Name: identifying the binding proteins of small ligands with the differential radial capillary action of ligand assay (dracala)
Uploaded: 2021-03-19T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay DRaCALA at JoVE.com

Arbetet stöds av ett NNF-projektbidrag (NNF19OC0058331) till YEZ och Europaparlamentets forsknings- och innovationsprogram Horisont 2020 inom ramen för Marie Skłodowska-Curie-bidragsavtalet (Nº 801199) till MLS.
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62331/62331img1.jpg">

1. Förberedelse av hela celllyssen
<ol><li>Inokulera E. coli K-12 ASKA ORFeomesamlingsstammar 15 till 1,5 mL Lysogeny buljong (LB) som innehåller 25 μg/mL kloramfenikol i 96-brunn djupa brunnsplattor. Odla över natten (O/N) i 18 timmar vid 30 °C med skakningar vid 160 varv/min. Nästa dag, tillsätt isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) (slutlig 0,5 mM) till O/N-kulturerna för att inducera proteinuttryck vid 30 °C i 6 timmar.</li>
	<li>Pelletsceller på 500 x g i...

<ol>
	<li>Kalia, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleotide,+c-di-GMP,+c-di-AMP,+cGMP,+cAMP,+(p)ppGpp+signaling+in+bacteria+and+implications+in+pathogenesis.">Nucleotide, c-di-GMP, c-di-AMP, cGMP, cAMP, (p)ppGpp signaling in bacteria and implications in pathogenesis.</a> Chemical Society Reviews. 42 (1), 305-341 (2013).</li><li>Camilli, A., Bassler, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+small-molecule+signaling+pathways.">Bacterial small-molecule signaling pathways.</a> Science. 311 (5764), 1113-1116 (2006).</li><li>Luo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cAMP+capture+compound+mass+spectrometry+as+a+novel+tool+for+targeting+cAMP-binding+proteins:+from+protein+kinase+A+to+potassium/sodium+hyperpolarization-activated+cyclic+nucleotide-gated+channels.">The cAMP capture compound mass spectrometry as a novel tool for targeting cAMP-binding proteins: from protein kinase A to potassium/sodium hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channels.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 8 (12), 2843-2856 (2009).</li><li>Nesper, J., Reinders, A., Glatter, T., Schmidt, A., Jenal, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+capture+compound+for+the+identification+and+analysis+of+cyclic+di-GMP+binding+proteins.">A novel capture compound for the identification and analysis of cyclic di-GMP binding proteins.</a> Journal of Proteomics. 75 (15), 4874-4878 (2012).</li><li>Laventie, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capture+compound+mass+spectrometry--a+powerful+tool+to+identify+novel+c-di-GMP+effector+proteins.">Capture compound mass spectrometry--a powerful tool to identify novel c-di-GMP effector proteins.</a> Journal of Visual Experiments. (97), e51404 (2015).</li><li>Roelofs, K. G., Wang, J., Sintim, H. O., Lee, V. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+radial+capillary+action+of+ligand+assay+for+high-throughput+detection+of+protein-metabolite+interactions.">Differential radial capillary action of ligand assay for high-throughput detection of protein-metabolite interactions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (37), 15528-15533 (2011).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+adaptation+of+the+essential+tRNA+methyltransferase+TrmD+to+the+signaling+molecule+3+',5+'-cAMP+in+bacteria.">Evolutionary adaptation of the essential tRNA methyltransferase TrmD to the signaling molecule 3 ',5 '-cAMP in bacteria.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (1), 313-327 (2017).</li><li>Corrigan, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+identification+of+conserved+bacterial+c-di-AMP+receptor+proteins.">Systematic identification of conserved bacterial c-di-AMP receptor proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (22), 9084-9089 (2013).</li><li>Roelofs, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+identification+of+cyclic-di-GMP+binding+proteins+in+Vibrio+cholerae+reveals+a+novel+class+of+cyclic-di-GMP-binding+ATPases+associated+with+type+II+secretion+systems.">Systematic identification of cyclic-di-GMP binding proteins in Vibrio cholerae reveals a novel class of cyclic-di-GMP-binding ATPases associated with type II secretion systems.</a> PLoS Pathogen. 11 (10), 1005232 (2015).</li><li>Fang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GIL,+a+new+c-di-GMP-binding+protein+domain+involved+in+regulation+of+cellulose+synthesis+in+enterobacteria.">GIL, a new c-di-GMP-binding protein domain involved in regulation of cellulose synthesis in enterobacteria.</a> Molecular Microbiology. 93 (3), 439-452 (2014).</li><li>Corrigan, R. M., Bellows, L. E., Wood, A., Grundling, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ppGpp+negatively+impacts+ribosome+assembly+affecting+growth+and+antimicrobial+tolerance+in+Gram-positive+bacteria.">ppGpp negatively impacts ribosome assembly affecting growth and antimicrobial tolerance in Gram-positive bacteria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1710-1719 (2016).</li><li>Zhang, Y., Zbornikova, E., Rejman, D., Gerdes, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+(p)ppGpp+binding+and+metabolizing+proteins+of+Escherichia+coli.">Novel (p)ppGpp binding and metabolizing proteins of Escherichia coli.</a> Mbio. 9 (2), 02188 (2018).</li><li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nucleotide+pGpp+acts+as+a+third+alarmone+in+Bacillus,+with+functions+distinct+from+those+of+(p)+ppGpp.">The nucleotide pGpp acts as a third alarmone in Bacillus, with functions distinct from those of (p) ppGpp.</a> Nature Communications. 11 (1), 5388 (2020).</li><li>Orr, M. W., Lee, V. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+radial+capillary+action+of+ligand+assay+(DRaCALA)+for+high-throughput+detection+of+protein-metabolite+interactions+in+bacteria.">Differential radial capillary action of ligand assay (DRaCALA) for high-throughput detection of protein-metabolite interactions in bacteria.</a> Methods in Molecular Biology. 1535, 25-41 (2017).</li><li>Kitagawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+set+of+ORF+clones+of+Escherichia+coli+ASKA+library+(A+complete+Set+of+E.+coli+K-12+ORF+archive):+Unique+resources+for+biological+research.">Complete set of ORF clones of Escherichia coli ASKA library (A complete Set of E. coli K-12 ORF archive): Unique resources for biological research.</a> DNA Research. 12 (5), 291-299 (2005).</li><li>Hochstadt-Ozer, J., Cashel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+purine+utilization+in+bacteria.+V.+Inhibition+of+purine+phosphoribosyltransferase+activities+and+purine+uptake+in+isolated+membrane+vesicles+by+guanosine+tetraphosphate.">The regulation of purine utilization in bacteria. V. Inhibition of purine phosphoribosyltransferase activities and purine uptake in isolated membrane vesicles by guanosine tetraphosphate.</a> Journal of Biological Chemistry. 247 (21), 7067-7072 (1972).</li><li>Zhang, Y. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p)ppGpp+regulates+a+bacterial+nucleosidase+by+an+allosteric+two-domain+switch.">p)ppGpp regulates a bacterial nucleosidase by an allosteric two-domain switch.</a> Molecular Cell. 74 (6), 1239-1249 (2019).</li><li>Wang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity-based+capture+and+identification+of+protein+effectors+of+the+growth+regulator+ppGpp.">Affinity-based capture and identification of protein effectors of the growth regulator ppGpp.</a> Nature Chemical Biology. 15 (2), 141-150 (2019).</li></ol>

Ett av de kritiska stegen för att utföra DRaCALA-screening är att få bra hela celllyssningar. För det första bör de testade proteinerna produceras i stora mängder och i lösliga former. För det andra bör lyset av celler vara komplett, och lysatets viskositet måste vara minimal. Införandet av lysozyme och användningen av tre cykler av frys-tina är ofta tillräckligt för att lysa celler helt. Det frisläppta kromosomala DNA:t gör dock lysatet trögflytande och genererar hög bakgrundsbindningssignal, vilket...

Bakterier använder flera små signalmolekyler för att anpassa sig till ständigt föränderligamiljöer 1,2. Till exempel förmedlar autoinducerarna, N-aylhomoserine lactones och deras modifierade oligopeptider, den intercellulära kommunikationen mellan bakterier för att samordna befolkningsbeteendet, ett fenomen som kallas kvorumavkänning2. En annan grupp små signalmolekyler är NSMs, inklusive det allmänt studerade cykliska adenosinmonofoforfat (cAMP), cykliska di-AMP, cykliska di-guanosinmonofosfat (cyklisk di-GMP) och guanosinpenta- och tetrafosfater (p)ppGpp1. Bakterier producerar dessa NSMs som ett svar på en mängd olika stressförhållanden. När dessa molekyler har producerats binder de till sina målproteiner och reglerar flera olika fysiologiska och metaboliska vägar för att hantera de påträffade påfrestningarna och förbättra bakteriell överlevnad. Därför är identifiering av målproteinerna en oundviklig förutsättning för dechiffrering av de molekylära funktionerna hos dessa små molekyler.
Det senaste decenniet har bevittnat en boom av kunskap om dessa små signalmolekyler, främst på grund av flera tekniska innovationer som avslöjade målproteinerna i dessa små molekyler. Dessa inkluderar fångst sammansatt teknik3,4,5, och differential radiell kapillär åtgärd av ligand assay (DRaCALA)6 som ska diskuteras i detta dokument.
DRaCALA uppfanns av Vincent Lee och medarbetare 20116och använder förmågan hos ett nitrocellulosamembran att differentiellt binda fria och proteinbundna ligander. Molekyler som proteiner kan inte spridas på ett nitrocellulosamembran, medan små ligander, såsom NSMs, kan. Genom att blanda NSM(t.ex.ppGpp) med det protein som ska testas och upptäcka dem på membranet kan två scenarier förväntas (Figur 1): Om (p)ppGpp binder till proteinet, kommer den radiomärkta (p)ppGpp att behållas i mitten av platsen av proteinet och kommer inte att spridas utåt, vilket ger en intensiv liten prick (dvs. stark radioaktiv signal) under en fosforimager. Men om (p)ppGpp inte binder till proteinet, kommer det att sprida sig fritt utåt för att producera en stor plats med enhetlig bakgrunds radioaktiv signal.
Dessutom kan DRaCALA upptäcka interaktionen mellan en liten molekyl och ett opurifierat protein i ett helt celllyat om proteinet finns i tillräcklig mängd. Denna enkelhet gör det möjligt att använda DRaCALA för att snabbt identifiera proteinmål med hjälp av ett ORFeome-uttrycksbibliotek. Målproteiner i cAMP7,cykliska di-AMP8,cykliska di-GMP9,10och (p)ppGpp11,12,13 harsystematiskt identifierats med hjälp av DRaCALA. Den här videoartikeln använder (p)ppGpp som ett exempel för att demonstrera och beskriva de kritiska stegen och övervägandena vid en framgångsrik DRaCALA-screening. Observera att en mer grundlig beskrivning av DRaCALA14 rekommenderas starkt att läsa i kombination med den här artikeln innan du utför DRaCALA.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62331/62331fig01.jpg"> Figur 1: Principen om DRaCALA. (A) Schematisk av DRaCALA-analysen. Mer information finns i texten. B)Kvantifiering och beräkning av den bindande fraktionen. Mer information finns i texten. Kortfattat kommer DRaCALA-fläckarna att analyseras genom att rita två cirklar som omskär hela punkten och den inre mörka punkten (dvs. denbibehållna (p)ppGpp på grund av bindningen av det testade proteinet). Den specifika bindningssignalen är den radioaktiva signalen i den inre cirkeln (S1) efter subtrahering av den icke-specifika bakgrundssignalen (beräknadmed A 1 × ((S 2 -S 1)/(A 2 -A 1)).The specific binding signal is the radioactive signal of the inner circle (S1) after subtracting the non-specific background signal (calculated by A 1 × ((S2-S1)/(A2-A1))). Bindningsfraktionen är den specifika bindningssignalen dividerad med den totala radioaktiva signalen (S2). Förkortningar: DRaCALA = Ligand Assays differentiella radiella kapillärverk; p)ppGpp = guanosinpenta- och tetrafosfater. RT = rumstemperatur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62331/62331fig01large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>32P-&#945;-GTP</td>
			<td>Perkinelmer</td>
			<td>BLU006X250UC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 x pin tool</td>
			<td>V&#38;P Scientific</td>
			<td>VP 404</td>
			<td>96 Bolt Replicator, on 9 mm centers, 4.2 mm Bolt Diameter, 24 mm long</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well V-bottom microtiter plate</td>
			<td>Sterilin</td>
			<td>MIC9004</td>
			<td>Sterilin Microplate V Well 611V96</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>OXOID - Thermo Fisher</td>
			<td>LP0011</td>
			<td>Agar no. 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ASKA collection strain</td>
			<td>NBRP, SHIGEN, JAPAN</td>
			<td></td>
			<td>Ref: DNA Research, Volume 12, Issue 5, 2005, Pages 291&#8211;299. https://doi.org/10.1093/dnares/dsi012</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>E1014-25KU</td>
			<td>genetically engineered endonuclease from Serratia marcescens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford Protein Assay Dye</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>5000006</td>
			<td>Reagent Concentrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D8418</td>
			<td>&#8805;99.9%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase 1</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>DN25-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gel filtration10x300 column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28990944</td>
			<td>contains 20% ethanol as preservative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>122329.1214</td>
			<td>Glycerol 87% for analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypercassette</td>
			<td>Amersham</td>
			<td>RPN 11647</td>
			<td>20 x 40 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>56750</td>
			<td>puriss. p.a., &#8805; 99.5% (GC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IP Storage Phosphor Screen</td>
			<td>FUJIFILM</td>
			<td>28956474</td>
			<td>BAS-MS 2040 20x 40 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>I6758</td>
			<td>Isopropyl &#946;-D-thiogalactoside</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysogeny Broth (LB)</td>
			<td>Invitrogen - Thermo Fisher</td>
			<td>12795027</td>
			<td>Miller&#39;s LB Broth Base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>L4949</td>
			<td>from chicken egg white; BioUltra, lyophilized powder, &#8805;98%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 (Magnesium chloride)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>208337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliQ water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ultrapure water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multichannel pipette</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>4661110</td>
			<td>F1 - Clip Tip; 1-10 ul, 8 x channels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>27810</td>
			<td>AnalaR NORMAPUR, ACS, Reag. Ph. Eur.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Agarose</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>30230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose Blotting Membrane</td>
			<td>Amersham Protran</td>
			<td>10600003</td>
			<td>Premium 0.45 um 300 mm x 4 m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>OXOID - Thermo Fisher</td>
			<td>BR0014G</td>
			<td>Phosphate buffered saline (Dulbecco A), Tablets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG3350 (Polyethylene glycol 3350)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>202444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>93482</td>
			<td>Phenylmethanesulfonyl fluoride solution - 0.1 M in ethanol (T)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphor-imager</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28955809</td>
			<td>Typhoon FLA-7000 Phosphor-imager</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips, filtered</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>94410040</td>
			<td>ClipTip 12.5 &#956;l nonsterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-Prep Chromatography column</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7311550</td>
			<td>polypropylene chromatography column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor Mini</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>A32955</td>
			<td>Tablets, EDTA-free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>screw cap tube</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3488</td>
			<td>Microcentifuge Tubes, 2.0 ml with screw cap, nonsterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SLS 96-deep Well plates</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>780285</td>
			<td>MASTERBLOCK, 2 ML, PP, V-Bottom, Natural</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spin column</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC500396</td>
			<td>Amicon Ultra -0.5 ml Centrifugal Filters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5382000015</td>
			<td>Thermomixer C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC plate (PEI-cellulose F TLC plates)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>105579</td>
			<td>DC PEI-cellulose F (20 x 20 cm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>BP152</td>
			<td>Tris Base for Molecular Biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P1379</td>
			<td>viscous non-ionic detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>M3148</td>
			<td>99% (GC/titration)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identifying the binding proteins of small ligands with the differential radial capillary action of ligand assay (dracala)

Under det senaste decenniet har man sett enorma framsteg i förståelsen av små signalmolekyler i bakteriefysiologi. I synnerhet har målproteinerna hos flera nukleotidbaserade sekundära budbärare (NSMs) systematiskt identifierats och studerats i modellorganismer. Dessa prestationer beror främst på utvecklingen av flera nya tekniker inklusive fångst compound teknik och differential radiell kapillär verkan av ligand assay (DRaCALA), som användes för att systematiskt identifiera målproteiner av dessa små molekyler. Detta dokument beskriver användningen av NSMs, guanosin penta- och tetrafosfater (p)ppGpp, som ett exempel och video demonstration av DRaCALA tekniken. Med hjälp av DRaCALA identifierades 9 av 20 kända och 12 nya målproteiner av (p)ppGpp i modellorganismen, Escherichia coli K-12, vilket visar kraften i denna analys. I princip kan DRaCALA användas för att studera små ligands som kan märkas med radioaktiva isotoper eller fluorescerande färgämnen. De kritiska stegen, fördelarna och nackdelarna med DRaCALA diskuteras här för vidare tillämpning av denna teknik.

Enligt ovannämnda protokoll kommer vanligtvis att ge två typer av resultat (figur 3).
Figur 3A visar en platta med relativt låga bakgrundsbindningssignaler (bindningsfraktioner < 0,025) från de flesta brunnar. Den positiva bindningssignalen från brunnen H3 ger en bindande fraktion på ~ 0,35 som är mycket högre än den som observerats för de andra brunnarna. Även utan kvantifiering är H3 anmärkningsvärt, vilket tyder på a...

Watch this Scientific Journal Video about Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay DRaCALA at JoVE.com

Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay DRaCALA

Ligand Assays (DRaCALA) differentialradiella kapillärverkan (DRaCALA) kan användas för att identifiera små ligandbindande proteiner från en organism med hjälp av ett ORFeome-bibliotek.

Identifiera de bindande proteinerna i små ligands med ligands differentialradiella kapillärverkan (DRaCALA)

The past decade has seen tremendous progress in the understanding of small signaling molecules in bacterial physiology. In particular, the target proteins ...

Små signalmolekyler riktar sig till olika effektorproteiner för att kontrollera bakteriell virulens och mänsklig biologi. Dessa effectorproteiner är dock utmanande att identifiera. Som systembiologiverktyg möjliggör DRaCALA en genomförbar, snabb och mycket känslig identifiering av de okända effektorproteinerna med hjälp av ett OVium-bibliotek.DRaCALA kan användas för att studera vilken liten signalmolekyl som helst så länge den kan märkas med antingen radioaktiv isotop eller fluorescerande färgämnen. Börja med att inokulera E.coli i 1,5 milliliter LB kompletterat med 25 mikrogram per milliliter kloramfenikol i varje brunn på 96-brunnsdjupa brunnsplattor för en inkubation över natten vid 30 grader Celsius och 160 rotationer per minut. Nästa morgon, behandla över natten kulturer med 500 mikromolar IPTG i sex timmar vid 30 grader Celsius för att inducera proteinuttryck.I slutet av inkubationen pelleterar cellerna genom centrifugering, tar bort supernatanten och fryser proverna vid minus 80 grader Celsius. För att initiera lys, återanvänd pelletsen i 150 mikroliter lysbuffert en per brunn för en 30-minuters inkubation vid minus 80 grader Celsius innan cellerna tinas i 20 minuter vid 37 grader Celsius. Lysatet ska sedan förvaras vid minus 80 grader Celsius före användning.För att slutföra lyset av celler med överuttryckta proteiner, återanvänd proverna i 40 milliliter iskyla lysbuffert två och sonifiera proverna med en 60%amplitud med två sekunder på fyra sekunder av i åtta minuter och rensa sedan lysen genom centrifugation. Medan proverna centrifugeras, tillsätt 500 mikroliter homogeniserat nickel-NTA-harts till en stående polypropylenkromatografikolonn. Efter 15 minuter tvättar du det sedimenterbara hartset två gånger med 15 milliliter ultrapurvatten och en gång med 15 milliliter lysbuffert två.I slutet av centrifugationen, ladda den rensade lysate supernaten på kolonnen. När allt lysat har flödat genom kolonnen, tvätta kolonnen med 30 milliliter tvättbuffert. För att eluera proteinerna, tillsätt 400 mikrolitervolym elueringsbuffert till kolonnen och upprepa eluering tre gånger.Ytterligare 300 mikrolitervolym av elueringsbufferten för att upprepa eluering tre gånger och kombinera de eluterade proteinerna i en slutlig volym på 700 mikroliter. För gelfiltrering av det eluterade provet, efter att ha tvättat en storleksuteslutningskolonn med 25 milliliter nyberedd gelfiltreringsbuffert, ladda hela volymen eluterat protein på kolonnen med hjälp av en 500 mikroliterslinga. Kör med 500 mikroliter per minut och samla två till tre 500 mikrolitervolymfraktioner av respektive proteiner.Använd sedan enskilda spinnpelare för att koncentrera varje protein och använd Bradford-analyssatsen för att mäta proteinkoncentrationerna enligt standardprotokoll. För att syntetisera fosforn 32 märkt guanosinpentafosfat, montera en småskalig Relseq-reaktion i ett skruvbesatt rör enligt tabellen och inkubera reaktionen i en ThermoMixer i en timme vid 37 grader Celsius och fem minuter vid 95 grader Celsius, följt av fem minuter på is. I slutet av inkubationerna, snurra ner det fällda proteinet genom centrifugering och överför den syntetiserade fosforn 32 märkt guanosinpentafosfat som innehåller supernatant till ett nytt skruvbesatt rör.För fosfor 32 guanosintetrafosfatsyntes, tillsätt en mikromolär GppA till hälften av fosforn 32 märkt guanosinpentafosfatprodukt i ett nytt skruvbegränsat rör och inkubera reaktionen i 10 minuter vid 37 grader Celsius, fem minuter vid 95 grader Celsius och fem minuter på is. I slutet av inkubationen, snurra ner fällningen genom centrifugering och överför fosforn 32 märkt guanosintetrafosfat som innehåller supernatant till ett nytt rör. För att analysera de isolerade målproteinerna, kör en mikroliter av varje prov på en tunn lagerkromatografiplatta med 1,5 molar monopotassiumfosfat som mobilfas.Efter analysen placerar du den torkade plattan i en genomskinlig plastmapp och utsätter plattan för en lagringsfosforskärm i fem minuter innan du visualiserar och kvantifierar data på en fosforbildare. För DRaCALA screening av målproteiner, tillsätt 20 mikroliter av de tinade grossistlysen till enskilda brunnar av en 95-brunn V-botten microtiter platta och tillsätt 2,5 enheter Serratia marcescens endonuclease till varje brunn. Efter 15 minuter vid 37 grader Celsius, placera lysen på is i 20 minuter.Blanda sedan lika stora mängder fosfor 32 märkt guanosinpentafosfat och guanosintetrafosfat och tillsätt 1X lysisbuffert ett till blandningen för att erhålla en fyra nanomolar guanosinpentafosfatlösning. Använd en flerkanalspipett och filtrerade pipettspetsar och blanda 10 mikroliter guanosinpentafosfatblandningen med celllysatet för en fem minuters inkubation vid rumstemperatur. I slutet av inkubationen, tvätta ett 96X stiftverktyg tre gånger i en 0,01%-lösning av icke-joniskt rengöringsmedel i 30 sekunder, följt av 30 sekunders torkning på en pappershandduk per tvätt innan du placerar stiftverktyget i 96-brunnsprovplattan.Efter 30 sekunder lyfter du stiftverktyget rakt upp och placerar det rakt ner på ett nitrocellulosamembran i 30 sekunder. Efter fem minuters torkning, placera nitrocellulosamembranet i en genomskinlig plastmapp för lagring av fosforskärmexponering och visualisering genom fosforavbildning som visats. För att kvantifiera och identifiera potentiella målproteiner, i analysprogramvaran som är associerad med fosforbildaren, öppna gelfilen för de visualiserade plattorna.Om du vill definiera de fläckar som ska analyseras använder du matrisanalysfunktionen för att ställa in en 12-kolumn med åtta radrutnät. Om du vill begränsa hålfläckens ytterkant definierar du stora cirklar, exporterar volymen plus bakgrunden och området i de definierade stora cirklarna till ett kalkylblad. Om du vill begränsa de små inre punkterna, storleksändra de definierade cirklarna exporterar du volymen plus bakgrund och område i de definierade små cirklarna och sparar alla data i kalkylbladet.Placera cirklar för att överlappa fläckar vid behov och storleksändring av de något större än faktiska fläckarna. Använd ekvationen för att beräkna bindningsfraktionerna i kalkylbladet och rita data. Identifiera sedan de potentiella bindningsproteinerna i brunnarna som visar höga bindande fraktioner jämfört med de flesta andra brunnar.I denna representativa analys kan en platta med relativt låga bakgrundsbindningssignaler i de flesta brunnar observeras. Den positiva bindningssignalen i brunn H3 uppvisade en bindande fraktion som var mycket högre än den som observerades för de andra brunnarna på grund av överuttryck av guanosinpentafosfatbindningsproteinet Hpt. I de representativa plattorna visade flera brunnar en relativt högre bakgrundsbindningssignaler som indikeras av de relativt starka inre prickarna som observerats i många brunnar, liksom de konsekvent höga bindande fraktionerna som observerades efter kvantifiering.I synnerhet gav vissa mål också variabla bindande fraktioner, till exempel de falska positiva. För att förtydliga ytterligare använde forskarna renade proteiner för att testa bindningen igen. När målproteinerna har identifierats kan man rena dem till homogenitet och bekräfta interaktionens styrka och specificitet genom att använda antingen DRaCALA, isotermisk titreringsvärme eller andra metoder.Att identifiera målproteinerna hos små signalmolekyler banar väg för en djupgående förståelse av de roller som uppstår från bakteriell virulens till mänsklig biologi.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay (DRaCALA)

Identification of Small Molecule-binding Proteins in a Native Cellular Environment by Live-cell Photoaffinity Labeling

Identifiering av liten molekyl-bindande proteiner i en Native Cellular miljö med Live-cell fotoaffinitetsmärkning

Identifying the molecular target(s) of small molecules is a challenging but necessary step towards understanding their mechanism of action. While several ...

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Metod för att identifiera små molekylhämmare av protein-proteininteraktion Mellan HCN1 och TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Measuring Biomolecular DSC Profiles with Thermolabile Ligands to Rapidly Characterize Folding and Binding Interactions

Mäta Biomolekylär DSC profiler med termolabila ligander till snabbt karakterisera vikning och bindande interaktioner

Differential scanning calorimetry (DSC) is a powerful technique for quantifying thermodynamic parameters governing biomolecular folding and binding ...

Nitrogen Cavitation and Differential Centrifugation Allows for Monitoring the Distribution of Peripheral Membrane Proteins in Cultured Cells

Kväve kavitation och differentiell centrifugering tillåter övervakning fördelningen av perifera membranproteiner på odlade celler

Cultured cells are useful for studying the subcellular distribution of proteins, including peripheral membrane proteins. Genetically encoded fluorescently ...

Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

Rab10 fosforylering detektion av LRRK2 aktivitet med SDS-PAGE med en fosfat-bindande tagg

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

Capturing the Interaction Kinetics of an Ion Channel Protein with Small Molecules by the Bio-layer Interferometry Assay

Fånga interaktion kineticsen av en jonkanal Protein med små molekyler av Bio-lager interferometri analysen

The bio-layer interferometry (BLI) assay is a valuable tool for measuring protein-protein and protein-small molecule interactions. Here, we first describe ...

Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain

Metod för effektiv vika och rening av Chemoreceptor Ligand bindande domän

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be ...

Detection of Small GTPase Prenylation and GTP Binding Using Membrane Fractionation and  GTPase-linked Immunosorbent Assay

Upptäckt av små GTPase Prenylation och GTP bindande använder membran fraktionering och GTPase-linked Immunosorbent Assay

The Rho GTPase family belongs to the Ras superfamily and includes approximately 20 members in humans. Rho GTPases are important in the regulation of ...

Analysis of AtHIRD11 Intrinsic Disorder and Binding Towards Metal Ions by Capillary Gel Electrophoresis and Affinity Capillary Electrophoresis

Analys av AtHIRD11 inneboende sjukdom och bindande mot metalljoner genom kapillär gelelektrofores och affinitet kapillärelektrofores

Plants are strongly dependent on their environment. In order to adjust to stressful changes (e.g., drought and high salinity), higher plants evolve ...

A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors

En semi-High-genomströmning anpassning av NADH-kopplad ATPas-analys för screening av småmolekylära hämmare

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would ...