Name: isolating brown adipocytes from murine interscapular brown adipose tissue for gene and protein expression analysis
Uploaded: 2021-03-12T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolating Brown Adipocytes from Murine Interscapular Brown Adipose Tissue for Gene and Protein Expression Analysis at JoVE.com

Z. Lin a été soutenu par les fonds des National Institutes of Health HL138454-01 et du Masonic Medical Research Institute.

Toutes les souris ont été maintenues dans des conditions exemptes d’agents pathogènes et toutes les procédures ont été approuvées par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) de la recherche médicale maçonnique. UCP1::Cre9 et Rosa 26tdLes lignées de souris Tomato13 ont été signalées précédemment. Toutes les souris ont été maintenues à température ambiante avec un cycle lumière/obscurité de 12 h.
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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invited+Review:+effects+of+heat+and+cold+stress+on+mammalian+gene+expression.">Invited Review: effects of heat and cold stress on mammalian gene expression.</a> Journal of Applied Physiology. 92, 1725-1742 (2002).</li><li>Gensch, N., Borchardt, T., Schneider, A., Riethmacher, D., Braun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+autonomous+myogenic+cell+populations+revealed+by+ablation+of+Myf5-expressing+cells+during+mouse+embryogenesis.">Different autonomous myogenic cell populations revealed by ablation of Myf5-expressing cells during mouse embryogenesis.</a> Development. 135, 1597-1604 (2008).</li></ol>

Dans cette étude, une nouvelle méthode d’isolement des BA pour l’analyse de l’expression des gènes et des protéines a été développée.
Dans un protocole d’isolation BAs publié, une solution BSA à 3% a été utilisée pour enrichir les BA12. Néanmoins, les BA enrichis obtenus par ce protocole publié n’ont pas pu être directement utilisés pour l’analyse de l’expression protéique. En effet, le BSA concentré existant dans la solution de BAs inte...

Les souris et les humains ont deux types de tissus adipeux : le tissu adipeux blanc (WAT) et le tissu adipeux brun (MTD)1. WAT stocke l’énergie sous forme de triglycérides dans les adipocytes blancs, et les adipocytes bruns (BA) de BAT dissipent l’énergie chimique sous forme de chaleur2. En fonction de leur origine développementale, les BA sont ensuite classés en BA classiques (cBA) qui se sont formés au cours du développement embryonnaire et en BA dérivés d’adipocytes blancs (cellules beiges / brite, converties à partir d’adipocytes blancs dans des conditions de stress)3. Les BA sont multiloculaires et expriment la protéine thermogénique de découplage 1 (UCP1)4. Le dépôt de MTD interscapulaire (iBAT) est l’un des principaux dépôts de cBA chez les petits mammifères5, tandis que les cellules beiges sont dispersées dans WAT6. 
En raison de leur nature de dissipation de l’énergie, les BA ont reçu beaucoup d’attention en tant que cible thérapeutique pour réduire l’obésité7. Pour exploiter les BA dans le but de traiter l’obésité, il est essentiel de comprendre les mécanismes moléculaires qui contrôlent la fonction, la survie et le recrutement des BA. Les tissus adipeux, y compris la MTD et la WAT, sont hétérogènes. À l’exception des adipocytes, les tissus adipeux contiennent de nombreux autres types de cellules, telles que les cellules endothéliales, les cellules souches mésenchymateuses et les macrophages8. Bien qu’il existe des outils génétiques pour épuiser spécifiquement les gènes candidats chez les souris BA, tels que UCP1::Cre line9, les techniques de purification des BAT ou WAT sont limitées, ce qui rend difficile l’étude des BA au niveau d’un type unicellulaire. De plus, sans obtenir des BA purs, la relation entre les BA et les non-BA ne sera pas clairement définie. Par exemple, le récepteur alpha du facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGFRα) a été utilisé comme marqueur pour les cellules mésenchymateuses indifférenciées, et il est exprimé dans les cellules endothéliales et interstitielles de la MTD. Dans les MTD soumises à un stress froid, les cellules progénitrices PDGFRα positives donnent naissance à de nouveaux BAs10. PDGFRα est activé par son ligand PDGF, un facteur de croissance qui régule la croissance et la prolifération des cellules mésenchymateuses11; cependant, il n’est pas clair si les BA influencent le comportement des cellules progénitrices PDGFRα positives en sécrétant PDGF. 
Récemment, un protocole d’isolement des BA a été publié, basé sur le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS)12. Dans ce protocole, une solution d’albumine sérique bovine (BSA) à 3 % a été utilisée pour séparer les BA des non-BA, et les BA enrichies ont été purifiées par FACS. L’application de ce protocole est limitée par l’exigence du processus FACS, qui repose à la fois sur l’équipement et sur l’expérience d’exploitation du FACS. Dans cette étude, un nouveau protocole pour isoler les BA des MTD a été développé. Les BA isolés par ce protocole peuvent être directement utilisés pour des études d’expression génique et protéique. De plus, les données de cette étude suggèrent que les AB sont une ressource importante du FGPD.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antigen</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PPAR&#947;</td>
			<td>LSBio</td>
			<td>Ls-C368478</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDGFRa</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-398206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UCP1</td>
			<td>R&#38;D system</td>
			<td>IC6158P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemical and solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type II</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17101015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Bromo-3-chloropropane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B62404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)&#160;</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>A-421-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>CT1330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>IB05040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II, protease</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5693</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>EB0107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>IB15724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiQuant Universal Green qPCR Master Mix</td>
			<td>LifeSct</td>
			<td>LS01131905Y</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride Hexahydrate</td>
			<td>Boston BioProducts</td>
			<td>P-855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OneScrip Plus cDNA Synthesis SuperMix</td>
			<td>ABM</td>
			<td>G454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep (Iodixanol)</td>
			<td>Cosmo Bio USA</td>
			<td>AXS-1114542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10x)</td>
			<td>Caisson Labs</td>
			<td>PBL07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (1x)</td>
			<td>Caisson Labs</td>
			<td>PBL06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Boston BioProducts</td>
			<td>P-1435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SimplyBlue safe Stain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC6060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>75746</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol reagent</td>
			<td>Life technoologies</td>
			<td>15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene name (Species)&#160;</td>
			<td>Forward</td>
			<td>Reverse</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pdgfra (Mouse)</td>
			<td>CTCAGCTGTCTCCTCACAgG</td>
			<td>CAACGCATCTCAGAGAAAAGG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pdgfa (Mouse)</td>
			<td>TGTGCCCATTCGCAGGAAGAG</td>
			<td>TTGGCCACCTTGACACTGCG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>36B4(Mouse)</td>
			<td>TGCTGAACATCTCCCCCTTCTC</td>
			<td colspan="2">TCTCCACAGACAATGCCAGGAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ucp1</td>
			<td>ACTGCCACACCTCCAGTCATT</td>
			<td>CTTTGCCTCACTCAGGATTGG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Application</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keyence BZ-X700</td>
			<td>Keyence</td>
			<td colspan="2">Imaging brown adipocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>Dissociate BAT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System</td>
			<td>Applied Biosystem</td>
			<td>Quantitative PCR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Odyssey Fc Imaging system</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>Western blot immaging</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolating brown adipocytes from murine interscapular brown adipose tissue for gene and protein expression analysis

Le tissu adipeux brun (MTD) est responsable de la thermogenèse non frissonnante chez les mammifères, et les adipocytes bruns (BA) sont les unités fonctionnelles des MTD. Les BA contiennent à la fois des gouttelettes lipidiques multiloculaires et des mitochondries abondantes, et ils expriment la protéine de découplage 1 (UCP1). Les BA sont classés en deux sous-types en fonction de leur origine : les BA classiques dérivés d’embryons (ABAc) et les BA dérivés d’adipocytes blancs. En raison de leur densité relativement faible, les BA ne peuvent pas être isolés des MTD avec la méthode de centrifugation traditionnelle. Dans cette étude, une nouvelle méthode a été développée pour isoler les BA de souris pour l’analyse de l’expression des gènes et des protéines. Dans ce protocole, les MTD interscapulaires de souris adultes ont été digérées avec une solution de collagénase et de dispase, et les BA dissociés ont été enrichis avec une solution d’iodixanol à 6%. Les BA isolés ont ensuite été lysés avec le réactif Trizol pour l’isolement simultané de l’ARN, de l’ADN et des protéines. Après isolement de l’ARN, la phase organique du lysat a été utilisée pour l’extraction des protéines. Nos données ont montré que la solution d’iodixanol à 6% enrichissait efficacement les BA sans interférer avec les études de suivi sur l’expression des gènes et des protéines. Le facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGF) est un facteur de croissance qui régule la croissance et la prolifération des cellules mésenchymateuses. Par rapport au tissu adipeux brun, les BA isolés avaient une expression significativement plus élevée de Pdgfa. En résumé, cette nouvelle méthode fournit une plate-forme pour étudier la biologie des adipocytes bruns au niveau d’un seul type cellulaire.

Préparation de la MTD interacapulaire pour l’isolement des adipocytes bruns Le processus d’isolement des adipocytes bruns (BA) est illustré à la figure 1A. L’ensemble du processus, de la préparation des MTD et des solutions de digestion/séparation à l’obtention de BA isolés, prendra environ 4 h.
Chez les souris adultes, la MTD abondante existe dans la région interscapulaire. Cette MTD interscapulaire (iBAT) est recouverte de cou...

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Isolating Brown Adipocytes from Murine Interscapular Brown Adipose Tissue for Gene and Protein Expression Analysis

Cette étude décrit une nouvelle méthode d’isolement des adipocytes bruns murins pour l’analyse de l’expression des gènes et des protéines.

Isolement des adipocytes bruns du tissu adipeux brun interscapulaire murin pour l’analyse de l’expression génique et protéique

Brown adipose tissue (BAT) is responsible for non-shivering thermogenesis in mammals, and brown adipocytes (BAs) are the functional units of BAT. BAs ...

Pour étudier les aspects biologiques du tissu adipeux brun, il est essentiel de nettoyer la taille adipeuse brune purifiée. Actuellement, aucune purification de taille adipeuse brune n’est venue et les masses sont disponibles. Dans cette étude, nous avons élaboré un protocole simple pour résoudre ce problème.Maintenant, une compétence est requise pour ce protocole. Il nécessite beaucoup moins de matériaux d’étude que d’autres méthodes et la taille adipeuse brune purifiée peut être directement utilisée pour l’analyse de l’expression des gènes et des protéines. Ce protocole fournit une nouvelle méthode pour étudier la biologie de la taille adipeuse brune classique.Il peut également être appliqué pour étudier le processus de brunissement des adipocytes blancs. La démonstration de la procédure sera Amanda, une assistante de recherche de mon laboratoire. Commencez par placer la fiole contenant la MTD et la solution de digestion sur un agitateur magnétique à 60 rotations par minute dans un incubateur à 35 degrés Celsius pendant 30 minutes.Utilisez une pipette d’un millilitre pour perturber les amas de tissus agrégés de tranches de MTD autour de la barre d’agitateur. Après la digestion, placez un filtre de crépine de 70 micromètres sur un tube à centrifuger propre de 50 millilitres et pipette environ quatre millilitres de suspension cellulaire à travers la crépine. Ensuite, lavez-le avec quatre millilitres de solution d’iodixanol à 12%.Pipeter de haut en bas pour mélanger les cellules avec une solution d’iodixanol, puis transférer le mélange de cellules dans deux tubes à essai en polystyrène transparent de cinq millilitres. Placez les tubes de polystyrène contenant le mélange cellulaire sur de la glace pendant une heure, ce qui provoque la formation d’une couche sur le dessus des BA par les BA. Retirez 20 microlitres des BA isolés pour l’examen au microscope.Pour l’isolement de l’ARN et des protéines, pipeter la couche BA dans deux tubes microcentriques de 1,7 millilitre. Ensuite, retirez délicatement la solution iodixonale excessive sans perturber la couche BA. Ensuite, ajoutez un millilitre de TRIzol dans la solution cellulaire pour isoler simultanément l’ARN, l’ADN et les protéines et mélanger suffisamment pour lyser les cellules.Pour séparer les phases, ajoutez 200 microlitres de chloroforme et centrifugez dans le tube à 9 981 g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Après centrifugation, utiliser la phase aqueuse pour l’isolement de l’ARN. Transférez 300 microlitres de la phase organique dans un tube microcentrifuge de deux millilitres et ajoutez 750 microlitres d’éthanol à 100%.Après avoir vortex pendant 10 secondes, ajoutez 200 microlitres de 1-Bromo-3-chloropropane et vortex à nouveau pendant 10 secondes. Ajouter 600 microlitres d’eau distillée double avant de vorer pendant 10 secondes. Laisser reposer la solution mélangée pendant 10 minutes à température ambiante.Après centrifugation, ajouter 9,981 G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Les phases seront séparées avec la phase protéique localisée dans la couche intermédiaire. Retirer la solution aqueuse supérieure et ajouter un millilitre d’éthanol à 100% dans la solution restante.Après centrifugation à 9, 981 G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius, jeter le surnageant et laver la pastille avec un millilitre d’éthanol à 100%. Centrifuger à 9, 981 G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Après avoir retiré le surnageant, sécher à l’air libre le granulé pendant 10 minutes à température ambiante et mesurer le poids du granulé humide.Ajouter une solution de FDS à 1% dans un rapport de 20 microlitres par milligramme de granulés. Dissoudre complètement la pastille en mettant le tube dans un shaker chauffé à 55 degrés Celsius et 11 G pendant cinq à 10 minutes. Dans le protocole, du PBS contenant 3 % de BSA a été utilisé pour séparer les BA des MTD.Les cellules isolées étaient en forme de framboise avec des gouttelettes lipidiques multiloculaires à l’intérieur et étaient tdTom positives, confirmant qu’il s’agissait de BA. La protéine a été isolée des BA avec un protocole GTPC amélioré et a ensuite été examinée avec un gel SDS-PAGE. Une bande dominante associée à la BSA a été observée dans l’échantillon de BA, suggérant son interférence dans l’extraction des protéines.Pour éviter les interférences BSA, une solution iodixonal à 6% a été utilisée pour l’isolement des BA, qui avaient une forme typique de framboise et contenaient des gouttelettes lipidiques multiloculaires. Les protéines extraites de ces BA ont été bien séparées dans le gel SDS-PAGE. Ces cellules se sont avérées tdTomato positives alors que les cellules récupérées à partir de la pastille étaient tdTomato négatives sans gouttelettes lipidiques évidentes, suggérant une séparation efficace des BA des cellules non adipeuses.Dans l’analyse de l’expression génique, les niveaux d’ARNm de UCP1 et PDGFA étaient significativement plus élevés dans les BA isolés. Mais l’ARNm de PDGFRA n’a été détecté que dans les MTD. La protéine UCP1 a été trouvée enrichie dans des BA isolés.L’EDGFR alpha a été détecté dans les MTD, mais pas dans les BA isolées. Ces résultats confirment l’efficacité de la méthode d’isolement des BA et démontrent que les BA isolés conviennent aux études d’expression génique et protéique. Lorsque vous essayez ce protocole, utilisez un tampon de digestion frais pour dissocier le tissu adipeux brun et éviter la formation d’amas tissulaires pendant la période de digestion.Cette nouvelle méthode facilite l’étude de la biologie du tissu adipeux brun au niveau du robinet unicellulaire. En appliquant cette méthode, on peut effectuer des études d’expression GN et protéique avec des adipocytes bruns purs disséquant précisément le programme d’expression génique des adipocytes bruns, sans se soucier de la contamination à l’origine par des cellules non adipeuses.

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Isolation of Adipose Tissue Immune Cells

Isolement de tissu adipeux cellules immunitaires

The discovery of increased macrophage infiltration in  the adipose tissue (AT) of obese rodents and humans has led to an  intensification of interest in ...

Isolation of Murine Peritoneal Macrophages to Carry Out Gene Expression Analysis Upon Toll-like Receptors Stimulation

Isolement d&#39;anticorps murins péritonéale macrophages pour effectuer Analyse expression génique Sur Toll-like récepteurs Stimulation

During infection and inflammation, circulating monocytes leave the bloodstream and migrate into tissues, where they differentiate into macrophages. ...

Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials

Les analyses qualitatives et quantitatives pour la détection et la caractérisation des antimicrobiens en protéines

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods ...

SILAC Based Proteomic Characterization of Exosomes from HIV-1 Infected Cells

SILAC Based protéomique Caractérisation des exosomes du VIH-1 des cellules infectées

Proteomics is the large-scale analysis of proteins. Proteomic techniques, such as liquid chromatography tandem mass spectroscopy (LC-MS/MS), can ...

Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System

Isoler des Lymphocytes du système immunitaire Intestinal souris petit

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to ...

Isolation, Expansion, and Adipogenic Induction of CD34+CD31+ Endothelial Cells from Human Omental and Subcutaneous Adipose Tissue

Isolement, Expansion et adipocytaire Induction de CD34 + CD31 + des cellules endothéliales du tissu adipeux humain épiploïques et sous-cutanée

Obesity is accompanied by an extensive remodeling of adipose tissue primarily via adipocyte hypertrophy. Extreme adipocyte growth results in a poor ...