Name: isolating brown adipocytes from murine interscapular brown adipose tissue for gene and protein expression analysis
Uploaded: 2021-03-12T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolating Brown Adipocytes from Murine Interscapular Brown Adipose Tissue for Gene and Protein Expression Analysis at JoVE.com

Z. Lin blev støttet af National Institutes of Health HL138454-01 og Masonic Medical Research Institute midler.

Alle mus blev opretholdt under patogenfrie forhold, og alle procedurer blev godkendt af Masonic Medical Research Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). UCP1::Cre9 og Rosa 26tdTomato mus linjer13 blev rapporteret tidligere. Alle mus blev holdt ved stuetemperatur med en 12 timers lys / mørk cyklus.
1. Forberedelse af opløsninger og brunt fedtvæv (BAT)
<ol><li>Fordøjelsesopløsning og separationsopløsning fremstilles ...

<ol>
	<li>Zwick, R. K., Guerrero-Juarez, C. F., Horsley, V., Plikus, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomical,+physiological,+and+functional+diversity+of+adipose+tissue.">Anatomical, physiological, and functional diversity of adipose tissue.</a> Cell Metabolism. 27, 68-83 (2018).</li><li>Symonds, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brown+adipose+tissue+growth+and+development.">Brown adipose tissue growth and development.</a> Scientifica. 2013, 305763 (2013).</li><li>Giralt, M., Villarroya, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=White,+brown,+beige/brite:+Different+adipose+cells+for+different+functions.">White, brown, beige/brite: Different adipose cells for different functions.</a> Endocrinology. 154, 2992-3000 (2013).</li><li>Cannon, B., Nedergaard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brown+adipose+tissue:+function+and+physiological+significance.">Brown adipose tissue: function and physiological significance.</a> Physiological Reviews. 84, 277-359 (2004).</li><li>Cinti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adipose+organ.">The adipose organ.</a> Prostaglandins, Leukotrienes and Essential Fatty Acids. 73, 9-15 (2005).</li><li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beige+adipocytes+are+a+distinct+type+of+thermogenic+fat+cell+in+mouse+and+human.">Beige adipocytes are a distinct type of thermogenic fat cell in mouse and human.</a> Cell. 150, 366-376 (2012).</li><li>Cypess, A. M., Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brown+fat+as+a+therapy+for+obesity+and+diabetes.">Brown fat as a therapy for obesity and diabetes.</a> Current Opinion in Endocrinology, Diabetes and Obesity. 17, 143-149 (2010).</li><li>Schoettl, T., Fischer, I. P., Ussar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+adipose+tissue+in+development+and+metabolic+function.">Heterogeneity of adipose tissue in development and metabolic function.</a> Journal of Experimental Biology. 221, (2018).</li><li>Kong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IRF4+is+a+key+thermogenic+transcriptional+partner+of+PGC-1&#945;.">IRF4 is a key thermogenic transcriptional partner of PGC-1&#945;.</a> Cell. 158, 69-83 (2014).</li><li>Lee, Y. H., Petkova, A. P., Konkar, A. A., Granneman, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+origins+of+cold-induced+brown+adipocytes+in+adult+mice.">Cellular origins of cold-induced brown adipocytes in adult mice.</a> The FASEB Journal. 29, 286-299 (2015).</li><li>Kim, W. -. S., Park, H. -. S., Sung, J. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pivotal+role+of+PDGF+and+its+receptor+isoforms+in+adipose-derived+stem+cells.">The pivotal role of PDGF and its receptor isoforms in adipose-derived stem cells.</a> Histology and Histopathology. 30 (7), 793-799 (2015).</li><li>Hagberg, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+of+mouse+and+human+adipocytes+for+the+analysis+of+browning+and+cellular+heterogeneity.">Flow cytometry of mouse and human adipocytes for the analysis of browning and cellular heterogeneity.</a> Cell Report. 24, 2746-2756 (2018).</li><li>Madisen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+and+high-throughput+Cre+reporting+and+characterization+system+for+the+whole+mouse+brain.">A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain.</a> Nature Neuroscience. 13, 133-140 (2010).</li><li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid.">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Analytical biochemistry. 150, 76-85 (1985).</li><li>Chey, S., Claus, C., Liebert, U. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+method+for+simultaneous+isolation+of+proteins+and+nucleic+acids.">Improved method for simultaneous isolation of proteins and nucleic acids.</a> Analytical Biochemistry. 411, 164-166 (2011).</li><li>Ford, T., Graham, J., Rickwood, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iodixanol:+A+nonionic+iso-osmotic+centrifugation+medium+for+the+formation+of+self-generated+gradients.">Iodixanol: A nonionic iso-osmotic centrifugation medium for the formation of self-generated gradients.</a> Analytical Biochemistry. 220, 360-366 (1994).</li><li>Kovacovicova, K., Vinciguerra, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+senescent+cells+by+iodixanol+(OptiPrep)+density+gradient-based+separation.">Isolation of senescent cells by iodixanol (OptiPrep) density gradient-based separation.</a> Cell Proliferation. 52, 12674 (2019).</li><li>Lock, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=versatile+manufacturing+of+recombinant+adeno-associated+viral+vectors+at+scale.">versatile manufacturing of recombinant adeno-associated viral vectors at scale.</a> Human Gene Therapy. 21, 1259-1271 (2010).</li><li>Marin, R. D., Crespo-Garcia, S., Wilson, A. M., Sapieha, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RELi+protocol:+Optimization+for+protein+extraction+from+white,+brown,+and+beige+adipose+tissues.">RELi protocol: Optimization for protein extraction from white, brown, and beige adipose tissues.</a> MethodsX. 6, 918-928 (2019).</li><li>Sonna, L. A., Fujita, J., Gaffin, S. L., Lilly, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invited+Review:+effects+of+heat+and+cold+stress+on+mammalian+gene+expression.">Invited Review: effects of heat and cold stress on mammalian gene expression.</a> Journal of Applied Physiology. 92, 1725-1742 (2002).</li><li>Gensch, N., Borchardt, T., Schneider, A., Riethmacher, D., Braun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+autonomous+myogenic+cell+populations+revealed+by+ablation+of+Myf5-expressing+cells+during+mouse+embryogenesis.">Different autonomous myogenic cell populations revealed by ablation of Myf5-expressing cells during mouse embryogenesis.</a> Development. 135, 1597-1604 (2008).</li></ol>

I denne undersøgelse blev der udviklet en ny metode til isolering af BA'er til gen- og proteinekspressionsanalyse.
I en offentliggjort BAs-isolationsprotokol blev 3% BSA-opløsning brugt til at berige BA'er12. Ikke desto mindre kunne de berigede BA'er, der blev opnået ved denne offentliggjorte protokol, ikke anvendes direkte til proteinekspressionsanalyse. Dette skyldes, at den koncentrerede BSA, der findes i BAs-opløsningen, interfererer med opfølgende proteinekstr...

Både mus og mennesker har to typer fedtvæv: hvidt fedtvæv (WAT) og brunt fedtvæv (BAT)1. WAT lagrer energi i form af triglycerider i hvide adipocytter, og de brune adipocytter (BA'er) af BAT spreder kemisk energi som varme2. Baseret på deres udviklingsmæssige oprindelse kategoriseres BA'er yderligere i klassiske BA'er (cBA'er), der dannes under embryoudvikling og hvide adipocytter afledte BA'er (beige / britceller, omdannet fra hvide adipocytter under stressforhold)3. BA'er er multilokulære og udtrykker det termogeniske proteinafkoblingsprotein 1 (UCP1)4. Interscapular BAT (iBAT) depot er et af de primære cBAs depoter i små pattedyr5, mens beige celler er spredt inden for WAT6. 
På grund af deres karakter af at sprede energi har BA'er fået meget opmærksomhed som et terapeutisk mål for reduktion af fedme7. For at udnytte BA'er med det formål at behandle fedme er det vigtigt at forstå de molekylære mekanismer, der styrer BAs funktion, overlevelse og rekruttering. Fedtvæv, herunder BAT og WAT, er heterogene. Bortset fra adipocytter indeholder fedtvæv mange andre celletyper, såsom endotelceller, mesenkymale stamceller og makrofager8. Selvom genetiske værktøjer til specifikt at nedbryde kandidatgener i mus BA'er er tilgængelige, såsom UCP1::Cre linje9, er teknikker til rensning af BA'er fra BAT eller WAT begrænsede, hvilket gør det svært at studere BA'er på enkeltcelletypeniveau. Uden at opnå rene BA'er vil forholdet mellem BA'er og ikke-BA'er desuden ikke være klart afgrænset. For eksempel er blodpladeafledt vækstfaktorreceptor alfa (PDGFRα) blevet brugt som markør for udifferentierede mesenkymale celler, og det udtrykkes i endotel- og interstitielle celler i BAT. I koldstresset BAT giver PDGFRα-positive stamceller anledning til nye BA'er10. PDGFRα aktiveres af dets ligand PDGF, en vækstfaktor, der regulerer vækst og spredning af mesenkymale celler11; Det er imidlertid uklart, om BA'er påvirker adfærden af PDGFRα-positive stamceller ved at udskille PDGF. 
For nylig er der offentliggjort en BAs-isolationsprotokol, som er baseret på fluorescensaktiveret cellesortering (FACS)12. I denne protokol blev 3% bovin serumalbumin (BSA) opløsning anvendt til at adskille BA'er fra ikke-BA'er, og de berigede BA'er blev yderligere renset af FACS. Anvendelsen af denne protokol er begrænset af kravet om FACS-proces, som er afhængig af både udstyr og FACS-driftserfaringer. I denne undersøgelse blev der udviklet en ny protokol til isolering af BA'er fra BAT. De BA'er, der er isoleret af denne protokol, kan anvendes direkte til gen- og proteinekspressionsundersøgelser. Desuden tyder data fra denne undersøgelse på, at BA'er er en vigtig PDGF-ressource.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antigen</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PPAR&#947;</td>
			<td>LSBio</td>
			<td>Ls-C368478</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDGFRa</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-398206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UCP1</td>
			<td>R&#38;D system</td>
			<td>IC6158P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemical and solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type II</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17101015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Bromo-3-chloropropane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B62404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)&#160;</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>A-421-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>CT1330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>IB05040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II, protease</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5693</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>EB0107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>IB15724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiQuant Universal Green qPCR Master Mix</td>
			<td>LifeSct</td>
			<td>LS01131905Y</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride Hexahydrate</td>
			<td>Boston BioProducts</td>
			<td>P-855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OneScrip Plus cDNA Synthesis SuperMix</td>
			<td>ABM</td>
			<td>G454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep (Iodixanol)</td>
			<td>Cosmo Bio USA</td>
			<td>AXS-1114542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10x)</td>
			<td>Caisson Labs</td>
			<td>PBL07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (1x)</td>
			<td>Caisson Labs</td>
			<td>PBL06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Boston BioProducts</td>
			<td>P-1435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SimplyBlue safe Stain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC6060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>75746</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol reagent</td>
			<td>Life technoologies</td>
			<td>15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene name (Species)&#160;</td>
			<td>Forward</td>
			<td>Reverse</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pdgfra (Mouse)</td>
			<td>CTCAGCTGTCTCCTCACAgG</td>
			<td>CAACGCATCTCAGAGAAAAGG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pdgfa (Mouse)</td>
			<td>TGTGCCCATTCGCAGGAAGAG</td>
			<td>TTGGCCACCTTGACACTGCG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>36B4(Mouse)</td>
			<td>TGCTGAACATCTCCCCCTTCTC</td>
			<td colspan="2">TCTCCACAGACAATGCCAGGAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ucp1</td>
			<td>ACTGCCACACCTCCAGTCATT</td>
			<td>CTTTGCCTCACTCAGGATTGG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Application</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keyence BZ-X700</td>
			<td>Keyence</td>
			<td colspan="2">Imaging brown adipocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>Dissociate BAT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System</td>
			<td>Applied Biosystem</td>
			<td>Quantitative PCR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Odyssey Fc Imaging system</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>Western blot immaging</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolating brown adipocytes from murine interscapular brown adipose tissue for gene and protein expression analysis

Brunt fedtvæv (BAT) er ansvarlig for ikke-rystende termogenese hos pattedyr, og brune adipocytter (BA'er) er de funktionelle enheder af BAT. BA'er indeholder både multilokulære lipiddråber og rigelige mitokondrier, og de udtrykker afkobling af protein 1 (UCP1). BA'er er kategoriseret i to undertyper baseret på deres oprindelse: embryoafledte klassiske BA'er (cBA'er) og hvide adipocytter afledte BA'er. På grund af deres relativt lave densitet kan BA'er ikke isoleres fra BAT med traditionel centrifugeringsmetode. I denne undersøgelse blev der udviklet en ny metode til at isolere BA'er fra mus til gen- og proteinekspressionsanalyse. I denne protokol blev interscapular BAT fra voksne mus fordøjet med Collagenase og Dispase-opløsning, og de dissocierede BA'er blev beriget med 6% iodixanolopløsning. Isolerede BA'er blev derefter lyset med Trizol-reagens til samtidig isolering af RNA, DNA og protein. Efter RNA-isolering blev den organiske fase af lysatet anvendt til proteinekstraktion. Vores data viste, at 6% iodixanolopløsning effektivt berigede BA'er uden at forstyrre opfølgende gen- og proteinekspressionsundersøgelser. Trombocytafledt vækstfaktor (PDGF) er en vækstfaktor, der regulerer vækst og spredning af mesenkymale celler. Sammenlignet med det brune fedtvæv havde isolerede BA'er signifikant højere ekspression af Pdgfa. Sammenfattende giver denne nye metode en platform til at studere biologien af brune adipocytter på et enkelt celletypeniveau.

Forberedelse af interacapular BAT til isolering af brune adipocytter Den brune adipocytter (BA'er) isolationsproces er afbildet i figur 1A. Hele processen, fra fremstilling af BAT og fordøjelses- / separationsopløsninger til opnåelse af isolerede BA'er, vil tage omkring 4 timer.
Hos voksne mus findes der rigelig BAT i det interscapulære område. Denne interscapular BAT (iBAT) er dækket af muskellag og WAT (figur 1B</st...

Watch this Scientific Journal Video about Isolating Brown Adipocytes from Murine Interscapular Brown Adipose Tissue for Gene and Protein Expression Analysis at JoVE.com

Isolating Brown Adipocytes from Murine Interscapular Brown Adipose Tissue for Gene and Protein Expression Analysis

Denne undersøgelse beskriver en ny metode til isolering af murinbrune adipocytter til gen- og proteinekspressionsanalyse.

Isolering af brune adipocytter fra murin interscapulært brunt fedtvæv til gen- og proteinekspressionsanalyse

Brown adipose tissue (BAT) is responsible for non-shivering thermogenesis in mammals, and brown adipocytes (BAs) are the functional units of BAT. BAs ...

For at undersøge de biologiske aspekter af brunt fedtvæv er det vigtigt at rydde renset brun fedtstørrelse. I øjeblikket kom ingen i brun fedtstørrelsesrensning, og masserne er tilgængelige. I denne undersøgelse udviklede vi en ligetil protokol til at løse dette problem.Nu kræves der en færdighed til denne protokol. Det kræver meget færre undersøgelsesmaterialer end andre metoder, og den oprensede brune fedtstørrelse kan bruges direkte til gen- og proteinekspressionsanalyse. Denne protokol giver en ny metode til at studere biologien af klassisk brun fedtstørrelse.Det kan også anvendes til at studere hvide adipocytter bruningsproces. Amanda, en forskningsassistent fra mit laboratorium, demonstrerer proceduren. Start med at placere kolben med BAT og fordøjelsesopløsning på en magnetomrører ved 60 rotationer i minuttet i en 35 grader Celsius inkubator i 30 minutter.Brug en en milliliter pipette til at forstyrre de aggregerede vævsklumper af BAT-skiver omkring omrørerstangen. Efter fordøjelsen placeres et 70 mikrometer silfilter oven på et rent 50 milliliter centrifugerør og pipetterer omkring fire milliliter cellesuspension gennem silen. Vask det derefter med fire milliliter 12% iodixanolopløsning.Pipette op og ned for at blande cellerne med iodixanolopløsning, og overfør derefter celleblandingen til to klare fem milliliter polystyrenreagensglas. Placer polystyrenrørene indeholdende celleblandingen på is i en time, hvilket får BA'erne til at danne et lag på toppen. Tag 20 mikroliter af de isolerede BA'er ud til mikroskopundersøgelse.Til RNA- og proteinisolering pipetteres BA-laget i to 1,7 milliliter mikrocenterfugerør. Fjern derefter forsigtigt den overdrevne iodixonale opløsning uden at forstyrre BA-laget. Tilsæt derefter en milliliter TRIzol i celleopløsningen for samtidig at isolere RNA, DNA og protein og bland tilstrækkeligt til at lyce cellerne.For at adskille faserne tilsættes 200 mikroliter chloroform og centrifuge til røret ved 9.981 G i 10 minutter ved fire grader Celsius. Efter centrifugering anvendes den vandige fase til RNA-isolering. Overfør 300 mikroliter af den organiske fase til et to milliliter mikrocentrifugerør og tilsæt 750 mikroliter 100% ethanol.Efter hvirveldannelse i 10 sekunder tilsættes 200 mikroliter 1-Brom-3-chlorpropan og hvirvel igen i 10 sekunder. Tilsæt 600 mikroliter dobbeltdestilleret vand inden hvirvlen i 10 sekunder. Lad den blandede opløsning stå i 10 minutter ved stuetemperatur.Efter centrifugering tilsættes 9.981 G i 10 minutter ved fire grader Celsius. Faserne adskilles med proteinfasen lokaliseret i mellemlaget. Fjern den øverste vandige opløsning og tilsæt en milliliter 100% ethanol i den resterende opløsning.Efter centrifugering ved 9.981 G i 10 minutter ved fire grader Celsius kasseres supernatanten og vaskes pelleten med en milliliter 100% ethanol. Centrifuge ved 9.981 G i 10 minutter ved fire grader Celsius. Efter fjernelse af supernatanten lufttørres pelleten i 10 minutter ved stuetemperatur og måles vægten af den våde pellet.Tilsæt 1% SDS-opløsning i et forhold på 20 mikroliter pr. Milligram pellet. Opløs pelleten fuldstændigt ved at sætte røret i en opvarmet ryster ved 55 grader Celsius og 11 G i fem til 10 minutter. I protokollen blev PBS indeholdende 3% BSA brugt til at adskille BA'er fra BAT.De isolerede celler var hindbærformede med multilokulære lipiddråber indeni og var tdTom-positive, hvilket bekræftede, at de var BA'er. Protein blev isoleret fra BA'erne med en forbedret GTPC-protokol og blev derefter undersøgt med en SDS-PAGE gel. Et dominerende bånd forbundet med BSA blev observeret i BA-prøven, hvilket tyder på dets interferens i proteinekstraktion.For at undgå BSA-interferens blev der anvendt en 6% iodixonal opløsning til isolering af BA'er, som havde en typisk hindbærform og indeholdt multilokulære lipiddråber. Proteiner ekstraheret fra disse BA'er blev godt adskilt i SDS-PAGE-gelen. Disse celler viste sig at være tdTomato-positive, mens celler, der blev genvundet fra pelleten, var tdTomato-negative uden tydelige lipiddråber, hvilket tyder på effektiv adskillelse af BA'erne fra de fedtfri celler.I genekspressionsanalyse var mRNA-niveauerne af UCP1 og PDGFA signifikant højere i de isolerede BA'er. Men mRNA af PDGFRA blev kun påvist i BAT. UCP1-protein blev fundet beriget i isolerede BA'er.EDGFR alfa blev påvist i BAT, men ikke i isolerede BA'er. Disse resultater bekræfter effektiviteten af metoden til isolering af BA'er og viser, at de isolerede BA'er er egnede til gen- og proteinekspressionsundersøgelser. Når du forsøger denne protokol, skal du bruge frisk fordøjelsesbuffer til at adskille brunt fedtvæv og undgå dannelse af vævsklumper i fordøjelsesperioden.Denne nye metode gør det nemt at undersøge biologien af brunt fedtvæv på et enkelt cellehaneniveau. Ved at anvende denne metode kan man udføre GN- og proteinekspressionsstudier med rene brune adipocytter, der præcist dissekerer brune adipocytters genekspressionsprogram, uden at bekymre sig om forurening oprindeligt fra fedtfri celler.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Real-time Imaging of Leukotriene B4 Mediated Cell Migration and BLT1 Interactions with &beta;-arrestin

Real-time Imaging of Leukotriene B4 Mediated Cell Migration and BLT1 Interactions with ÃƒÅ½Ã‚Â²-arrestin

G-protein coupled receptors (GPCRs) belong to the seven transmembrane protein family and mediate the transduction of extracellular signals to ...

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

Differentiering funktionelle roller af genekspression fra immun og ikke-immun celler i Mouse Colitis af knoglemarvstransplantation

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice ...

Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer's Patches

Isolering og immunfarvning Lymfocytter og dendritiske celler fra murine Peyerske plaks

Peyer's  patches (PPs) are integral components of the gut-associated lymphoid tissues  (GALT) and play a central role in intestinal immunosurveillance and ...

Isolation of Adipose Tissue Immune Cells

Isolering af fedtvæv immunceller

The discovery of increased macrophage infiltration in  the adipose tissue (AT) of obese rodents and humans has led to an  intensification of interest in ...

Isolation of Murine Peritoneal Macrophages to Carry Out Gene Expression Analysis Upon Toll-like Receptors Stimulation

Isolering af murine peritoneale makrofager til Carry Out genekspressionsanalyse Upon Toll-lignende receptorer Stimulation

During infection and inflammation, circulating monocytes leave the bloodstream and migrate into tissues, where they differentiate into macrophages. ...

Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials

Kvalitative og kvantitative Analyser for påvisning og karakterisering af Protein Antimikrobielle stoffer

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods ...

SILAC Based Proteomic Characterization of Exosomes from HIV-1 Infected Cells

SILAC Based proteomiske Karakterisering af Exosomer fra HIV-1 inficerede celler

Proteomics is the large-scale analysis of proteins. Proteomic techniques, such as liquid chromatography tandem mass spectroscopy (LC-MS/MS), can ...

Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System

Isolere lymfocytter fra mus Small Intestinal immunsystemet

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to ...

Isolation, Expansion, and Adipogenic Induction of CD34+CD31+ Endothelial Cells from Human Omental and Subcutaneous Adipose Tissue

Isolation, ekspansion og Adipogenic induktion af CD34 + CD31 + endotelceller fra menneskelige Omental og subkutane fedtvæv

Obesity is accompanied by an extensive remodeling of adipose tissue primarily via adipocyte hypertrophy. Extreme adipocyte growth results in a poor ...