음에서 5분 간 배양합니다. 인큐베이션의 끝에서, 원심분리에 의해 침전된 단백질을 스핀다운하고 새로운 나사 캡이 덮인 튜브에 초신을 함유하는 구노신 펜타포스페이트(guanosine pentaphosphate)로 표기된 합성인(32)을 전달한다.인 32 과노신 테트라포산염 합성의 경우, 새로운 나사 로크 튜브에 인 32 라벨과노신 펜타포스페이트 제품의 절반에 마이크로몰라 GppA 를 추가하고 10 분 동안 반응을 배양 37 섭씨, 섭씨 95도에서 5 분, 얼음에 5 분. 인큐베이션의 끝에서, 원심분리에 의해 침전을 회전하고 새로운 튜브에 상류체를 포함하는 구아노신 테트라포산염을 포함하는 인 32 를 전송한다. 격리된 표적 단백질을 분석하려면, 1.5개의 어금반 모노포타슘 인산염을 이동상으로 사용하여 얇은 층 크로마토그래피 플레이트에 각 샘플의 마이크로리터 1개를 실행한다.분석 후, 말린 플레이트를 투명 플라스틱 폴더에 놓고 피광기 이미저에서 데이터를 시각화하고 정량화하기 전에 5 분 동안 저장 인광판 화면에 플레이트를 노출합니다. 표적 단백질의 DRaCALA 스크리닝의 경우, 해동 된 도매 용액 20 마이크로 리터를 95 웰 V-바닥 마이크로티터 플레이트의 개별 우물에 추가하고 각 우물에 세라티아 마르세센 엔토너리스 2.5 단위를 추가합니다. 섭씨 37도에서 15분 후, 20분 동안 얼음 위에 용사를 놓습니다.다음으로, 동일한 부피 32개의 구아노신 펜타포산염과 구노신 테트라포산염을 혼합하고 혼합물에 1X 리시스 버퍼 1개를 추가하여 4나노몰라 관타나모 펜타포스페이트 용액을 획득한다. 다중 채널 파이펫과 여과된 파이펫 팁을 사용하여 구아노신 펜타포스페이트 혼합물의 10마이크로리터를 실온에서 5분간 잠복할 수 있는 셀 리자이트와 혼합합니다. 인큐베이션이 끝나면 96X 핀 공구를 30초 동안 논이온 세제용 0.01%의 용액으로 3회 세척한 후, 96웰 샘플 플레이트에 핀 툴을 넣기 전에 세척당 종이 타월에서 30초 건조를 합니다.30초 후 핀 도구를 똑바로 들어 올려 니트로셀룰로오스 멤브레인에 30초 동안 똑바로 놓습니다. 건조 5분 후, 니트로셀룰로오스 멤브레인을 투명 플라스틱 폴더에 배치하여 인광화상 영상에 의한 저장 형광식 스크린 노출 및 시각화를 입증하였다. 잠재적인 표적 단백질을 정량화하고 식별하려면 인광선 과 관련된 분석 소프트웨어에서 시각화 된 플레이트의 젤 파일을 엽니 다.분석할 스팟을 정의하려면 배열 분석 함수를 사용하여 12열을 8열 그리드로 설정합니다. 구멍 반점의 바깥쪽 가장자리를 돌례하려면 큰 원을 정의하고 정의된 큰 원의 볼륨과 배경 과 영역을 스프레드시트에 내보냅니다. 작은 내부 점을 할당하려면 정의된 원 아래로 크기를 조정하고 정의 된 작은 원의 볼륨과 배경 및 영역을 내보내고 스프레드 시트에 있는 모든 데이터를 저장합니다.필요에 따라 스팟과 겹치는 위치 원이 실제 반점보다 약간 큰 크기를 조정합니다. 방정식을 사용하여 스프레드시트의 바인딩 분수를 계산하고 데이터를 플롯합니다. 그런 다음 다른 우물의 대다수에 비해 높은 결합 분수를 보여주는 우물에서 잠재적인 결합 단백질을 식별합니다.본 대표적인 분석에서는 대부분의 우물에서 백그라운드 바인딩 신호가 상대적으로 낮은 플레이트를 관찰할 수 있다. 잘 H3에서 양성 결합 신호는 구아노신 펜타포스페이트 결합 단백질 Hpt의 과발현으로 인해 다른 우물에 대해 관찰된 것보다 훨씬 높은 결합 분획을 나타냈다. 대표 판에서, 몇몇 우물은 많은 우물에서 관찰된 상대적으로 강한 내부 점에 의해 표시된 바와 같이 상대적으로 높은 배경 결합 신호를 보여주었으며, 정량화 후에 관찰되는 일관되게 높은 결합 분획을 보였다.특히 일부 대상은 거짓 긍정과 같은 가변 바인딩 분수도 제공했습니다. 추가 명확히 하기 위해, 연구원은 다시 결합을 시험하기 위하여 정제된 단백질을 이용했습니다. 표적 단백질이 확인되면, DRaCALA, 이더탈 적정 열량또는 다른 방법을 사용하여 상호 작용 강도 와 특이성을 균일하게 정화하고 상호 작용 강도 와 특이성을 확인할 수 있습니다.작은 신호 분자의 표적 단백질을 식별하는 것은 인간 생물학에 세균 독성에서 나오는 역할에 대한 심층적인 이해로 가는 길을 열어줍니다.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay (DRaCALA)

Identification of Small Molecule-binding Proteins in a Native Cellular Environment by Live-cell Photoaffinity Labeling

라이브 셀 Photoaffinity 라벨에 의해 기본 셀룰러 환경에서 작은 분자 결합 단백질의 식별

Identifying the molecular target(s) of small molecules is a challenging but necessary step towards understanding their mechanism of action. While several ...

연구

생화학

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

방법 및 HCN1 TRIP8b 간의 단백질 - 단백질 상호 작용의 작은 분자 억제제 식별

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Measuring Biomolecular DSC Profiles with Thermolabile Ligands to Rapidly Characterize Folding and Binding Interactions

바이오 DSC 프로필 Thermolabile Ligands 빠르게 폴딩 및 바인딩 상호 작용의 특성을 측정

Differential scanning calorimetry (DSC) is a powerful technique for quantifying thermodynamic parameters governing biomolecular folding and binding ...

Nitrogen Cavitation and Differential Centrifugation Allows for Monitoring the Distribution of Peripheral Membrane Proteins in Cultured Cells

질소 현상과 차등 원심 분리 배양된 세포의 주변 막 단백질의 분포를 모니터링 가능

Cultured cells are useful for studying the subcellular distribution of proteins, including peripheral membrane proteins. Genetically encoded fluorescently ...

Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

Rab10 인 산화 탐지 LRRK2 활동 인산 염-바인딩 태그와 SDS 페이지를 사용 하 여

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

Capturing the Interaction Kinetics of an Ion Channel Protein with Small Molecules by the Bio-layer Interferometry Assay

바이오-레이어 간섭계 분석 결과 의해 작은 분자와 이온 채널 단백질의 상호 작용 활동을 캡처

The bio-layer interferometry (BLI) assay is a valuable tool for measuring protein-protein and protein-small molecule interactions. Here, we first describe ...

Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain

효율적인 Refolding 및 Chemoreceptor Ligand 바인딩 도메인의 정화 방법

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be ...

Detection of Small GTPase Prenylation and GTP Binding Using Membrane Fractionation and  GTPase-linked Immunosorbent Assay

작은 GTPase Prenylation와 GTP 바인딩 사용 하 여 막 분류 및 GTPase 연결 된 Immunosorbent 분석 결과의 검색

The Rho GTPase family belongs to the Ras superfamily and includes approximately 20 members in humans. Rho GTPases are important in the regulation of ...

Analysis of AtHIRD11 Intrinsic Disorder and Binding Towards Metal Ions by Capillary Gel Electrophoresis and Affinity Capillary Electrophoresis

AtHIRD11 내장 장애 및 모 세관 젤 전기 이동 법 및 선호도 모 세관 전기 이동 법에 의해 금속 이온으로 바인딩 분석

Plants are strongly dependent on their environment. In order to adjust to stressful changes (e.g., drought and high salinity), higher plants evolve ...

A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors

소분자 억제제 스크리닝을 위한 NADH 결합 ATPase 분석의 반 높은 처리량 적응

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would ...