Name: identifying the binding proteins of small ligands with the differential radial capillary action of ligand assay (dracala)
Uploaded: 2021-03-19T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay DRaCALA at JoVE.com

Arbeidet støttes av et NNF Project Grant (NNF19OC0058331) til YEZ, og EUs forsknings- og innovasjonsprogram Horizon 2020 under Marie Skłodowska-Curie-tilskuddsavtalen (Nº 801199) til MLS.
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62331/62331img1.jpg">

1. Fremstilling av hele cellelysater
<ol><li>Inokuler E. coli K-12 ASKA ORFeome-kolleksjonenstammer 15 til 1,5 ml Lysogeny buljong (LB) som inneholder 25 μg/ml kloramfenikol i 96-brønns dype brønnplater. Vokse over natten (O / N) i 18 timer ved 30 °C med risting ved 160 o/min. Neste dag legger du til isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) (endelig 0,5 mM) til O/N-kulturene for å indusere proteinuttrykk ved 30 °C i 6 timer.</li>
	<li>Pelletsceller på 500 x g i 10 m...

<ol>
	<li>Kalia, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleotide,+c-di-GMP,+c-di-AMP,+cGMP,+cAMP,+(p)ppGpp+signaling+in+bacteria+and+implications+in+pathogenesis.">Nucleotide, c-di-GMP, c-di-AMP, cGMP, cAMP, (p)ppGpp signaling in bacteria and implications in pathogenesis.</a> Chemical Society Reviews. 42 (1), 305-341 (2013).</li><li>Camilli, A., Bassler, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+small-molecule+signaling+pathways.">Bacterial small-molecule signaling pathways.</a> Science. 311 (5764), 1113-1116 (2006).</li><li>Luo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cAMP+capture+compound+mass+spectrometry+as+a+novel+tool+for+targeting+cAMP-binding+proteins:+from+protein+kinase+A+to+potassium/sodium+hyperpolarization-activated+cyclic+nucleotide-gated+channels.">The cAMP capture compound mass spectrometry as a novel tool for targeting cAMP-binding proteins: from protein kinase A to potassium/sodium hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channels.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 8 (12), 2843-2856 (2009).</li><li>Nesper, J., Reinders, A., Glatter, T., Schmidt, A., Jenal, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+capture+compound+for+the+identification+and+analysis+of+cyclic+di-GMP+binding+proteins.">A novel capture compound for the identification and analysis of cyclic di-GMP binding proteins.</a> Journal of Proteomics. 75 (15), 4874-4878 (2012).</li><li>Laventie, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capture+compound+mass+spectrometry--a+powerful+tool+to+identify+novel+c-di-GMP+effector+proteins.">Capture compound mass spectrometry--a powerful tool to identify novel c-di-GMP effector proteins.</a> Journal of Visual Experiments. (97), e51404 (2015).</li><li>Roelofs, K. G., Wang, J., Sintim, H. O., Lee, V. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+radial+capillary+action+of+ligand+assay+for+high-throughput+detection+of+protein-metabolite+interactions.">Differential radial capillary action of ligand assay for high-throughput detection of protein-metabolite interactions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (37), 15528-15533 (2011).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+adaptation+of+the+essential+tRNA+methyltransferase+TrmD+to+the+signaling+molecule+3+',5+'-cAMP+in+bacteria.">Evolutionary adaptation of the essential tRNA methyltransferase TrmD to the signaling molecule 3 ',5 '-cAMP in bacteria.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (1), 313-327 (2017).</li><li>Corrigan, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+identification+of+conserved+bacterial+c-di-AMP+receptor+proteins.">Systematic identification of conserved bacterial c-di-AMP receptor proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (22), 9084-9089 (2013).</li><li>Roelofs, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+identification+of+cyclic-di-GMP+binding+proteins+in+Vibrio+cholerae+reveals+a+novel+class+of+cyclic-di-GMP-binding+ATPases+associated+with+type+II+secretion+systems.">Systematic identification of cyclic-di-GMP binding proteins in Vibrio cholerae reveals a novel class of cyclic-di-GMP-binding ATPases associated with type II secretion systems.</a> PLoS Pathogen. 11 (10), 1005232 (2015).</li><li>Fang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GIL,+a+new+c-di-GMP-binding+protein+domain+involved+in+regulation+of+cellulose+synthesis+in+enterobacteria.">GIL, a new c-di-GMP-binding protein domain involved in regulation of cellulose synthesis in enterobacteria.</a> Molecular Microbiology. 93 (3), 439-452 (2014).</li><li>Corrigan, R. M., Bellows, L. E., Wood, A., Grundling, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ppGpp+negatively+impacts+ribosome+assembly+affecting+growth+and+antimicrobial+tolerance+in+Gram-positive+bacteria.">ppGpp negatively impacts ribosome assembly affecting growth and antimicrobial tolerance in Gram-positive bacteria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1710-1719 (2016).</li><li>Zhang, Y., Zbornikova, E., Rejman, D., Gerdes, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+(p)ppGpp+binding+and+metabolizing+proteins+of+Escherichia+coli.">Novel (p)ppGpp binding and metabolizing proteins of Escherichia coli.</a> Mbio. 9 (2), 02188 (2018).</li><li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nucleotide+pGpp+acts+as+a+third+alarmone+in+Bacillus,+with+functions+distinct+from+those+of+(p)+ppGpp.">The nucleotide pGpp acts as a third alarmone in Bacillus, with functions distinct from those of (p) ppGpp.</a> Nature Communications. 11 (1), 5388 (2020).</li><li>Orr, M. W., Lee, V. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+radial+capillary+action+of+ligand+assay+(DRaCALA)+for+high-throughput+detection+of+protein-metabolite+interactions+in+bacteria.">Differential radial capillary action of ligand assay (DRaCALA) for high-throughput detection of protein-metabolite interactions in bacteria.</a> Methods in Molecular Biology. 1535, 25-41 (2017).</li><li>Kitagawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+set+of+ORF+clones+of+Escherichia+coli+ASKA+library+(A+complete+Set+of+E.+coli+K-12+ORF+archive):+Unique+resources+for+biological+research.">Complete set of ORF clones of Escherichia coli ASKA library (A complete Set of E. coli K-12 ORF archive): Unique resources for biological research.</a> DNA Research. 12 (5), 291-299 (2005).</li><li>Hochstadt-Ozer, J., Cashel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+purine+utilization+in+bacteria.+V.+Inhibition+of+purine+phosphoribosyltransferase+activities+and+purine+uptake+in+isolated+membrane+vesicles+by+guanosine+tetraphosphate.">The regulation of purine utilization in bacteria. V. Inhibition of purine phosphoribosyltransferase activities and purine uptake in isolated membrane vesicles by guanosine tetraphosphate.</a> Journal of Biological Chemistry. 247 (21), 7067-7072 (1972).</li><li>Zhang, Y. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p)ppGpp+regulates+a+bacterial+nucleosidase+by+an+allosteric+two-domain+switch.">p)ppGpp regulates a bacterial nucleosidase by an allosteric two-domain switch.</a> Molecular Cell. 74 (6), 1239-1249 (2019).</li><li>Wang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity-based+capture+and+identification+of+protein+effectors+of+the+growth+regulator+ppGpp.">Affinity-based capture and identification of protein effectors of the growth regulator ppGpp.</a> Nature Chemical Biology. 15 (2), 141-150 (2019).</li></ol>

Et av de kritiske trinnene for å utføre DRaCALA-screening er å oppnå gode hele cellelys. For det første bør de testede proteinene produseres i store mengder og i oppløselige former. For det andre bør lysis av celler være komplett, og lysatets viskositet må være minimal. Inkluderingen av lysozyme og bruk av tre sykluser med fryse-tining er ofte nok til å lyse celler helt. Imidlertid gjør det frigjorte kromosomale DNA lysatet viskøs og genererer høy bakgrunnsbindingssignal, noe som resulterer i falske positi...

Bakterier bruker flere små signalmolekyler for å tilpasse seg stadig skiftende miljøer1,2. For eksempel, autoindusere, N-acylhomoserine laktoser og deres modifiserte oligopeptider, formidler intercellulær kommunikasjon blant bakterier for å koordinere befolkningsadferd, et fenomen kjent som quorum sensing2. En annen gruppe små signalmolekyler er NSM-ene, inkludert det mye studerte sykliske adenosinmonofosfatet (cAMP), syklisk di-AMP, syklisk di-guanosinmonofosfat (syklisk di-GMP) og guanosin penta- og tetrafosfater (p)ppGpp1. Bakterier produserer disse NSM-ene som et svar på en rekke ulike stressforhold. Når de er produsert, binder disse molekylene seg til sine målproteiner og regulerer flere forskjellige fysiologiske og metabolske veier for å takle de påløpkede påkjenningene og forbedre bakteriell overlevelse. Derfor er identifisering av målproteinene en uunngåelig forutsetning for å dechiffrere molekylære funksjoner til disse små molekylene.
Det siste tiåret har vært vitne til en boom av kunnskap om disse små signalmolekylene, hovedsakelig på grunn av flere tekniske innovasjoner som avduket målproteinene til disse små molekylene. Disse inkluderer fangstsammensetningsteknikken3,4,5og differensial radial kapillærvirkning av ligandanalyse (DRaCALA)6 som skal diskuteres i dette dokumentet.
Oppfunnet av Vincent Lee og medarbeidere i 20116, DRaCALA distribuerer evnen til en nitrocellulosemembran til differensialt sequester frie og proteinbundne ligander. Molekyler som proteiner kan ikke spre seg på en nitrocellulosemembran, mens små ligander, som NSM-ene, er i stand til det. Ved å blande NSM (f.eks.ppGpp) med proteinet som skal testes og oppdage dem på membranen, kan to scenarier forventes (Figur 1): Hvis (p)ppGpp binder seg til proteinet, vil den radiomerkede (p)ppGpp beholdes i midten av stedet av proteinet og vil ikke spre seg utover, noe som gir en intens liten prikk (dvs. radioaktivt signal) under en fosforimager. Men hvis (p)ppGpp ikke binder seg til proteinet, vil det spre seg fritt utover for å produsere et stort sted med ensartet bakgrunn radioaktivt signal.
Videre kan DRaCALA oppdage samspillet mellom et lite molekyl og et uoppgjort protein i en hel cellelyse hvis proteinet er tilstede i tilstrekkelig mengde. Denne enkelheten gjør det mulig å bruke DRaCALA i raskt å identifisere proteinmål ved hjelp av et ORFeome-uttrykksbibliotek. Faktisk er målproteiner av cAMP7, syklisk di-AMP8, syklisk di-GMP9,10og (p) ppGpp11,12,13 systematisk identifisert ved hjelp av DRaCALA. Denne videoartikkelen bruker (p)ppGpp som et eksempel for å demonstrere og beskrive de kritiske trinnene og vurderingene ved å utføre en vellykket DRaCALA-screening. Vær oppmerksom på at en grundigere beskrivelse av DRaCALA14 anbefales på det sterkeste å lese i kombinasjon med denne artikkelen før du utfører DRaCALA.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62331/62331fig01.jpg"> Figur 1: Prinsippet om DRaCALA. (A) Skjematisk for DRaCALA-analysen. Se teksten hvis du vil ha mer informasjon. (B) Kvantifisering og beregning av bindingsfraksjonen. Se teksten hvis du vil ha mer informasjon. Kort sagt vil DRaCALA-flekkene bli analysert ved å tegne to sirkler som omskriver hele stedet og den indre mørke prikken (dvs.beholdt (p) ppGpp på grunn av bindingen av det testede proteinet). Det spesifikke bindingssignalet er det radioaktive signalet til den indre sirkelen (S1) etter at det ikke-spesifikke bakgrunnssignalet er trukket fra (beregnet med A1 × ((S2-S1)/(A2-A1))). Bindingsfraksjonen er det spesifikke bindingssignalet delt på det totale radioaktive signalet (S2). Forkortelser: DRaCALA = Differensial radial kapillær virkning av Ligand Assay; (p)ppGpp = guanosin penta- og tetrafosfater; RT = romtemperatur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62331/62331fig01large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>32P-&#945;-GTP</td>
			<td>Perkinelmer</td>
			<td>BLU006X250UC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 x pin tool</td>
			<td>V&#38;P Scientific</td>
			<td>VP 404</td>
			<td>96 Bolt Replicator, on 9 mm centers, 4.2 mm Bolt Diameter, 24 mm long</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well V-bottom microtiter plate</td>
			<td>Sterilin</td>
			<td>MIC9004</td>
			<td>Sterilin Microplate V Well 611V96</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>OXOID - Thermo Fisher</td>
			<td>LP0011</td>
			<td>Agar no. 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ASKA collection strain</td>
			<td>NBRP, SHIGEN, JAPAN</td>
			<td></td>
			<td>Ref: DNA Research, Volume 12, Issue 5, 2005, Pages 291&#8211;299. https://doi.org/10.1093/dnares/dsi012</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>E1014-25KU</td>
			<td>genetically engineered endonuclease from Serratia marcescens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford Protein Assay Dye</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>5000006</td>
			<td>Reagent Concentrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D8418</td>
			<td>&#8805;99.9%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase 1</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>DN25-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gel filtration10x300 column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28990944</td>
			<td>contains 20% ethanol as preservative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>122329.1214</td>
			<td>Glycerol 87% for analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypercassette</td>
			<td>Amersham</td>
			<td>RPN 11647</td>
			<td>20 x 40 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>56750</td>
			<td>puriss. p.a., &#8805; 99.5% (GC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IP Storage Phosphor Screen</td>
			<td>FUJIFILM</td>
			<td>28956474</td>
			<td>BAS-MS 2040 20x 40 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>I6758</td>
			<td>Isopropyl &#946;-D-thiogalactoside</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysogeny Broth (LB)</td>
			<td>Invitrogen - Thermo Fisher</td>
			<td>12795027</td>
			<td>Miller&#39;s LB Broth Base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>L4949</td>
			<td>from chicken egg white; BioUltra, lyophilized powder, &#8805;98%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 (Magnesium chloride)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>208337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliQ water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ultrapure water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multichannel pipette</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>4661110</td>
			<td>F1 - Clip Tip; 1-10 ul, 8 x channels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>27810</td>
			<td>AnalaR NORMAPUR, ACS, Reag. Ph. Eur.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Agarose</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>30230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose Blotting Membrane</td>
			<td>Amersham Protran</td>
			<td>10600003</td>
			<td>Premium 0.45 um 300 mm x 4 m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>OXOID - Thermo Fisher</td>
			<td>BR0014G</td>
			<td>Phosphate buffered saline (Dulbecco A), Tablets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG3350 (Polyethylene glycol 3350)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>202444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>93482</td>
			<td>Phenylmethanesulfonyl fluoride solution - 0.1 M in ethanol (T)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphor-imager</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28955809</td>
			<td>Typhoon FLA-7000 Phosphor-imager</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips, filtered</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>94410040</td>
			<td>ClipTip 12.5 &#956;l nonsterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-Prep Chromatography column</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7311550</td>
			<td>polypropylene chromatography column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor Mini</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>A32955</td>
			<td>Tablets, EDTA-free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>screw cap tube</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3488</td>
			<td>Microcentifuge Tubes, 2.0 ml with screw cap, nonsterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SLS 96-deep Well plates</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>780285</td>
			<td>MASTERBLOCK, 2 ML, PP, V-Bottom, Natural</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spin column</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC500396</td>
			<td>Amicon Ultra -0.5 ml Centrifugal Filters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5382000015</td>
			<td>Thermomixer C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC plate (PEI-cellulose F TLC plates)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>105579</td>
			<td>DC PEI-cellulose F (20 x 20 cm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>BP152</td>
			<td>Tris Base for Molecular Biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P1379</td>
			<td>viscous non-ionic detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>M3148</td>
			<td>99% (GC/titration)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identifying the binding proteins of small ligands with the differential radial capillary action of ligand assay (dracala)

Det siste tiåret har det vært en enorm fremgang i forståelsen av små signalmolekyler i bakteriefysiologi. Spesielt er målproteinene til flere nukleotidavledede sekundærbud (NSMer) systematisk identifisert og studert i modellorganismer. Disse prestasjonene skyldes hovedsakelig utviklingen av flere nye teknikker, inkludert fangstsammensetningsteknikken og differensial radial kapillærvirkning av ligandanalyse (DRaCALA), som ble brukt til systematisk å identifisere målproteiner av disse små molekylene. Dette dokumentet beskriver bruken av NSMer, guanosin penta- og tetrafosfater (p)ppGpp, som et eksempel og en videodemonstrasjon av DRaCALA-teknikken. Ved hjelp av DRaCALA ble 9 av 20 kjente og 12 nye målproteiner av (p)ppGpp identifisert i modellorganismen, Escherichia coli K-12, som demonstrerer kraften i denne analysen. I prinsippet kan DRaCALA brukes til å studere små ligander som kan merkes av radioaktive isotoper eller fluorescerende fargestoffer. De kritiske trinnene, fordelene og ulempene ved DRaCALA diskuteres her for videre bruk av denne teknikken.

Hvis du følger den ovenfor beskrevne protokollen, får du vanligvis to typer resultater (figur 3).
Figur 3A viser en plate med relativt lave bakgrunnsbindingssignaler (bindende fraksjoner < 0,025) fra de fleste brønnene. Det positive bindingssignalet fra brønn H3 gir en bindende brøkdel på ~0,35 som er mye høyere enn det som er observert for de andre brønnene. Selv uten kvantifisering er brønn H3 bemerkelsesverdig, noe som tyd...

Watch this Scientific Journal Video about Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay DRaCALA at JoVE.com

Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay DRaCALA

Differensial radial kapillærvirkning av Ligand Assay (DRaCALA) kan brukes til å identifisere små ligandbindende proteiner av en organisme ved hjelp av et ORFeome-bibliotek.

Identifisere bindingsproteiner av små ligander med differensial radial kapillær virkning av Ligand Assay (DRaCALA)

The past decade has seen tremendous progress in the understanding of small signaling molecules in bacterial physiology. In particular, the target proteins ...

Små signalmolekyler retter seg mot ulike effektorproteiner for å kontrollere bakteriell virulens og menneskelig biologi. Imidlertid er disse effektorproteinene utfordrende å identifisere. Som et systembiologisk verktøy tillater DRaCALA en gjennomførbar, rask og svært sensitiv identifisering av de ukjente effektorproteinene ved å bruke et OVium-bibliotek.DRaCALA kan brukes til å studere et lite signalmolekyl så lenge det kan merkes med enten radioaktive isotoper eller fluorescerende fargestoffer. Begynn med å inokulere E.coli i 1,5 milliliter LB supplert med 25 mikrogram per milliliter kloramfenikol i hver brønn på 96-brønn dype brønnplater for en nattinkubasjon ved 30 grader Celsius og 160 rotasjoner per minutt. Neste morgen, behandle nattkulturene med 500 mikromolar IPTG i seks timer ved 30 grader Celsius for å indusere proteinuttrykk.På slutten av inkubasjonen, pellet cellene ved sentrifugering, fjern supernatanten og frys prøvene ved minus 80 grader Celsius. For å starte lysis, resuspender pellets i 150 mikroliter lysis buffer en per brønn for en 30-minutters inkubasjon ved minus 80 grader Celsius før du tiner cellene i 20 minutter ved 37 grader Celsius. Lysatet skal deretter lagres ved minus 80 grader Celsius før bruk.For å fullføre lysis av celler med overekspresserte proteiner, resuspendere prøvene i 40 milliliter iskald lysis buffer to og sonikere prøvene med en 60% amplitude på to sekunder på fire sekunder av i åtte minutter, deretter fjerne lysates ved sentrifugering. Mens prøvene sentrifugeres, tilsett 500 mikroliter homogenisert nikkel-NTA-harpiks til en stående polypropylenkromatografikolonne. Etter 15 minutter, vask den avgjorte harpiksen to ganger med 15 milliliter ultrapure vann og en gang med 15 milliliter lysisbuffer to.På slutten av sentrifugeringen laster du den ryddede lysate supernatanten på kolonnen. Når alt lysatet har strømmet gjennom kolonnen, vask kolonnen med 30 milliliter vaskebuffer. For å unngå proteinene, tilsett 400 mikrolitervolum av elutionbuffer til kolonnen og gjenta elution tre ganger.Ytterligere 300 mikrolitervolum av elutionbufferen for å gjenta elution tre ganger og kombinere de eluterte proteinene i et sluttvolum på 700 mikroliter. For gelfiltrering av den eluterte prøven, etter å ha vasket en størrelsesekskluderingskolonne med 25 milliliter nylaget gelfiltreringsbuffer, last hele volumet av eluted protein på kolonnen ved hjelp av en 500 mikroliterløkke. Kjør på 500 mikroliter per minutt og samle to til tre 500 mikroliter volumfraksjoner av de respektive proteinene.Bruk deretter individuelle spinnkolonner til å konsentrere hvert protein og bruk Bradford-analysesettet til å måle proteinkonsentrasjonene i henhold til standardprotokoller. For å syntetisere fosfor 32 merket guanosin pentaphosphate, montere en liten relseq reaksjon i en skrue avkortet rør som skissert i bordet og inkubere reaksjonen i en ThermoMixer i en time ved 37 grader Celsius og fem minutter ved 95 grader Celsius, etterfulgt av fem minutter på is. På slutten av inkubasjonene, spinn ned det utfelte proteinet ved sentrifugering og overfør syntetisert fosfor 32 merket guanosin pentaphosfat som inneholder supernatant til et nytt skruekappet rør.For fosfor 32 guanosin tetrafosfatsyntese, tilsett en mikromolar GppA til halvparten av fosfor 32 merket guanosin pentaphosphate produkt i en ny skrue avkortet rør og inkubere reaksjonen i 10 minutter ved 37 grader Celsius, fem minutter ved 95 grader Celsius, og fem minutter på is. På slutten av inkubasjonen, spinn ned bunnfallet ved sentrifugering og overfør fosfor 32 merket guanosintetrafosfat som inneholder supernatant til et nytt rør. For å analysere de isolerte målproteinene, kjør en mikroliter av hver prøve på en tynn lagkromatografiplate ved hjelp av 1,5 molar monopotassiumfosfat som mobilfase.Etter analysen plasserer du den tørkede platen i en gjennomsiktig plastmappe og utsetter platen for en lagringsfosforskjerm i fem minutter før du visualiserer og kvantifiserer dataene på en fosforbilde. For DRaCALA-screening av målproteinene, tilsett 20 mikroliter av de opptinte engroslysene til individuelle brønner av en 95-brønns V-bunn mikrotiterplate og tilsett 2,5 enheter Serratia marcescens endonuclease til hver brønn. Etter 15 minutter ved 37 grader Celsius, plasser lysatene på is i 20 minutter.Bland deretter like store mengder fosfor 32 merket guanosin pentaphosfat og guanosintefosfat og tilsett 1X lysisbuffer en til blandingen for å oppnå en fire nanomolar guanosin pentaphosphate løsning. Bruk en flerkanals pipette og filtrerte pipettespisser, bland 10 mikroliter av guanosin pentaphosphate-blandingen med cellelyset for en fem minutters inkubasjon ved romtemperatur. På slutten av inkubasjonen vasker du et 96X pinneverktøy tre ganger i en 0,01% løsning av ikke-ionisk vaskemiddel i 30 sekunder, etterfulgt av 30 sekunders tørking på et papirhåndkle per vask før du legger pinneverktøyet i 96-brønns prøveplaten.Etter 30 sekunder løfter du stiftverktøyet rett opp og plasserer det rett ned på en nitrocellulosemembran i 30 sekunder. Etter fem minutters tørking plasserer du nitrocellulosemembranen i en gjennomsiktig plastmappe for lagring av fosforskjermeksponering og visualisering ved fosforavbildning som vist. For å kvantifisere og identifisere potensielle målproteiner, åpner du gelfilen til de visualiserte platene i analyseprogramvaren knyttet til fosforavbildningen.Hvis du vil definere flekkene som skal analyseres, bruker du matriseanalysefunksjonen til å definere et rutenett med 12 kolonner og åtte rader. For å omskrive den ytre kanten av hullflekkene, definer store sirkler, eksporter volumet pluss bakgrunn og område av de definerte store sirklene til et regneark. Hvis du vil omskrive de små indre prikkene, endrer du størrelsen på de definerte sirklene, eksporterer volumet pluss bakgrunnen og området for de definerte små sirklene og lagrer alle dataene i regnearket.Plasser sirkler for å overlappe med flekker etter behov, og endre størrelse på de litt større enn faktiske flekker. Bruk formelen til å beregne bindingsbrøkene i regnearket og tegne inn dataene. Identifiser deretter de potensielle bindende proteinene i brønnene som viser høye bindende fraksjoner sammenlignet med de fleste andre brønner.I denne representative analysen kan det observeres en plate med relativt lave bakgrunnsbindingssignaler i de fleste brønner. Det positive bindingssignalet i brønn H3 viste en bindingsfraksjon som var mye høyere enn det som ble observert for de andre brønnene på grunn av overtrykk av guanosin pentafosfatbindende protein hpt. I de representative platene viste flere brønner relativt høyere bakgrunnsbindingssignaler som indikert av de relativt sterke indre prikkene som ble observert i mange brønner, samt de konsekvent høye bindende fraksjonene som ble observert etter kvantifisering.Spesielt ga noen mål også variable bindende brøker, for eksempel falske positiver. For å avklare videre brukte forskerne rensede proteiner for å teste bindingen igjen. Når målproteinene er identifisert, kan man rense dem til homogenitet og bekrefte interaksjonsstyrke og spesifisitet ved å bruke enten DRaCALA, isotermisk titreringskalorimetri eller andre metoder.Identifisering av målproteiner av små signalmolekyler baner vei for en grundig forståelse av rollene som kommer fra bakteriell virulens til menneskelig biologi.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay (DRaCALA)

Identification of Small Molecule-binding Proteins in a Native Cellular Environment by Live-cell Photoaffinity Labeling

Identifisering av lite molekyl bindende proteiner i en Native Cellular Miljø via Live-celle Photoaffinity Merking

Identifying the molecular target(s) of small molecules is a challenging but necessary step towards understanding their mechanism of action. While several ...

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Metode for å identifisere lavmolekylære inhibitorer av protein-protein samhandling mellom HCN1 og TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Measuring Biomolecular DSC Profiles with Thermolabile Ligands to Rapidly Characterize Folding and Binding Interactions

Måle Biomolecular DSC profiler med Thermolabile ligander å raskt karakterisere Folding og bindende interaksjoner

Differential scanning calorimetry (DSC) is a powerful technique for quantifying thermodynamic parameters governing biomolecular folding and binding ...

Nitrogen Cavitation and Differential Centrifugation Allows for Monitoring the Distribution of Peripheral Membrane Proteins in Cultured Cells

Nitrogen kavitasjon og differensial sentrifugering tillater overvåking fordelingen av ytre membran proteiner i kulturperler celler

Cultured cells are useful for studying the subcellular distribution of proteins, including peripheral membrane proteins. Genetically encoded fluorescently ...

Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

Rab10 fosforylering gjenkjenning av LRRK2 aktivitet SDS-side med en fosfat-bindende kode

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

Capturing the Interaction Kinetics of an Ion Channel Protein with Small Molecules by the Bio-layer Interferometry Assay

Fange samhandling Kinetics en Ion kanal protein med små molekyler av Bio-lags Interferometry analysen

The bio-layer interferometry (BLI) assay is a valuable tool for measuring protein-protein and protein-small molecule interactions. Here, we first describe ...

Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain

Metode for effektiv Refolding og rensing av Chemoreceptor Ligand bindende domene

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be ...

Detection of Small GTPase Prenylation and GTP Binding Using Membrane Fractionation and  GTPase-linked Immunosorbent Assay

Påvisning av små GTPase Prenylation og GTP bindende ved hjelp av membran fraksjoneres og GTPase-koblede Immunosorbent analysen

The Rho GTPase family belongs to the Ras superfamily and includes approximately 20 members in humans. Rho GTPases are important in the regulation of ...

Analysis of AtHIRD11 Intrinsic Disorder and Binding Towards Metal Ions by Capillary Gel Electrophoresis and Affinity Capillary Electrophoresis

Analyse av AtHIRD11 iboende forstyrrelse og bindende mot metall ioner av kapillær Gel gelelektroforese og affinitet kapillært geleelektroforese

Plants are strongly dependent on their environment. In order to adjust to stressful changes (e.g., drought and high salinity), higher plants evolve ...

A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors

A semi-High-gjennomstrømning tilpasning av NADH-koblet ATPase analysen for screening små molekyl hemmere

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would ...