Name: identifying the binding proteins of small ligands with the differential radial capillary action of ligand assay (dracala)
Uploaded: 2021-03-19T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay DRaCALA at JoVE.com

Работа поддерживается грантом проекта NNF (NNF19OC0058331) для YEZ и исследовательской и инновационной программой Европейского Союза Horizon 2020 в рамках грантового соглашения Марии Склодовской-Кюри (Nº 801199) для MLS.
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62331/62331img1.jpg">

1. Приготовление цельноклеточных лизатов
<ol><li>Инокулируют E. coli K-12 ASKA ORFeome сборные штаммы15 в 1,5 мл лизогенезного бульона (LB), содержащий 25 мкг/мл хлорамфеникола, в 96-скважинных глубоких скважинных пластинах. Расти в течение ночи (O/N) в течение 18 ч при 30 °C с встряхиванием пр?...

<ol>
	<li>Kalia, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleotide,+c-di-GMP,+c-di-AMP,+cGMP,+cAMP,+(p)ppGpp+signaling+in+bacteria+and+implications+in+pathogenesis.">Nucleotide, c-di-GMP, c-di-AMP, cGMP, cAMP, (p)ppGpp signaling in bacteria and implications in pathogenesis.</a> Chemical Society Reviews. 42 (1), 305-341 (2013).</li><li>Camilli, A., Bassler, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+small-molecule+signaling+pathways.">Bacterial small-molecule signaling pathways.</a> Science. 311 (5764), 1113-1116 (2006).</li><li>Luo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cAMP+capture+compound+mass+spectrometry+as+a+novel+tool+for+targeting+cAMP-binding+proteins:+from+protein+kinase+A+to+potassium/sodium+hyperpolarization-activated+cyclic+nucleotide-gated+channels.">The cAMP capture compound mass spectrometry as a novel tool for targeting cAMP-binding proteins: from protein kinase A to potassium/sodium hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channels.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 8 (12), 2843-2856 (2009).</li><li>Nesper, J., Reinders, A., Glatter, T., Schmidt, A., Jenal, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+capture+compound+for+the+identification+and+analysis+of+cyclic+di-GMP+binding+proteins.">A novel capture compound for the identification and analysis of cyclic di-GMP binding proteins.</a> Journal of Proteomics. 75 (15), 4874-4878 (2012).</li><li>Laventie, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capture+compound+mass+spectrometry--a+powerful+tool+to+identify+novel+c-di-GMP+effector+proteins.">Capture compound mass spectrometry--a powerful tool to identify novel c-di-GMP effector proteins.</a> Journal of Visual Experiments. (97), e51404 (2015).</li><li>Roelofs, K. G., Wang, J., Sintim, H. O., Lee, V. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+radial+capillary+action+of+ligand+assay+for+high-throughput+detection+of+protein-metabolite+interactions.">Differential radial capillary action of ligand assay for high-throughput detection of protein-metabolite interactions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (37), 15528-15533 (2011).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+adaptation+of+the+essential+tRNA+methyltransferase+TrmD+to+the+signaling+molecule+3+',5+'-cAMP+in+bacteria.">Evolutionary adaptation of the essential tRNA methyltransferase TrmD to the signaling molecule 3 ',5 '-cAMP in bacteria.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (1), 313-327 (2017).</li><li>Corrigan, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+identification+of+conserved+bacterial+c-di-AMP+receptor+proteins.">Systematic identification of conserved bacterial c-di-AMP receptor proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (22), 9084-9089 (2013).</li><li>Roelofs, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+identification+of+cyclic-di-GMP+binding+proteins+in+Vibrio+cholerae+reveals+a+novel+class+of+cyclic-di-GMP-binding+ATPases+associated+with+type+II+secretion+systems.">Systematic identification of cyclic-di-GMP binding proteins in Vibrio cholerae reveals a novel class of cyclic-di-GMP-binding ATPases associated with type II secretion systems.</a> PLoS Pathogen. 11 (10), 1005232 (2015).</li><li>Fang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GIL,+a+new+c-di-GMP-binding+protein+domain+involved+in+regulation+of+cellulose+synthesis+in+enterobacteria.">GIL, a new c-di-GMP-binding protein domain involved in regulation of cellulose synthesis in enterobacteria.</a> Molecular Microbiology. 93 (3), 439-452 (2014).</li><li>Corrigan, R. M., Bellows, L. E., Wood, A., Grundling, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ppGpp+negatively+impacts+ribosome+assembly+affecting+growth+and+antimicrobial+tolerance+in+Gram-positive+bacteria.">ppGpp negatively impacts ribosome assembly affecting growth and antimicrobial tolerance in Gram-positive bacteria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1710-1719 (2016).</li><li>Zhang, Y., Zbornikova, E., Rejman, D., Gerdes, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+(p)ppGpp+binding+and+metabolizing+proteins+of+Escherichia+coli.">Novel (p)ppGpp binding and metabolizing proteins of Escherichia coli.</a> Mbio. 9 (2), 02188 (2018).</li><li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nucleotide+pGpp+acts+as+a+third+alarmone+in+Bacillus,+with+functions+distinct+from+those+of+(p)+ppGpp.">The nucleotide pGpp acts as a third alarmone in Bacillus, with functions distinct from those of (p) ppGpp.</a> Nature Communications. 11 (1), 5388 (2020).</li><li>Orr, M. W., Lee, V. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+radial+capillary+action+of+ligand+assay+(DRaCALA)+for+high-throughput+detection+of+protein-metabolite+interactions+in+bacteria.">Differential radial capillary action of ligand assay (DRaCALA) for high-throughput detection of protein-metabolite interactions in bacteria.</a> Methods in Molecular Biology. 1535, 25-41 (2017).</li><li>Kitagawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+set+of+ORF+clones+of+Escherichia+coli+ASKA+library+(A+complete+Set+of+E.+coli+K-12+ORF+archive):+Unique+resources+for+biological+research.">Complete set of ORF clones of Escherichia coli ASKA library (A complete Set of E. coli K-12 ORF archive): Unique resources for biological research.</a> DNA Research. 12 (5), 291-299 (2005).</li><li>Hochstadt-Ozer, J., Cashel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+purine+utilization+in+bacteria.+V.+Inhibition+of+purine+phosphoribosyltransferase+activities+and+purine+uptake+in+isolated+membrane+vesicles+by+guanosine+tetraphosphate.">The regulation of purine utilization in bacteria. V. Inhibition of purine phosphoribosyltransferase activities and purine uptake in isolated membrane vesicles by guanosine tetraphosphate.</a> Journal of Biological Chemistry. 247 (21), 7067-7072 (1972).</li><li>Zhang, Y. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p)ppGpp+regulates+a+bacterial+nucleosidase+by+an+allosteric+two-domain+switch.">p)ppGpp regulates a bacterial nucleosidase by an allosteric two-domain switch.</a> Molecular Cell. 74 (6), 1239-1249 (2019).</li><li>Wang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity-based+capture+and+identification+of+protein+effectors+of+the+growth+regulator+ppGpp.">Affinity-based capture and identification of protein effectors of the growth regulator ppGpp.</a> Nature Chemical Biology. 15 (2), 141-150 (2019).</li></ol>

Одним из важнейших шагов в выполнении скрининга DRaCALA является получение хороших целоклеточных лизатов. Во-первых, испытуемые белки должны вырабатываться в больших количествах и в растворимых формах. Во-вторых, лизис клеток должен быть полным, а вязкость лизата должна быть минимальной. ...

Бактерии используют несколько небольших сигнальных молекул для адаптации к постоянно меняющимся средам1,2. Например, аутоиндукруторы, N-ацилгомосериновые лактоны и их модифицированные олигопептиды, опосредовывают межклеточную связь между бактериями для координации поведения популяции, явление, известное как ощущение кворума2. Другой группой малых сигнальных молекул является NSM, включая широко изученный циклический аденозинмонофосфат (цАМФ), циклический ди-АМФ, циклический ди-гуанозинмонофосфат (циклический ди-GMP) и гуанозин пента- и тетрафосфаты (p)ppGpp1. Бактерии производят эти NSM в ответ на множество различных стрессовых состояний. После производства эти молекулы связываются со своими белками-мишенями и регулируют несколько различных физиологических и метаболических путей, чтобы справиться с возникающими стрессами и повысить выживаемость бактерий. Поэтому идентификация белков-мишеней является неизбежной предпосылкой для расшифровки молекулярных функций этих малых молекул.
Последнее десятилетие стало свидетелем бума знаний об этих небольших сигнальных молекулах, в основном благодаря нескольким техническим инновациям, которые раскрыли целевые белки этих малых молекул. К ним относятся метод захвата соединения3,4,5и дифференциальное радиальное капиллярное действие лигандного анализа (DRaCALA)6, которые будут обсуждаться в этой статье.
Изобретенный Винсентом Ли и его коллегами в 2011году 6,DRaCALA использует способность нитроцеллюлозной мембраны дифференциально секвестрировать свободные и связанные с белком лиганды. Молекулы, такие как белки, не могут диффундировать на нитроцеллюлозной мембране, в то время как небольшие лиганды, такие как NSM, способны. Смешивая NSM(например,ppGpp) с тестируемым белком и обличивая их на мембране, можно ожидать двух сценариев(рисунок 1):Если (p)ppGpp связывается с белком, радиомаркированный (p)ppGpp будет удерживаться в центре пятна белком и не будет диффундировать наружу, давая интенсивную маленькую точку(т.е., сильный радиоактивный сигнал) под фосфоритатором. Однако, если (p)ppGpp не связывается с белком, он будет свободно диффундировать наружу, производя большое пятно с однородным фоновым радиоактивным сигналом.
Кроме того, DRaCALA может обнаружить взаимодействие между небольшой молекулой и неочищенным белком в цельном клеточном лизате, если белок присутствует в достаточном количестве. Эта простота позволяет использовать DRaCALA для быстрой идентификации белковых мишеней с помощью библиотеки экспрессии ORFeome. Действительно, целевые белки цАМФ7,циклический ди-АМФ8,циклический ди-GMP9,10и (p)ppGpp11,12,13 были систематически идентифицированы с помощью DRaCALA. В этой видеостатье используется (p)ppGpp в качестве примера для демонстрации и описания критических шагов и соображений при успешном проведении скрининга DRaCALA. Следует отметить, что более подробное описание DRaCALA14 настоятельно рекомендуется прочитать в сочетании с этой статьей перед выполнением DRaCALA.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62331/62331fig01.jpg"> Рисунок 1:Принцип DRaCALA. (A) Схема анализа DRaCALA. Подробности см. в тексте. (B)Количественная оценка и расчет фракции связывания. Подробности см. в тексте. Вкратце, пятна DRaCALA будут проанализированы путем рисования двух кругов, которые ограничивают все пятно и внутреннюю темную точку(т. Е.Сохраненный (p)ppGpp из-за связывания тестируемого белка). Специфическим связывающим сигналом является радиоактивный сигнал внутреннего круга (S1) после вычитания неспецифического фонового сигнала (вычисляется по A1 × ((S2-S1)/(A2-A1))). Фракция связывания представляет специфический сигнал связывания, деленный на общий радиоактивный сигнал (S2). Сокращения: DRaCALA = дифференциальное радиальное капиллярное действие лигандного анализа; (p)ppGpp = гуанозин пента- и тетрафосфаты; RT = комнатная температура. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62331/62331fig01large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>32P-&#945;-GTP</td>
			<td>Perkinelmer</td>
			<td>BLU006X250UC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 x pin tool</td>
			<td>V&#38;P Scientific</td>
			<td>VP 404</td>
			<td>96 Bolt Replicator, on 9 mm centers, 4.2 mm Bolt Diameter, 24 mm long</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well V-bottom microtiter plate</td>
			<td>Sterilin</td>
			<td>MIC9004</td>
			<td>Sterilin Microplate V Well 611V96</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>OXOID - Thermo Fisher</td>
			<td>LP0011</td>
			<td>Agar no. 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ASKA collection strain</td>
			<td>NBRP, SHIGEN, JAPAN</td>
			<td></td>
			<td>Ref: DNA Research, Volume 12, Issue 5, 2005, Pages 291&#8211;299. https://doi.org/10.1093/dnares/dsi012</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>E1014-25KU</td>
			<td>genetically engineered endonuclease from Serratia marcescens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford Protein Assay Dye</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>5000006</td>
			<td>Reagent Concentrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D8418</td>
			<td>&#8805;99.9%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase 1</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>DN25-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gel filtration10x300 column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28990944</td>
			<td>contains 20% ethanol as preservative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>122329.1214</td>
			<td>Glycerol 87% for analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypercassette</td>
			<td>Amersham</td>
			<td>RPN 11647</td>
			<td>20 x 40 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>56750</td>
			<td>puriss. p.a., &#8805; 99.5% (GC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IP Storage Phosphor Screen</td>
			<td>FUJIFILM</td>
			<td>28956474</td>
			<td>BAS-MS 2040 20x 40 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>I6758</td>
			<td>Isopropyl &#946;-D-thiogalactoside</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysogeny Broth (LB)</td>
			<td>Invitrogen - Thermo Fisher</td>
			<td>12795027</td>
			<td>Miller&#39;s LB Broth Base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>L4949</td>
			<td>from chicken egg white; BioUltra, lyophilized powder, &#8805;98%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 (Magnesium chloride)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>208337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliQ water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ultrapure water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multichannel pipette</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>4661110</td>
			<td>F1 - Clip Tip; 1-10 ul, 8 x channels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>27810</td>
			<td>AnalaR NORMAPUR, ACS, Reag. Ph. Eur.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Agarose</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>30230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose Blotting Membrane</td>
			<td>Amersham Protran</td>
			<td>10600003</td>
			<td>Premium 0.45 um 300 mm x 4 m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>OXOID - Thermo Fisher</td>
			<td>BR0014G</td>
			<td>Phosphate buffered saline (Dulbecco A), Tablets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG3350 (Polyethylene glycol 3350)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>202444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>93482</td>
			<td>Phenylmethanesulfonyl fluoride solution - 0.1 M in ethanol (T)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphor-imager</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28955809</td>
			<td>Typhoon FLA-7000 Phosphor-imager</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips, filtered</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>94410040</td>
			<td>ClipTip 12.5 &#956;l nonsterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-Prep Chromatography column</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7311550</td>
			<td>polypropylene chromatography column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor Mini</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>A32955</td>
			<td>Tablets, EDTA-free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>screw cap tube</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3488</td>
			<td>Microcentifuge Tubes, 2.0 ml with screw cap, nonsterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SLS 96-deep Well plates</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>780285</td>
			<td>MASTERBLOCK, 2 ML, PP, V-Bottom, Natural</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spin column</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC500396</td>
			<td>Amicon Ultra -0.5 ml Centrifugal Filters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5382000015</td>
			<td>Thermomixer C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC plate (PEI-cellulose F TLC plates)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>105579</td>
			<td>DC PEI-cellulose F (20 x 20 cm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>BP152</td>
			<td>Tris Base for Molecular Biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P1379</td>
			<td>viscous non-ionic detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>M3148</td>
			<td>99% (GC/titration)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identifying the binding proteins of small ligands with the differential radial capillary action of ligand assay (dracala)

За последнее десятилетие был достигнут огромный прогресс в понимании малых сигнальных молекул в бактериальной физиологии. В частности, целевые белки нескольких вторичных мессенджеров (NSM), полученных из нуклеотидов, были систематически идентифицированы и изучены в модельных организмах. Эти достижения в основном связаны с разработкой нескольких новых методов, включая метод захвата соединений и дифференциальное радиальное капиллярное действие лигандного анализа (DRaCALA), которые использовались для систематической идентификации целевых белков этих малых молекул. В данной работе описывается использование NSM, гуанозин пента- и тетрафосфатов (p)ppGpp, в качестве примера и видеодемонстрации метода DRaCALA. Используя DRaCALA, 9 из 20 известных и 12 новых целевых белков (p)ppGpp были идентифицированы в модельном организме Escherichia coli K-12, демонстрируя силу этого анализа. В принципе, DRaCALA может быть использован для изучения небольших лигандов, которые могут быть помечены радиоактивными изотопами или флуоресцентными красителями. Здесь обсуждаются критические шаги, плюсы и минусы DRaCALA для дальнейшего применения этой техники.

Следование описанному выше протоколу обычно дает два типа результатов(рисунок 3).
На фиг.3А показана пластина с относительно низкими фоновыми сигналами связывания (фракции связывания < 0,025) из большинства скважин. Положительный сигнал связ...

Watch this Scientific Journal Video about Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay DRaCALA at JoVE.com

Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay DRaCALA

Дифференциальное радиальное капиллярное действие лигандного анализа (DRaCALA) может быть использовано для идентификации малых лигандсвязывающих белков организма с помощью библиотеки ORFeome.

Идентификация связывающих белков малых лигандов с дифференциальным радиальным капиллярным действием лигандного анализа (DRaCALA)

The past decade has seen tremendous progress in the understanding of small signaling molecules in bacterial physiology. In particular, the target proteins ...

Небольшие сигнальные молекулы нацелены на различные эффекторные белки для контроля бактериальной вирулентности и биологии человека. Однако эти эффекторные белки сложно идентифицировать. Как инструмент системной биологии, DRaCALA позволяет осуществимую, быструю и высокочувствительную идентификацию неизвестных эффекторных белков с помощью библиотеки OVium.DRaCALA может быть использован для изучения любой небольшой сигнальной молекулы, если она может быть помечена либо радиоактивными изотопами, либо флуоресцентными красителями. Начните с прививки E.coli в 1,5 миллилитра LB, дополненные 25 микрограммами на миллилитр хлорамфеникола в каждой скважине из 96-луночных глубоких плит скважины для ночной инкубации при 30 градусах Цельсия и 160 оборотах в минуту. На следующее утро обработать ночные культуры 500 микромолярной IPTG в течение шести часов при 30 градусах Цельсия, чтобы вызвать экспрессию белка.В конце инкубации гранулируют клетки центрифугированием, удаляют супернатант и замораживают образцы при минус 80 градусах Цельсия. Чтобы начать лизис, повторно суспендируют гранулы в 150 микролитрах буфера лизиса по одному на лунку для 30-минутной инкубации при минус 80 градусах Цельсия перед размораживанием клеток в течение 20 минут при 37 градусах Цельсия. Затем лизат следует хранить при температуре минус 80 градусов по Цельсию перед использованием.Чтобы завершить лизис клеток с переэкспрессованными белками, повторно суспендируют образцы в 40 миллилитрах ледяного холодного лизиса буфер два и обжаривают образцы ультразвуком с амплитудой 60% через две секунды на четыре секунды в течение восьми минут, затем очищают лизаты центрифугированием. Пока образцы центрифугируются, добавьте 500 микролитров гомогенизированной никель-NTA смолы в стоячую полипропиленовую хроматографическую колонку. Через 15 минут промыть осеневшему смолу два раза 15 миллилитрами сверхчистой воды и один раз 15 миллилитрами лизисного буфера дважды.В конце центрифугирования загрузите очищенный лисатный супернатант на колонну. Когда весь лисат пройдет через колонну, промыть колонну 30 миллилитрами промывного буфера. Чтобы элюировать белки, добавьте 400 микролитр объема буфера элюирования в столбец и повторите элюдение три раза.Еще 300 микролитр объема элюированного буфера для повторного элюирования три раза и объединения элюированных белков в конечный объем 700 микролитров. Для гелевой фильтрации элюированного образца после промывки колонны исключения размеров 25 миллилитрами свежеприготовленного гелевого фильтрационного буфера загрузите весь объем элюированного белка на колонку с помощью петли 500 микролитров. Бегите со скоростью 500 микролитров в минуту и соберите две-три объемные доли соответствующих белков по 500 микролитров.Затем используйте отдельные спиновые колонки для концентрации каждого белка и используйте набор для анализа Брэдфорда для измерения концентрации белка в соответствии со стандартными протоколами. Чтобы синтезировать фосфор 32, меченый гуанозинпентафосфатом, соберите мелкомасштабную реакцию Relseq в трубку с винтовой крышкой, как описано в таблице, и инкубируйте реакцию в ThermoMixer в течение одного часа при 37 градусах Цельсия и пяти минут при 95 градусах Цельсия, а затем пять минут на льду. В конце инкубации раскрутите осажденный белок центрифугированием и перенесите синтезированный фосфор 32, меченый гуанозинпентафосфатом, содержащим супернатант, в новую трубку с винтовой крышкой.Для синтеза фосфора 32 гуанозин тетрафосфата добавьте один микромолярный GppA к половине меченого фосфором 32 продукта гуанозинпентафосфата в новой пробирке с крышкой и инкубируем реакцию в течение 10 минут при 37 градусах Цельсия, пяти минут при 95 градусах Цельсия и пяти минут на льду. В конце инкубации раскрутите осадок центрифугированием и перенесите фосфор 32, меченый гуанозинтетрафосфатом, содержащим супернатант, в новую трубку. Чтобы проанализировать выделенные белки-мишени, запустите один микролитр каждого образца на тонкослойной хроматографической пластине, используя 1,5 молярный монокалийфосфат в качестве подвижной фазы.После анализа поместите высушенную пластину в прозрачную пластиковую папку и подвергайте пластину люминофорной области в течение пяти минут, прежде чем визуализировать и количественно оценивать данные на люминофорном изобразователье. Для скрининга DRaCALA белков-мишеней добавьте 20 микролитров размороженных оптовых лизатов в отдельные скважины 95-луночной пластины микротитров V-нижнего дна и добавьте 2,5 единицы эндонуклеазы Serratia marcescens в каждую лунку. Через 15 минут при 37 градусах Цельсия поместите лизаты на лед на 20 минут.Затем смешайте равные объемы фосфора 32, меченого гуанозинпентафосфатом и гуанозинтетрафосфатом, и добавьте 1X буфер лизиса один к смеси для получения четырехномолярного раствора гуанозинпентафосфата. Используя многоканальную пипетку и фильтрованные наконечники пипетки, смешайте 10 микролитров смеси гуанозинпентафосфата с клеточным лизатом для пятиминутной инкубации при комнатной температуре. В конце инкубации промыть инструмент 96X три раза в 0,01% растворе неионного моющего средства в течение 30 секунд, а затем 30 секунд сушки на бумажном полотенце за одну стирку перед помещением штифтового инструмента в 96-скважинную пробоотборную пластину.Через 30 секунд поднимите штифт инструмент прямо вверх и поместите его прямо вниз на нитроцеллюлозную мембрану в течение 30 секунд. После пяти минут сушки поместите нитроцеллюлозную мембрану в прозрачную пластиковую папку для хранения люминофорного экрана и визуализации с помощью люминофорной визуализации, как показано на экране. Чтобы количественно оценить и идентифицировать потенциальные целевые белки, в аналитическом программном обеспечении, связанном с люминофорным изобразителем, откройте гель-файл визуализированных пластин.Чтобы определить точки для анализа, используйте функцию анализа массива, чтобы настроить сетку из 12 столбцов на восемь строк. Чтобы ограничить внешний край пятен отверстий, определите большие круги, экспортируйте объем плюс фон и площадь определенных больших кругов в электронную таблицу. Чтобы ограничить маленькие внутренние точки, размер определенных кругов, экспортируйте объем плюс фон и площадь определенных маленьких кругов и сохраните все данные в электронной таблице.Расположите круги, чтобы перекрыть пятна по мере необходимости, изменая размер немного больше, чем фактические пятна. Используйте уравнение для вычисления связывающих дробей в электронной таблице и построения данных. Затем определите потенциальные связывающие белки в скважинах, которые показывают высокие фракции связывания по сравнению с большинством других скважин.В этом репрезентативном анализе можно наблюдать пластину с относительно низкими фоновыми сигналами связывания в большинстве скважин. Положительный сигнал связывания в скважине H3 показал фракцию связывания, которая была намного выше, чем в других скважинах из-за сверхэкспрессии гуанозинпентафосфатсвязывающего белка Hpt. В репрезентативных пластинах несколько скважин показали относительно более высокие фоновые сигналы связывания, о чем свидетельствуют относительно сильные внутренние точки, наблюдаемые во многих скважинах, а также неизменно высокие фракции связывания, наблюдаемые после количественной оценки.Примечательно, что некоторые мишени также давали переменные фракции связывания, такие как ложные срабатывания. Чтобы прояснить это, исследователи использовали очищенные белки для повторного тестирования связывания. Как только целевые белки идентифицированы, их можно очистить до однородности и подтвердить силу и специфичность взаимодействия с помощью DRaCALA, изотермической титруемой калориметрии или других методов.Идентификация белков-мишеней малых сигнальных молекул прокладывает путь к глубокому пониманию ролей, возникающих из бактериальной вирулентности в биологию человека.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay (DRaCALA)

Identification of Small Molecule-binding Proteins in a Native Cellular Environment by Live-cell Photoaffinity Labeling

Идентификация малая молекула-связывающих белков в нативной клеточной среде с помощью Live-клеток фотоаффинное мечение

Identifying the molecular target(s) of small molecules is a challenging but necessary step towards understanding their mechanism of action. While several ...

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Способ идентификации низкомолекулярных соединений ингибиторов белок-белкового взаимодействия между HCN1 и TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Measuring Biomolecular DSC Profiles with Thermolabile Ligands to Rapidly Characterize Folding and Binding Interactions

Измерения биомолекулярных DSC профили с термолабильных лигандами быстро характеризовать складывания и привязки взаимодействия

Differential scanning calorimetry (DSC) is a powerful technique for quantifying thermodynamic parameters governing biomolecular folding and binding ...

Nitrogen Cavitation and Differential Centrifugation Allows for Monitoring the Distribution of Peripheral Membrane Proteins in Cultured Cells

Кавитация азота и дифференциального центрифугирования позволяет для контроля за распределением периферийных мембранных белков в культивируемых клеток

Cultured cells are useful for studying the subcellular distribution of proteins, including peripheral membrane proteins. Genetically encoded fluorescently ...

Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

Обнаружение Rab10 фосфорилирования LRRK2 деятельностью с помощью SDS-страницы с тегом фосфат привязки

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

Capturing the Interaction Kinetics of an Ion Channel Protein with Small Molecules by the Bio-layer Interferometry Assay

Захват кинетика взаимодействия ионного канала белка с малых молекул в Assay интерферометрии био слоя

The bio-layer interferometry (BLI) assay is a valuable tool for measuring protein-protein and protein-small molecule interactions. Here, we first describe ...

Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain

Метод эффективного складывая и очистки Хеморецепция лигандом привязки домена

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be ...

Detection of Small GTPase Prenylation and GTP Binding Using Membrane Fractionation and  GTPase-linked Immunosorbent Assay

Обнаружение малых ГТФазы Prenylation и GTP привязки с помощью мембраны фракционирования и ГТФазы-Assay иммуносорбента

The Rho GTPase family belongs to the Ras superfamily and includes approximately 20 members in humans. Rho GTPases are important in the regulation of ...

Analysis of AtHIRD11 Intrinsic Disorder and Binding Towards Metal Ions by Capillary Gel Electrophoresis and Affinity Capillary Electrophoresis

Анализ AtHIRD11 внутренние беспорядки и привязки к ионов металлов Капиллярный электрофорез и близость капиллярного электрофореза

Plants are strongly dependent on their environment. In order to adjust to stressful changes (e.g., drought and high salinity), higher plants evolve ...

A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors

Полу-высокой пропускной адаптации NADH-связанных АТПас анализ для скрининга малых ингибиторы молекулы

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would ...