Name: isolating brown adipocytes from murine interscapular brown adipose tissue for gene and protein expression analysis
Uploaded: 2021-03-12T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolating Brown Adipocytes from Murine Interscapular Brown Adipose Tissue for Gene and Protein Expression Analysis at JoVE.com

تم دعم Z. Lin من قبل المعاهد الوطنية للصحة HL138454-01 وصناديق معهد البحوث الطبية الماسونية.

تم الحفاظ على جميع الفئران في ظروف خالية من مسببات الأمراض ، وتمت الموافقة على جميع الإجراءات من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسية للبحوث الطبية الماسونية (IACUC). UCP1::Cre9 و Rosa 26tdتم الإبلاغ عن خطوط الفئران13 سابقا. تم الاحتفاظ بجميع الفئران في درجة حرارة ا...

<ol>
	<li>Zwick, R. K., Guerrero-Juarez, C. F., Horsley, V., Plikus, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomical,+physiological,+and+functional+diversity+of+adipose+tissue.">Anatomical, physiological, and functional diversity of adipose tissue.</a> Cell Metabolism. 27, 68-83 (2018).</li><li>Symonds, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brown+adipose+tissue+growth+and+development.">Brown adipose tissue growth and development.</a> Scientifica. 2013, 305763 (2013).</li><li>Giralt, M., Villarroya, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=White,+brown,+beige/brite:+Different+adipose+cells+for+different+functions.">White, brown, beige/brite: Different adipose cells for different functions.</a> Endocrinology. 154, 2992-3000 (2013).</li><li>Cannon, B., Nedergaard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brown+adipose+tissue:+function+and+physiological+significance.">Brown adipose tissue: function and physiological significance.</a> Physiological Reviews. 84, 277-359 (2004).</li><li>Cinti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adipose+organ.">The adipose organ.</a> Prostaglandins, Leukotrienes and Essential Fatty Acids. 73, 9-15 (2005).</li><li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beige+adipocytes+are+a+distinct+type+of+thermogenic+fat+cell+in+mouse+and+human.">Beige adipocytes are a distinct type of thermogenic fat cell in mouse and human.</a> Cell. 150, 366-376 (2012).</li><li>Cypess, A. M., Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brown+fat+as+a+therapy+for+obesity+and+diabetes.">Brown fat as a therapy for obesity and diabetes.</a> Current Opinion in Endocrinology, Diabetes and Obesity. 17, 143-149 (2010).</li><li>Schoettl, T., Fischer, I. P., Ussar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+adipose+tissue+in+development+and+metabolic+function.">Heterogeneity of adipose tissue in development and metabolic function.</a> Journal of Experimental Biology. 221, (2018).</li><li>Kong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IRF4+is+a+key+thermogenic+transcriptional+partner+of+PGC-1&#945;.">IRF4 is a key thermogenic transcriptional partner of PGC-1&#945;.</a> Cell. 158, 69-83 (2014).</li><li>Lee, Y. H., Petkova, A. P., Konkar, A. A., Granneman, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+origins+of+cold-induced+brown+adipocytes+in+adult+mice.">Cellular origins of cold-induced brown adipocytes in adult mice.</a> The FASEB Journal. 29, 286-299 (2015).</li><li>Kim, W. -. S., Park, H. -. S., Sung, J. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pivotal+role+of+PDGF+and+its+receptor+isoforms+in+adipose-derived+stem+cells.">The pivotal role of PDGF and its receptor isoforms in adipose-derived stem cells.</a> Histology and Histopathology. 30 (7), 793-799 (2015).</li><li>Hagberg, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+of+mouse+and+human+adipocytes+for+the+analysis+of+browning+and+cellular+heterogeneity.">Flow cytometry of mouse and human adipocytes for the analysis of browning and cellular heterogeneity.</a> Cell Report. 24, 2746-2756 (2018).</li><li>Madisen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+and+high-throughput+Cre+reporting+and+characterization+system+for+the+whole+mouse+brain.">A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain.</a> Nature Neuroscience. 13, 133-140 (2010).</li><li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid.">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Analytical biochemistry. 150, 76-85 (1985).</li><li>Chey, S., Claus, C., Liebert, U. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+method+for+simultaneous+isolation+of+proteins+and+nucleic+acids.">Improved method for simultaneous isolation of proteins and nucleic acids.</a> Analytical Biochemistry. 411, 164-166 (2011).</li><li>Ford, T., Graham, J., Rickwood, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iodixanol:+A+nonionic+iso-osmotic+centrifugation+medium+for+the+formation+of+self-generated+gradients.">Iodixanol: A nonionic iso-osmotic centrifugation medium for the formation of self-generated gradients.</a> Analytical Biochemistry. 220, 360-366 (1994).</li><li>Kovacovicova, K., Vinciguerra, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+senescent+cells+by+iodixanol+(OptiPrep)+density+gradient-based+separation.">Isolation of senescent cells by iodixanol (OptiPrep) density gradient-based separation.</a> Cell Proliferation. 52, 12674 (2019).</li><li>Lock, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=versatile+manufacturing+of+recombinant+adeno-associated+viral+vectors+at+scale.">versatile manufacturing of recombinant adeno-associated viral vectors at scale.</a> Human Gene Therapy. 21, 1259-1271 (2010).</li><li>Marin, R. D., Crespo-Garcia, S., Wilson, A. M., Sapieha, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RELi+protocol:+Optimization+for+protein+extraction+from+white,+brown,+and+beige+adipose+tissues.">RELi protocol: Optimization for protein extraction from white, brown, and beige adipose tissues.</a> MethodsX. 6, 918-928 (2019).</li><li>Sonna, L. A., Fujita, J., Gaffin, S. L., Lilly, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invited+Review:+effects+of+heat+and+cold+stress+on+mammalian+gene+expression.">Invited Review: effects of heat and cold stress on mammalian gene expression.</a> Journal of Applied Physiology. 92, 1725-1742 (2002).</li><li>Gensch, N., Borchardt, T., Schneider, A., Riethmacher, D., Braun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+autonomous+myogenic+cell+populations+revealed+by+ablation+of+Myf5-expressing+cells+during+mouse+embryogenesis.">Different autonomous myogenic cell populations revealed by ablation of Myf5-expressing cells during mouse embryogenesis.</a> Development. 135, 1597-1604 (2008).</li></ol>

في هذه الدراسة ، تم تطوير طريقة جديدة لعزل BAs لتحليل التعبير الجيني والبروتيني.
في بروتوكول عزل BAs المنشور ، تم استخدام محلول BSA بنسبة 3٪ لإثراء BAs12. ومع ذلك ، لا يمكن استخدام BAs المخصبة التي حققها هذا البروتوكول المنشور مباشرة لتحليل تعبير البروتين. وذلك لأن BSA الم...

لدى كل من الفئران والبشر نوعان من الأنسجة الدهنية: الأنسجة الدهنية البيضاء (WAT) والأنسجة الدهنية البنية (BAT)1. يخزن WAT الطاقة في شكل دهون ثلاثية في الخلايا الشحمية البيضاء ، وتبدد الخلايا الشحمية البنية (BAs) من BAT الطاقة الكيميائية كحرارة2. بناء على أصلها التنموي ، يتم تصنيف BAs بشكل أكبر إلى BAs الكلاسيكية (cBAs) التي تشكلت أثناء نمو الجنين والخلايا الشحمية البيضاء المشتقة من BAs (خلايا بيج / برايت ، محولة من الخلايا الشحمية البيضاء في ظل ظروف الإجهاد)3. بتكون متعددة العينات، وتعبر عن البروتين الحراري الذي يفصل البروتين 1 (UCP1)4. يعد مستودع BAT بين الكتفين (iBAT) أحد مستودعات cBAs الأولية في الثدييات الصغيرة5 ، بينما تنتشر الخلايا البيج داخل WAT6. 
نظرا لطبيعتها في تبديد الطاقة ، حظيت BAs باهتمام كبير كهدف علاجي للحد من السمنة7. لاستغلال BAs لغرض علاج السمنة ، من الضروري فهم الآليات الجزيئية التي تتحكم في وظيفة BAs وبقائها وتجنيدها. الأنسجة الدهنية بما في ذلك BAT و WAT غير متجانسة. باستثناء الخلايا الشحمية ، تحتوي الأنسجة الدهنية على العديد من أنواع الخلايا الأخرى ، مثل الخلايا البطانية والخلايا الجذعية الوسيطة والبلاعم8. على الرغم من توفر الأدوات الجينية لاستنفاد الجينات المرشحة على وجه التحديد في الفئران BAs ، مثل UCP1::Cre line9 ، فإن تقنيات تنقية BAs من BAT أو WAT محدودة ، مما يجعل من الصعب دراسة BAs على مستوى نوع الخلية الواحدة. بالإضافة إلى ذلك ، بدون الحصول على BAs خالصة ، لن يتم تحديد العلاقة بين BAs وغير BAs بوضوح. على سبيل المثال ، تم استخدام مستقبلات عامل النمو المشتق من الصفائح الدموية ألفا (PDGFRα) كعلامة لخلايا اللحمة المتوسطة غير المتمايزة ، ويتم التعبير عنها في الخلايا البطانية والخلالية ل BAT. في BAT المجهدة الباردة ، تؤدي الخلايا السلفية الإيجابية PDGFRα إلى ظهور BAs10 جديدة. يتم تنشيط PDGFRα بواسطة ليجند PDGF ، وهو عامل نمو ينظم نمو وتكاثر خلايا اللحمة المتوسطة11 ؛ ومع ذلك ، فمن غير الواضح ما إذا كانت BAs تؤثر على سلوك الخلايا السلفية الإيجابية PDGFRα عن طريق إفراز PDGF. 
في الآونة الأخيرة ، تم نشر بروتوكول عزل BAs ، والذي يعتمد على فرز الخلايا المنشط بالفلورة (FACS)12. في هذا البروتوكول ، تم استخدام محلول ألبومين مصل البقر (BSA) بنسبة 3٪ لفصل BAs عن غير BAs ، وتم تنقية BAs المخصبة بواسطة FACS. وتطبيق هذا البروتوكول مقيد بمقتضيات عملية نظام مراقبة الأصول الميدانية، التي تعتمد على كل من المعدات وخبرات تشغيل نظام مراقبة الأصول الميدانية. في هذه الدراسة ، تم تطوير بروتوكول جديد لعزل BAs من BAT. يمكن استخدام BAs المعزولة بواسطة هذا البروتوكول مباشرة لدراسات التعبير الجيني والبروتيني. علاوة على ذلك ، تشير البيانات المستقاة من هذه الدراسة إلى أن BAs هي مورد PDGF رئيسي.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antigen</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PPAR&#947;</td>
			<td>LSBio</td>
			<td>Ls-C368478</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDGFRa</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-398206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UCP1</td>
			<td>R&#38;D system</td>
			<td>IC6158P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemical and solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type II</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17101015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Bromo-3-chloropropane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B62404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)&#160;</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>A-421-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>CT1330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>IB05040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II, protease</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5693</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>EB0107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>IB15724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiQuant Universal Green qPCR Master Mix</td>
			<td>LifeSct</td>
			<td>LS01131905Y</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride Hexahydrate</td>
			<td>Boston BioProducts</td>
			<td>P-855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OneScrip Plus cDNA Synthesis SuperMix</td>
			<td>ABM</td>
			<td>G454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep (Iodixanol)</td>
			<td>Cosmo Bio USA</td>
			<td>AXS-1114542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10x)</td>
			<td>Caisson Labs</td>
			<td>PBL07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (1x)</td>
			<td>Caisson Labs</td>
			<td>PBL06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Boston BioProducts</td>
			<td>P-1435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SimplyBlue safe Stain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC6060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>75746</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol reagent</td>
			<td>Life technoologies</td>
			<td>15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene name (Species)&#160;</td>
			<td>Forward</td>
			<td>Reverse</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pdgfra (Mouse)</td>
			<td>CTCAGCTGTCTCCTCACAgG</td>
			<td>CAACGCATCTCAGAGAAAAGG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pdgfa (Mouse)</td>
			<td>TGTGCCCATTCGCAGGAAGAG</td>
			<td>TTGGCCACCTTGACACTGCG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>36B4(Mouse)</td>
			<td>TGCTGAACATCTCCCCCTTCTC</td>
			<td colspan="2">TCTCCACAGACAATGCCAGGAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ucp1</td>
			<td>ACTGCCACACCTCCAGTCATT</td>
			<td>CTTTGCCTCACTCAGGATTGG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Application</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keyence BZ-X700</td>
			<td>Keyence</td>
			<td colspan="2">Imaging brown adipocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>Dissociate BAT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System</td>
			<td>Applied Biosystem</td>
			<td>Quantitative PCR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Odyssey Fc Imaging system</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>Western blot immaging</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolating brown adipocytes from murine interscapular brown adipose tissue for gene and protein expression analysis

الأنسجة الدهنية البنية (BAT) هي المسؤولة عن توليد الحرارة غير المرتعش في الثدييات ، والخلايا الشحمية البنية (BAs) هي الوحدات الوظيفية ل BAT. بتحتوي هذه القطيرات على قطرات ليبيدات متعددة الأعراق وميتوكوندريا وفيرة، وتعبر عن فصل البروتين 1 (UCP1). يتم تصنيف BAs إلى نوعين فرعيين بناء على أصلها: BAs الكلاسيكية المشتقة من الجنين (cBAs) والخلايا الشحمية البيضاء المشتقة BAs. نظرا لكثافتها المنخفضة نسبيا ، لا يمكن عزل BAs عن BAT بطريقة الطرد المركزي التقليدية. في هذه الدراسة ، تم تطوير طريقة جديدة لعزل BAs من الفئران لتحليل التعبير الجيني والبروتيني. في هذا البروتوكول ، تم هضم BAT بين الكتفين من الفئران البالغة بمحلول Collagenase و Dispase ، وتم إثراء BAs المنفصلة بمحلول يوديكسانول 6٪. ثم تم تحليل BAs المعزولة باستخدام كاشف Trizol للعزل المتزامن للحمض النووي الريبي والحمض النووي والبروتين. بعد عزل الحمض النووي الريبي ، تم استخدام المرحلة العضوية من المحللة لاستخراج البروتين. أظهرت بياناتنا أن محلول يوديكسانول 6٪ يثري BAs بكفاءة دون التدخل في دراسات التعبير الجيني والبروتيني المتابعة. عامل النمو المشتق من الصفائح الدموية (PDGF) هو عامل نمو ينظم نمو وتكاثر خلايا اللحمة المتوسطة. بالمقارنة مع الأنسجة الدهنية البنية ، كان لدى BAs المعزولة تعبير أعلى بكثير عن Pdgfa. باختصار ، توفر هذه الطريقة الجديدة منصة لدراسة بيولوجيا الخلايا الشحمية البنية على مستوى خلية واحدة.

تحضير BAT بين الكتفين لعزل الخلايا الشحمية البنية يوضح الشكل 1 أ عملية عزل الخلايا الشحمية البنية. ستستغرق العملية برمتها ، من إعداد BAT وحلول الهضم / الفصل إلى الحصول على BAs المعزولة حوالي 4 ساعات.
في الفئران البالغة ، توجد BAT وفيرة في المنطقة بين الكت?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolating Brown Adipocytes from Murine Interscapular Brown Adipose Tissue for Gene and Protein Expression Analysis at JoVE.com

Isolating Brown Adipocytes from Murine Interscapular Brown Adipose Tissue for Gene and Protein Expression Analysis

تصف هذه الدراسة طريقة جديدة لعزل الخلايا الشحمية البنية للفئران لتحليل التعبير الجيني والبروتيني.

عزل الخلايا الشحمية البنية من الأنسجة الدهنية البنية بين الكتفين لتحليل التعبير الجيني والبروتيني

Brown adipose tissue (BAT) is responsible for non-shivering thermogenesis in mammals, and brown adipocytes (BAs) are the functional units of BAT. BAs ...

للتحقيق في الجوانب البيولوجية للأنسجة الدهنية البنية ، من الضروري إزالة الحجم الدهني البني النقي. حاليا لا يأتي في تنقية حجم الدهون البني والكتل متوفرة. في هذه الدراسة ، قمنا بتطوير بروتوكول مباشر لمعالجة هذه المشكلة.الآن ، هناك حاجة إلى مهارات واحدة لهذا البروتوكول. يحتاج إلى مواد دراسة أقل بكثير من الطرق الأخرى ويمكن استخدام الحجم الدهني البني المنقى مباشرة لتحليل التعبير الجيني والبروتيني. يوفر هذا البروتوكول طريقة جديدة لدراسة بيولوجيا الحجم الدهني البني الكلاسيكي.ويمكن أيضا أن تطبق لدراسة عملية تحمير الخلايا الشحمية البيضاء. ستوضح الإجراء أماندا ، مساعدة أبحاث من مختبري. ابدأ بوضع القارورة مع BAT ومحلول الهضم على محرك مغناطيسي بمعدل 60 دورة في الدقيقة في حاضنة 35 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.استخدم ماصة ملليلتر واحد لتعطيل كتل الأنسجة المجمعة لشرائح BAT حول شريط التقليب. بعد الهضم ، ضع مرشح مصفاة 70 ميكرومتر فوق أنبوب طرد مركزي نظيف سعة 50 ملليلتر وماصة حول أربعة ملليلتر من تعليق الخلية عبر المصفاة. ثم اغسله بأربعة ملليلتر من محلول يوديكسانول 12٪.ماصة لأعلى ولأسفل لخلط الخلايا بمحلول اليوديكسانول ثم نقل خليط الخلية إلى أنبوبي اختبار بوليسترين شفافين سعة خمسة ملليلتر. ضع أنابيب البوليسترين التي تحتوي على خليط الخلايا على الثلج لمدة ساعة واحدة، مما يتسبب في تكوين طبقة على القمة. أخرج 20 ميكرولترا من BAs المعزولة لفحص المجهر.لعزل الحمض النووي الريبي والبروتين ، ماصة طبقة BA في أنبوبين microcenterfuge 1.7 ملليلتر. ثم قم بإزالة محلول اليوديكسونال المفرط بعناية دون تعطيل طبقة BA. ثم أضف ملليلترا واحدا من TRIzol إلى محلول الخلية لعزل الحمض النووي الريبي والحمض النووي والبروتين في وقت واحد واخلطه بشكل كاف لتقطيع الخلايا.لفصل المراحل ، أضف 200 ميكرولتر من الكلوروفورم وأجهزة الطرد المركزي إلى الأنبوب عند 9،981 جم لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية. بعد الطرد المركزي ، استخدم المرحلة المائية لعزل الحمض النووي الريبي. انقل 300 ميكرولتر من المرحلة العضوية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 2 ملليلتر وأضف 750 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 100٪.بعد الدوامة لمدة 10 ثوان ، أضف 200 ميكرولتر من 1-برومو-3-كلوروبروبان ودوامة مرة أخرى لمدة 10 ثوان. أضف 600 ميكرولتر من الماء المقطر المزدوج قبل الدوامة لمدة 10 ثوان. دع المحلول المختلط يقف لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.بعد الطرد المركزي ، أضف 9،981 G لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية. سيتم فصل المراحل مع مرحلة البروتين المترجمة في الطبقة الوسطى. قم بإزالة المحلول المائي العلوي وأضف ملليلتر واحد من الإيثانول بنسبة 100٪ إلى المحلول المتبقي.بعد الطرد المركزي عند 9،981 G لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية ، تخلص من المادة الطافية واغسل الحبيبات بملليلتر واحد من الإيثانول بنسبة 100٪. أجهزة الطرد المركزي في 9،981 G لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية. بعد إزالة المادة الطافية ، جفف الحبيبات في الهواء لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة وقم بقياس وزن الحبيبات الرطبة.أضف محلول SDS بنسبة 1٪ 20 ميكرولتر لكل ملليغرام من الحبيبات. قم بإذابة الحبيبات تماما عن طريق وضع الأنبوب في شاكر ساخن عند 55 درجة مئوية و 11 جم لمدة خمس إلى 10 دقائق. في البروتوكول ، تم استخدام PBS الذي يحتوي على 3٪ BSA لفصل BAs عن BAT.كانت الخلايا المعزولة على شكل توت العليق مع قطرات دهنية متعددة العين بداخلها وكانت إيجابية tdTom ، مما يؤكد أنها كانت BAs. تم عزل البروتين من BAs باستخدام بروتوكول GTPC محسن ثم تم فحصه باستخدام هلام SDS-PAGE. لوحظ وجود نطاق مهيمن مرتبط ب BSA في عينة BA ، مما يشير إلى تداخله في استخراج البروتين.لتجنب تداخل BSA ، تم استخدام محلول يوديكسونال 6٪ لعزل BAs ، والتي كان لها شكل توت نموذجي وتحتوي على قطرات دهنية متعددة العينات. تم فصل البروتينات المستخرجة من هذه BAs جيدا في هلام SDS-PAGE. تم العثور على هذه الخلايا لتكون tdTomato إيجابية في حين أن الخلايا المستعادة من الحبيبات كانت tdTomato سلبية مع عدم وجود قطرات دهنية واضحة ، مما يشير إلى الفصل الفعال ل BAs من الخلايا غير الدهنية.في تحليل التعبير الجيني ، كانت مستويات mRNA ل UCP1 و PDGFA أعلى بكثير في BAs المعزولة. ولكن تم اكتشاف mRNA من PDGFRA فقط في BAT. تم العثور على بروتين UCP1 المخصب في BAs معزولة.تم الكشف عن EDGFR alpha في أفضل التقنيات المتاحة ، ولكن ليس في BAs المعزولة. تؤكد هذه النتائج كفاءة طريقة عزل BAs وتثبت أن BAs المعزولة مناسبة لدراسات التعبير الجيني والبروتيني. عند محاولة هذا البروتوكول ، استخدم مخزن هضم طازج لفصل الأنسجة الدهنية البنية وتجنب تكوين كتلة الأنسجة خلال فترة الهضم.هذه الطريقة الجديدة تجعل من السهل التحقيق في بيولوجيا الأنسجة الدهنية البنية على مستوى صنبور خلية واحدة. من خلال تطبيق هذه الطريقة ، يمكن للمرء إجراء دراسات تعبير GN والبروتين باستخدام الخلايا الشحمية البنية النقية التي تشريح بدقة برنامج التعبير الجيني للخلايا الشحمية البنية ، دون القلق بشأن التلوث في الأصل من الخلايا غير الدهنية.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Real-time Imaging of Leukotriene B4 Mediated Cell Migration and BLT1 Interactions with &beta;-arrestin

Real-time Imaging of Leukotriene B4 Mediated Cell Migration and BLT1 Interactions with ÃƒÅ½Ã‚Â²-arrestin

في الوقت الحقيقي التصوير باء Leukotriene 4 الهجرة خلية وساطة BLT1 التفاعلات مع arrestin - β

G-protein coupled receptors (GPCRs) belong to the seven transmembrane protein family and mediate the transduction of extracellular signals to ...

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

باستخدام التصوير Bioluminescent بالتحقيق في التآزر بين العقدية الرئوية والأنفلونزا من الفيروسات في الفئران الرضع

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

التفريق الأدوار الوظيفية في التعبير الجيني من الخلايا المناعية وغير المناعية في التهاب القولون الماوس عن طريق زرع نخاع العظم

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice ...

Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer's Patches

عزل والخلايا اللمفاوية المناعية والخلايا الجذعية من الفئران باير لالرقع

Peyer's  patches (PPs) are integral components of the gut-associated lymphoid tissues  (GALT) and play a central role in intestinal immunosurveillance and ...

Isolation of Adipose Tissue Immune Cells

العزلة من الأنسجة الدهنية خلايا المناعة

The discovery of increased macrophage infiltration in  the adipose tissue (AT) of obese rodents and humans has led to an  intensification of interest in ...

Isolation of Murine Peritoneal Macrophages to Carry Out Gene Expression Analysis Upon Toll-like Receptors Stimulation

عزل الفئران البريتوني الضامة لتنفيذ جين تحليل التعبير عند تول مثل مستقبلات تحفيز

During infection and inflammation, circulating monocytes leave the bloodstream and migrate into tissues, where they differentiate into macrophages. ...

Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials

فحوصات النوعية والكمية للكشف وتوصيف مضادات الميكروبات البروتين

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods ...

SILAC Based Proteomic Characterization of Exosomes from HIV-1 Infected Cells

SILAC القائم [بروتيوميك توصيف Exosomes من HIV-1 الخلايا المصابة

Proteomics is the large-scale analysis of proteins. Proteomic techniques, such as liquid chromatography tandem mass spectroscopy (LC-MS/MS), can ...

Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System

عزل الخلايا الليمفاوية من الماوس صغيرة المعوية المناعي

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to ...

Isolation, Expansion, and Adipogenic Induction of CD34+CD31+ Endothelial Cells from Human Omental and Subcutaneous Adipose Tissue

العزلة والتوسع وتحريض أديبوجينيك CD34 + CD31 + خلايا بطانية من الأنسجة الدهنية تحت الجلد وأومينتال البشرية

Obesity is accompanied by an extensive remodeling of adipose tissue primarily via adipocyte hypertrophy. Extreme adipocyte growth results in a poor ...