Name: isolating brown adipocytes from murine interscapular brown adipose tissue for gene and protein expression analysis
Uploaded: 2021-03-12T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolating Brown Adipocytes from Murine Interscapular Brown Adipose Tissue for Gene and Protein Expression Analysis at JoVE.com

Z. Lin נתמך על ידי המכונים הלאומיים לבריאות HL138454-01 וקרנות מכון המחקר הרפואי הבונים החופשיים.

כל העכברים הוחזקו בתנאים נטולי פתוגנים, וכל ההליכים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC). UCP1::Cre9 ורוזה 26tdTomato עכברים קווים13 דווחו בעבר. כל העכברים הוחזקו בטמפרטורת החדר עם מחזור אור/חושך של 12 שעות.
1. הכנת התמיסה ורקמת השומן ה...

<ol>
	<li>Zwick, R. K., Guerrero-Juarez, C. F., Horsley, V., Plikus, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomical,+physiological,+and+functional+diversity+of+adipose+tissue.">Anatomical, physiological, and functional diversity of adipose tissue.</a> Cell Metabolism. 27, 68-83 (2018).</li><li>Symonds, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brown+adipose+tissue+growth+and+development.">Brown adipose tissue growth and development.</a> Scientifica. 2013, 305763 (2013).</li><li>Giralt, M., Villarroya, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=White,+brown,+beige/brite:+Different+adipose+cells+for+different+functions.">White, brown, beige/brite: Different adipose cells for different functions.</a> Endocrinology. 154, 2992-3000 (2013).</li><li>Cannon, B., Nedergaard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brown+adipose+tissue:+function+and+physiological+significance.">Brown adipose tissue: function and physiological significance.</a> Physiological Reviews. 84, 277-359 (2004).</li><li>Cinti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adipose+organ.">The adipose organ.</a> Prostaglandins, Leukotrienes and Essential Fatty Acids. 73, 9-15 (2005).</li><li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beige+adipocytes+are+a+distinct+type+of+thermogenic+fat+cell+in+mouse+and+human.">Beige adipocytes are a distinct type of thermogenic fat cell in mouse and human.</a> Cell. 150, 366-376 (2012).</li><li>Cypess, A. M., Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brown+fat+as+a+therapy+for+obesity+and+diabetes.">Brown fat as a therapy for obesity and diabetes.</a> Current Opinion in Endocrinology, Diabetes and Obesity. 17, 143-149 (2010).</li><li>Schoettl, T., Fischer, I. P., Ussar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+adipose+tissue+in+development+and+metabolic+function.">Heterogeneity of adipose tissue in development and metabolic function.</a> Journal of Experimental Biology. 221, (2018).</li><li>Kong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IRF4+is+a+key+thermogenic+transcriptional+partner+of+PGC-1&#945;.">IRF4 is a key thermogenic transcriptional partner of PGC-1&#945;.</a> Cell. 158, 69-83 (2014).</li><li>Lee, Y. H., Petkova, A. P., Konkar, A. A., Granneman, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+origins+of+cold-induced+brown+adipocytes+in+adult+mice.">Cellular origins of cold-induced brown adipocytes in adult mice.</a> The FASEB Journal. 29, 286-299 (2015).</li><li>Kim, W. -. S., Park, H. -. S., Sung, J. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pivotal+role+of+PDGF+and+its+receptor+isoforms+in+adipose-derived+stem+cells.">The pivotal role of PDGF and its receptor isoforms in adipose-derived stem cells.</a> Histology and Histopathology. 30 (7), 793-799 (2015).</li><li>Hagberg, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+of+mouse+and+human+adipocytes+for+the+analysis+of+browning+and+cellular+heterogeneity.">Flow cytometry of mouse and human adipocytes for the analysis of browning and cellular heterogeneity.</a> Cell Report. 24, 2746-2756 (2018).</li><li>Madisen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+and+high-throughput+Cre+reporting+and+characterization+system+for+the+whole+mouse+brain.">A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain.</a> Nature Neuroscience. 13, 133-140 (2010).</li><li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid.">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Analytical biochemistry. 150, 76-85 (1985).</li><li>Chey, S., Claus, C., Liebert, U. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+method+for+simultaneous+isolation+of+proteins+and+nucleic+acids.">Improved method for simultaneous isolation of proteins and nucleic acids.</a> Analytical Biochemistry. 411, 164-166 (2011).</li><li>Ford, T., Graham, J., Rickwood, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iodixanol:+A+nonionic+iso-osmotic+centrifugation+medium+for+the+formation+of+self-generated+gradients.">Iodixanol: A nonionic iso-osmotic centrifugation medium for the formation of self-generated gradients.</a> Analytical Biochemistry. 220, 360-366 (1994).</li><li>Kovacovicova, K., Vinciguerra, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+senescent+cells+by+iodixanol+(OptiPrep)+density+gradient-based+separation.">Isolation of senescent cells by iodixanol (OptiPrep) density gradient-based separation.</a> Cell Proliferation. 52, 12674 (2019).</li><li>Lock, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=versatile+manufacturing+of+recombinant+adeno-associated+viral+vectors+at+scale.">versatile manufacturing of recombinant adeno-associated viral vectors at scale.</a> Human Gene Therapy. 21, 1259-1271 (2010).</li><li>Marin, R. D., Crespo-Garcia, S., Wilson, A. M., Sapieha, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RELi+protocol:+Optimization+for+protein+extraction+from+white,+brown,+and+beige+adipose+tissues.">RELi protocol: Optimization for protein extraction from white, brown, and beige adipose tissues.</a> MethodsX. 6, 918-928 (2019).</li><li>Sonna, L. A., Fujita, J., Gaffin, S. L., Lilly, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invited+Review:+effects+of+heat+and+cold+stress+on+mammalian+gene+expression.">Invited Review: effects of heat and cold stress on mammalian gene expression.</a> Journal of Applied Physiology. 92, 1725-1742 (2002).</li><li>Gensch, N., Borchardt, T., Schneider, A., Riethmacher, D., Braun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+autonomous+myogenic+cell+populations+revealed+by+ablation+of+Myf5-expressing+cells+during+mouse+embryogenesis.">Different autonomous myogenic cell populations revealed by ablation of Myf5-expressing cells during mouse embryogenesis.</a> Development. 135, 1597-1604 (2008).</li></ol>

במחקר זה פותחה שיטה חדשה לבידוד BAs לניתוח ביטוי גנים וחלבונים.
בפרוטוקול בידוד BAs שפורסם, נעשה שימוש בפתרון BSA של 3% להעשרת BAs12. עם זאת, לא ניתן היה להשתמש ישירות ב-BAs המועשר שהושגו על ידי פרוטוקול זה שפורסם לצורך ניתוח ביטוי חלבונים. הסיבה לכך היא שה-BSA המרוכז הקיים ?...

גם לעכברים וגם לבני אדם יש שני סוגים של רקמות שומן: רקמת שומן לבנה (WAT) ורקמת שומן חומה (BAT)1. WAT מאחסן אנרגיה בצורה של טריגליצרידים באדיפוציטים לבנים, והאדיפוציטים החומים (BAs) של BAT מפזרים אנרגיה כימית כחום2. בהתבסס על מקורם ההתפתחותי, BAs מסווגים עוד יותר ל-BAs קלאסיים (cBAs) שנוצרו במהלך התפתחות העובר ול-BAs שמקורם באדיפוציטים לבנים (תאי בז'/בריט, שהומרו מאדיפוציטים לבנים בתנאי עקה)3. BAs הם רב-לוקולריים ומבטאים את החלבון התרמוגני שאינו מתחבר לחלבון 1 (UCP1)4. מחסן BAT אינטרסקפולרי (iBAT) הוא אחד ממחסני ה-cBAs העיקריים ביונקים קטנים5, בעוד שתאי בז' מפוזרים בתוך WAT6. 
בשל אופי פיזור האנרגיה שלהם, BAs קיבלו תשומת לב רבה כיעד טיפולי להפחתת השמנת יתר7. כדי לנצל את BAs לצורך טיפול בהשמנת יתר, חיוני להבין את המנגנונים המולקולריים השולטים בתפקוד, בהישרדות ובגיוס של BAs. רקמות שומן כולל BAT ו- WAT הן הטרוגניות. מלבד אדיפוציטים, רקמות השומן מכילות סוגי תאים רבים אחרים, כגון תאי אנדותל, תאי גזע מזנכימליים ומקרופאגים8. למרות שקיימים כלים גנטיים לדלדול ספציפי של גנים מועמדים בעכברים BAs, כגון UCP1::Cre line9, טכניקות לטיהור BAs מ-BAT או WAT מוגבלות, מה שמקשה על חקר BAs ברמה של תא יחיד. בנוסף, ללא קבלת BAs טהורים, היחסים בין BAs לבין אלה שאינם BAs לא יהיו מוגדרים בבירור. לדוגמה, קולטן גורם גדילה אלפא (PDGFRα) שמקורו בטסיות משמש כסמן לתאים מזנכימליים לא מובחנים, והוא מתבטא בתאי האנדותל והאינטרסטיציאליים של BAT. ב-BAT בלחץ קר, תאי אב חיוביים PDGFRα מולידים BAs10 חדש. PDGFRα מופעל על ידי הליגנד PDGF שלו, גורם גדילה המווסת את הצמיחה וההתרבות של תאים מזנכימליים11; עם זאת, לא ברור אם BAs משפיעים על ההתנהגות של תאי אב חיוביים PDGFRα על ידי הפרשת PDGF. 
לאחרונה פורסם פרוטוקול בידוד BAs, המבוסס על מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנציה (FACS)12. בפרוטוקול זה, נעשה שימוש בתמיסת אלבומין בסרום בקר (BSA) כדי להפריד בין BAs ללא BAs, וה-BAs המועשרים טוהרו עוד יותר על ידי FACS. היישום של פרוטוקול זה מוגבל על-ידי הדרישה של תהליך FACS, המסתמך הן על ציוד והן על חוויות פעולה של FACS. במחקר זה פותח פרוטוקול חדש לבידוד BAs מ-BAT. ה-BAs המבודדים על ידי פרוטוקול זה יכולים לשמש ישירות למחקרי ביטוי גנים וחלבונים. יתר על כן, נתונים ממחקר זה מצביעים על כך ש- BAs הם משאב PDGF מרכזי.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antigen</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PPAR&#947;</td>
			<td>LSBio</td>
			<td>Ls-C368478</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDGFRa</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-398206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UCP1</td>
			<td>R&#38;D system</td>
			<td>IC6158P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemical and solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type II</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17101015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Bromo-3-chloropropane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B62404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)&#160;</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>A-421-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>CT1330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>IB05040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II, protease</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5693</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>EB0107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>IB15724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiQuant Universal Green qPCR Master Mix</td>
			<td>LifeSct</td>
			<td>LS01131905Y</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride Hexahydrate</td>
			<td>Boston BioProducts</td>
			<td>P-855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OneScrip Plus cDNA Synthesis SuperMix</td>
			<td>ABM</td>
			<td>G454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep (Iodixanol)</td>
			<td>Cosmo Bio USA</td>
			<td>AXS-1114542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10x)</td>
			<td>Caisson Labs</td>
			<td>PBL07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (1x)</td>
			<td>Caisson Labs</td>
			<td>PBL06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Boston BioProducts</td>
			<td>P-1435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SimplyBlue safe Stain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC6060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>75746</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol reagent</td>
			<td>Life technoologies</td>
			<td>15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene name (Species)&#160;</td>
			<td>Forward</td>
			<td>Reverse</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pdgfra (Mouse)</td>
			<td>CTCAGCTGTCTCCTCACAgG</td>
			<td>CAACGCATCTCAGAGAAAAGG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pdgfa (Mouse)</td>
			<td>TGTGCCCATTCGCAGGAAGAG</td>
			<td>TTGGCCACCTTGACACTGCG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>36B4(Mouse)</td>
			<td>TGCTGAACATCTCCCCCTTCTC</td>
			<td colspan="2">TCTCCACAGACAATGCCAGGAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ucp1</td>
			<td>ACTGCCACACCTCCAGTCATT</td>
			<td>CTTTGCCTCACTCAGGATTGG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Application</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keyence BZ-X700</td>
			<td>Keyence</td>
			<td colspan="2">Imaging brown adipocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>Dissociate BAT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System</td>
			<td>Applied Biosystem</td>
			<td>Quantitative PCR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Odyssey Fc Imaging system</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>Western blot immaging</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolating brown adipocytes from murine interscapular brown adipose tissue for gene and protein expression analysis

רקמת שומן חום (BAT) אחראית לתרמוגנזה שאינה רועדת ביונקים, ואדיפוציטים חומים (BAs) הם היחידות הפונקציונליות של BAT. BAs מכילים גם טיפות ליפידים מולטילוקולריות וגם מיטוכונדריה בשפע, והם מבטאים חלבון 1 (UCP1) שאינו מתמזג. BAs מסווגים לשני תתי-סוגים בהתבסס על מקורם: BAs קלאסיים שמקורם בעוברים (cBAs) ו-BAs שמקורם באדיפוציטים לבנים. בשל צפיפותם הנמוכה יחסית, לא ניתן לבודד BAs מ- BAT בשיטת צנטריפוגה מסורתית. במחקר זה פותחה שיטה חדשה לבידוד BAs מעכברים לצורך ניתוח ביטוי גנים וחלבונים. בפרוטוקול זה, BAT בין-סקפולרי מעכברים בוגרים עוכל בתמיסת קולגן ותמיסת Dispase, וה-BAs המנותקים הועשרו בתמיסת יודיקסנול של 6%. לאחר מכן, BAs מבודדים הוכנסו לריאגנט Trizol לבידוד סימולטני של RNA, DNA וחלבון. לאחר בידוד RNA, השלב האורגני של הליזאט שימש למיצוי חלבונים. הנתונים שלנו הראו שתמיסת יודיקסנול 6% העשירה ביעילות BAs מבלי להפריע למחקרי מעקב אחר גנים וביטוי חלבונים. גורם גדילה שמקורו בטסיות דם (PDGF) הוא גורם גדילה המווסת את הצמיחה וההתרבות של תאים מזנכימליים. בהשוואה לרקמת השומן החומה, ל-BAs המבודדים היה ביטוי גבוה יותר באופן משמעותי של Pdgfa. לסיכום, שיטה חדשה זו מספקת פלטפורמה לחקר הביולוגיה של אדיפוציטים חומים ברמה של תא יחיד.

הכנת BAT אינטראקפולרי לבידוד אדיפוציטים חומים תהליך הבידוד של האדיפוציטים החומים (BAs) מתואר באיור 1A. התהליך כולו, החל מהכנת BAT ופתרונות עיכול/הפרדה ועד לקבלת BAs מבודדים ייקח כ-4 שעות.
בעכברים בוגרים, BAT בשפע קיים באזור הבין-שבדי. ה-BAT הבין-סקפולרי הזה (iBA...

Watch this Scientific Journal Video about Isolating Brown Adipocytes from Murine Interscapular Brown Adipose Tissue for Gene and Protein Expression Analysis at JoVE.com

Isolating Brown Adipocytes from Murine Interscapular Brown Adipose Tissue for Gene and Protein Expression Analysis

מחקר זה מתאר שיטה חדשה לבידוד אדיפוציטים חומים מורין לניתוח ביטוי גנים וחלבונים.

בידוד אדיפוציטים חומים מרקמת שומן חום אינטרסקפולרית של מורין לניתוח ביטוי גנים וחלבונים

Brown adipose tissue (BAT) is responsible for non-shivering thermogenesis in mammals, and brown adipocytes (BAs) are the functional units of BAT. BAs ...

כדי לחקור את ההיבטים הביולוגיים של רקמת השומן החום, חיוני לנקות את גודל השומן החום המטוהר. נכון לעכשיו לא הגיע טיהור גודל השומן החום וההמונים זמינים. במחקר זה פיתחנו פרוטוקול פשוט לטיפול בבעיה זו.כעת, נדרשת מיומנות אחת לפרוטוקול זה. הוא זקוק להרבה פחות חומרי לימוד מאשר שיטות אחרות, וגודל השומן החום המטוהר יכול לשמש ישירות לניתוח ביטוי גנים וחלבונים. פרוטוקול זה מספק שיטה חדשה לחקר הביולוגיה של גודל השומן החום הקלאסי.זה יכול להיות מיושם גם כדי לחקור תהליך השחמה אדיפוציטים לבנים. מי שתדגים את ההליך תהיה אמנדה, עוזרת מחקר מהמעבדה שלי. התחילו בהנחת הבקבוקון עם BAT ותמיסת עיכול על מערבל מגנטי ב-60 סיבובים לדקה באינקובטור של 35 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.השתמשו בפיפטה של מיליליטר אחד כדי לשבש את גושי הרקמה המצטברים של פרוסות BAT סביב מוט המערבל. לאחר העיכול, מניחים מסנן מסננת של 70 מיקרומטר על גבי צינור צנטריפוגה נקי של 50 מיליליטר ופיפטה סביב ארבעה מיליליטר של תרחיף תאים דרך המסננת. ואז לשטוף אותו עם ארבעה מיליליטר של 12% יודיקסנול פתרון.פיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב את התאים עם תמיסת יודיקסנול ואז להעביר את תערובת התאים לשתי מבחנות פוליסטירן שקופות של חמישה מיליליטר. מניחים את צינורות הפוליסטירן המכילים את תערובת התאים על קרח למשך שעה אחת, מה שגורם ל-BAs ליצור שכבה בחלק העליון. הוציאו 20 מיקרוליטרים של ה-BAs המבודדים לבדיקת מיקרוסקופ.עבור בידוד RNA וחלבונים, פיפטה את שכבת BA לתוך שני צינורות microcenterfuge 1.7 מיליליטר. לאחר מכן הסר בזהירות את התמיסה היודית המוגזמת מבלי לשבש את שכבת ה- BA. לאחר מכן הוסיפו מיליליטר אחד של TRIzol לתמיסת התא כדי לבודד בו זמנית RNA, DNA וחלבון ולערבב מספיק כדי ללכלך את התאים.כדי להפריד בין הפאזות, הוסף 200 מיקרוליטרים של כלורופורם וצנטריפוגה לצינור ב 9, 981 G במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר צנטריפוגה, השתמש בפאזה המימית לבידוד RNA. מעבירים 300 מיקרוליטרים של הפאזה האורגנית לצינור מיקרוצנטריפוגה של שני מיליליטר ומוסיפים 750 מיקרוליטרים של 100% אתנול.לאחר מערבולת במשך 10 שניות, להוסיף 200 microliters של 1-Bromo-3-chloropropane מערבולת שוב במשך 10 שניות. הוסיפו 600 מיקרוליטרים של מים מזוקקים כפולים לפני המערבולת למשך 10 שניות. תנו לתמיסה המעורבת לעמוד במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.לאחר צנטריפוגה, להוסיף 9, 981 G במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. השלבים יופרדו כאשר שלב החלבון ימוקם בשכבה האמצעית. הסר את התמיסה המימית העליונה והוסף מיליליטר אחד של 100% אתנול לתוך התמיסה הנותרת.לאחר צנטריפוגה ב 9, 981 גרם במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס, להשליך את supernatant ולשטוף את הכדור עם מיליליטר אחד של 100% אתנול. צנטריפוגה ב 9, 981 גרם במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר הסרת הסופרנטנט, יש לייבש את הכדור באוויר במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר ולמדוד את משקל הכדור הרטוב.הוסף תמיסת SDS של 1% ביחס של 20 מיקרוליטר למיליגרם של גלולה. ממיסים את הכדור לחלוטין על ידי הכנסת הצינור לשייקר מחומם בטמפרטורה של 55 מעלות צלזיוס ו-11 גרם למשך חמש עד 10 דקות. בפרוטוקול, PBS המכיל 3%BSA שימש להפרדת BAs מ- BAT.התאים המבודדים היו בצורת פטל עם טיפות שומנים רב-לוקולריות בפנים והיו חיוביים ל-tdTom, מה שאישר שהם BAs. החלבון בודד מה-BAs עם פרוטוקול GTPC משופר ולאחר מכן נבדק באמצעות ג'ל SDS-PAGE. פס דומיננטי הקשור ל-BSA נצפה בדגימת BA, מה שמרמז על התערבותו במיצוי חלבונים.כדי למנוע הפרעות BSA, נעשה שימוש בתמיסה של 6% יודיקסונאל לבידוד של BAs, שהייתה בעלת צורת פטל טיפוסית והכילה טיפות שומנים רב-לוקולריות. חלבונים שהופקו מ-BAs אלה הופרדו היטב בג'ל SDS-PAGE. תאים אלה נמצאו חיוביים ל-tdTomato ואילו תאים שהתאוששו מהכדור היו שליליים ל-tdTomato ללא טיפות שומנים ברורות, מה שמרמז על הפרדה יעילה של ה-BAs מהתאים שאינם שומנים.בניתוח ביטוי גנים, רמות ה-mRNA של UCP1 ו-PDGFA היו גבוהות משמעותית ב-BAs המבודדים. אבל ה-mRNA של PDGFRA זוהה רק ב-BAT. חלבון UCP1 נמצא מועשר ב-BAs מבודדים.EDGFR אלפא זוהה ב- BAT, אך לא ב- BAs מבודדים. תוצאות אלה מאשרות את יעילות השיטה לבידוד BAs ומוכיחות כי ה-BAs המבודדים מתאימים למחקרי ביטוי גנים וחלבונים. בעת ניסיון פרוטוקול זה, השתמש במאגר עיכול טרי כדי לנתק רקמת שומן חום ולמנוע היווצרות גושים ברקמה במהלך תקופת העיכול.שיטה חדשה זו מקלה על חקירת הביולוגיה של רקמת השומן החום ברמת ברז של תא בודד. על ידי יישום שיטה זו, ניתן לבצע מחקרי GN וביטוי חלבונים עם אדיפוציטים חומים טהורים המנתחים במדויק את תוכנית ביטוי הגנים של אדיפוציטים חומים, מבלי לדאוג לזיהום שמקורו בתאים שאינם שמנים.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Real-time Imaging of Leukotriene B4 Mediated Cell Migration and BLT1 Interactions with &beta;-arrestin

Real-time Imaging of Leukotriene B4 Mediated Cell Migration and BLT1 Interactions with ÃƒÅ½Ã‚Â²-arrestin

בזמן אמת הדמיה של leukotriene B 4 Cell Migration מתווכת ו BLT1 אינטראקציות עם β-arrestin

G-protein coupled receptors (GPCRs) belong to the seven transmembrane protein family and mediate the transduction of extracellular signals to ...

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

באמצעות הדמיה Bioluminescent לחקור סינרגיזם בין Streptococcus pneumoniae ו שפעת וירוס עכברים תינוקות

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

הבחנת תפקידים פונקציונליים של ביטוי גנים מתאים חיסוניים וללא חיסון בקוליטיס המאוס על ידי השתלת מח עצם

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice ...

Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer's Patches

וגם בידוד Immunostaining ימפוציטים ותאי דנדריטים מהתיקונים של Peyer Murine

Peyer's  patches (PPs) are integral components of the gut-associated lymphoid tissues  (GALT) and play a central role in intestinal immunosurveillance and ...

Isolation of Adipose Tissue Immune Cells

בידוד של תאים חיסוני רקמת שומן

The discovery of increased macrophage infiltration in  the adipose tissue (AT) of obese rodents and humans has led to an  intensification of interest in ...

Isolation of Murine Peritoneal Macrophages to Carry Out Gene Expression Analysis Upon Toll-like Receptors Stimulation

בידוד של הצפק Murine המקרופאגים לבצע ניתוח ביטוי גנים בעת ביצוע כמו אגרה רצפטורים הגירוי

During infection and inflammation, circulating monocytes leave the bloodstream and migrate into tissues, where they differentiate into macrophages. ...

Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials

מבחנים איכותיים וכמוני עבור זיהוי ואפיון של antimicrobials החלבון

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods ...

SILAC Based Proteomic Characterization of Exosomes from HIV-1 Infected Cells

אפיון proteomic SILAC מבוסס של Exosomes מ- HIV-1 תאים נגועים

Proteomics is the large-scale analysis of proteins. Proteomic techniques, such as liquid chromatography tandem mass spectroscopy (LC-MS/MS), can ...

Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System

לימפוציטים בידוד מן העכבר קטן המעי המערכת החיסונית

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to ...

Isolation, Expansion, and Adipogenic Induction of CD34+CD31+ Endothelial Cells from Human Omental and Subcutaneous Adipose Tissue

בידוד, הרחבה, אינדוקציה Adipogenic CD34 + CD31 + תאי אנדותל של אדם עם פגיעה ו התת-עורית שומן

Obesity is accompanied by an extensive remodeling of adipose tissue primarily via adipocyte hypertrophy. Extreme adipocyte growth results in a poor ...