Name: isolating brown adipocytes from murine interscapular brown adipose tissue for gene and protein expression analysis
Uploaded: 2021-03-12T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolating Brown Adipocytes from Murine Interscapular Brown Adipose Tissue for Gene and Protein Expression Analysis at JoVE.com

Z. Lin è stato supportato dai fondi del National Institutes of Health HL138454-01 e del Masonic Medical Research Institute.

Tutti i topi sono stati mantenuti in condizioni prive di agenti patogeni e tutte le procedure sono state approvate dal Masonic Medical Research Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). UCP1::Cre9 e Rosa 26tdTomato topi linee13 sono state segnalate in precedenza. Tutti i topi sono stati tenuti a temperatura ambiente con un ciclo luce/buio di 12 ore.
1. Preparazione delle soluzioni e del tessuto adiposo bruno (BAT)
<ol><li>...

<ol>
	<li>Zwick, R. K., Guerrero-Juarez, C. F., Horsley, V., Plikus, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomical,+physiological,+and+functional+diversity+of+adipose+tissue.">Anatomical, physiological, and functional diversity of adipose tissue.</a> Cell Metabolism. 27, 68-83 (2018).</li><li>Symonds, M. 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In questo studio è stato sviluppato un nuovo metodo per isolare i BA per l'analisi dell'espressione genica e proteica.
In un protocollo di isolamento BAs pubblicato, la soluzione BSA al 3% è stata utilizzata per arricchire BAs12. Tuttavia, i BA arricchiti ottenuti da questo protocollo pubblicato non potevano essere utilizzati direttamente per l'analisi dell'espressione proteica. Questo perché la BSA concentrata esistente nella soluzione di BA interferisce con l'estra...

Sia i topi che gli esseri umani hanno due tipi di tessuto adiposo: tessuto adiposo bianco (WAT) e tessuto adiposo bruno (BAT)1. WAT immagazzina energia sotto forma di trigliceridi negli adipociti bianchi e gli adipociti bruni (BA) di BAT dissipano l'energia chimica come calore2. In base alla loro origine evolutiva, i BA sono ulteriormente classificati in BA classici (cBA) che si sono formati durante lo sviluppo embrionale e BAs derivati da adipociti bianchi (cellule beige/brite, convertite da adipociti bianchi in condizioni di stress)3. I BA sono multiloculari ed esprimono la proteina termogena disaccoppiante proteina 1 (UCP1)4. Il deposito interscapolare BAT (iBAT) è uno dei principali depositi di cBA nei piccoli mammiferi5, mentre le cellule beige sono disperse all'interno di WAT6. 
A causa della loro natura di dissipazione di energia, i BA hanno ricevuto molta attenzione come obiettivo terapeutico per ridurre l'obesità7. Per sfruttare i BA allo scopo di trattare l'obesità, è essenziale comprendere i meccanismi molecolari che controllano la funzione, la sopravvivenza e il reclutamento dei BA. I tessuti adiposi tra cui BAT e WAT sono eterogenei. Ad eccezione degli adipociti, i tessuti adiposi contengono molti altri tipi di cellule, come le cellule endoteliali, le cellule staminali mesenchimali e i macrofagi8. Sebbene siano disponibili strumenti genetici per esaurire specificamente i geni candidati nei BA dei topi, come UCP1::Cre linea9, le tecniche per purificare i BA da BAT o WAT sono limitate, rendendo difficile studiare i BA a livello di tipo di singola cellula. Inoltre, senza ottenere BA puri, la relazione tra BA e non BA non sarà chiaramente delineata. Ad esempio, il recettore alfa del fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGFRα) è stato utilizzato come marker per le cellule mesenchimali indifferenziate ed è espresso nelle cellule endoteliali e interstiziali di BAT. Nelle BAT stressate a freddo, le cellule progenitrici PDGFRα positive danno origine a nuovi BA10. PDGFRα è attivato dal suo ligando PDGF, un fattore di crescita che regola la crescita e la proliferazione delle cellule mesenchimali11; tuttavia, non è chiaro se i BA influenzino il comportamento delle cellule progenitrici PDGFRα positive secernendo PDGF. 
Recentemente è stato pubblicato un protocollo di isolamento BAs, basato sulla selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS)12. In questo protocollo, la soluzione di albumina sierica bovina al 3% (BSA) è stata utilizzata per separare i BA dai non BA e i BA arricchiti sono stati ulteriormente purificati da FACS. L'applicazione di questo protocollo è limitata dal requisito del processo FACS, che si basa sia sulle apparecchiature che sulle esperienze operative FACS. In questo studio è stato sviluppato un nuovo protocollo per isolare i BA dalle BAT. I BA isolati da questo protocollo possono essere utilizzati direttamente per studi di espressione genica e proteica. Inoltre, i dati di questo studio suggeriscono che i BA sono una delle principali risorse del PDGF.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antigen</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PPAR&#947;</td>
			<td>LSBio</td>
			<td>Ls-C368478</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDGFRa</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-398206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UCP1</td>
			<td>R&#38;D system</td>
			<td>IC6158P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemical and solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type II</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17101015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Bromo-3-chloropropane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B62404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)&#160;</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>A-421-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>CT1330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>IB05040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II, protease</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5693</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>EB0107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>IB15724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiQuant Universal Green qPCR Master Mix</td>
			<td>LifeSct</td>
			<td>LS01131905Y</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride Hexahydrate</td>
			<td>Boston BioProducts</td>
			<td>P-855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OneScrip Plus cDNA Synthesis SuperMix</td>
			<td>ABM</td>
			<td>G454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep (Iodixanol)</td>
			<td>Cosmo Bio USA</td>
			<td>AXS-1114542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10x)</td>
			<td>Caisson Labs</td>
			<td>PBL07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (1x)</td>
			<td>Caisson Labs</td>
			<td>PBL06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Boston BioProducts</td>
			<td>P-1435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SimplyBlue safe Stain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC6060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>75746</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol reagent</td>
			<td>Life technoologies</td>
			<td>15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene name (Species)&#160;</td>
			<td>Forward</td>
			<td>Reverse</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pdgfra (Mouse)</td>
			<td>CTCAGCTGTCTCCTCACAgG</td>
			<td>CAACGCATCTCAGAGAAAAGG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pdgfa (Mouse)</td>
			<td>TGTGCCCATTCGCAGGAAGAG</td>
			<td>TTGGCCACCTTGACACTGCG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>36B4(Mouse)</td>
			<td>TGCTGAACATCTCCCCCTTCTC</td>
			<td colspan="2">TCTCCACAGACAATGCCAGGAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ucp1</td>
			<td>ACTGCCACACCTCCAGTCATT</td>
			<td>CTTTGCCTCACTCAGGATTGG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Application</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keyence BZ-X700</td>
			<td>Keyence</td>
			<td colspan="2">Imaging brown adipocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>Dissociate BAT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System</td>
			<td>Applied Biosystem</td>
			<td>Quantitative PCR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Odyssey Fc Imaging system</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>Western blot immaging</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolating brown adipocytes from murine interscapular brown adipose tissue for gene and protein expression analysis

Il tessuto adiposo bruno (BAT) è responsabile della termogenesi senza brividi nei mammiferi e gli adipociti bruni (BA) sono le unità funzionali della BAT. I BA contengono sia goccioline lipidiche multiloculari che abbondanti mitocondri ed esprimono la proteina 1 disaccoppiante (UCP1). I BA sono classificati in due sottotipi in base alla loro origine: BA classici derivati da embrioni (cBA) e BAs derivati da adipociti bianchi. A causa della loro densità relativamente bassa, i BA non possono essere isolati dalle BAT con il metodo di centrifugazione tradizionale. In questo studio, è stato sviluppato un nuovo metodo per isolare i BA dai topi per l'analisi dell'espressione genica e proteica. In questo protocollo, il BAT interscapolare di topi adulti è stato digerito con la soluzione di collagenasi e dispasi e i BA dissociati sono stati arricchiti con una soluzione di iodixanolo al 6%. I BA isolati sono stati quindi lisati con il reagente Trizol per l'isolamento simultaneo di RNA, DNA e proteine. Dopo l'isolamento dell'RNA, la fase organica del lisato è stata utilizzata per l'estrazione delle proteine. I nostri dati hanno mostrato che la soluzione di iodixanolo al 6% ha arricchito efficacemente i BA senza interferire con gli studi di espressione genica e proteica di follow-up. Il fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGF) è un fattore di crescita che regola la crescita e la proliferazione delle cellule mesenchimali. Rispetto al tessuto adiposo bruno, i BA isolati avevano un'espressione significativamente più elevata di Pdgfa. In sintesi, questo nuovo metodo fornisce una piattaforma per studiare la biologia degli adipociti bruni a livello di singola cellula.

Preparazione di BAT interacapulare per l'isolamento degli adipociti bruni Il processo di isolamento degli adipociti bruni (BA) è rappresentato nella Figura 1A. L'intero processo, dalla preparazione delle BAT e delle soluzioni di digestione/separazione all'ottenimento di BA isolati, richiederà circa 4 ore.
Nei topi adulti, esiste un'abbondante BAT nella regione interscapolare. Questo BAT interscapolare (iBAT) è coperto da strati muscolari e W...

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Isolating Brown Adipocytes from Murine Interscapular Brown Adipose Tissue for Gene and Protein Expression Analysis

Questo studio descrive un nuovo metodo per isolare gli adipociti bruni murini per l'analisi dell'espressione genica e proteica.

Isolamento di adipociti bruni da tessuto adiposo bruno interscapolare murino per l'analisi dell'espressione genica e proteica

Brown adipose tissue (BAT) is responsible for non-shivering thermogenesis in mammals, and brown adipocytes (BAs) are the functional units of BAT. BAs ...

Per studiare gli aspetti biologici del tessuto adiposo bruno, è essenziale eliminare le dimensioni adipose brune purificate. Attualmente non è venuto in purificazione di dimensioni adipose brune e le masse sono disponibili. In questo studio, abbiamo sviluppato un protocollo semplice per affrontare questo problema.Ora, sono richieste competenze per questo protocollo. Ha bisogno di molti meno materiali di studio rispetto ad altri metodi e la dimensione adiposa bruna purificata può essere utilizzata direttamente per l'analisi dell'espressione genica e proteica. Questo protocollo fornisce un nuovo metodo per studiare la biologia della classica dimensione adiposa bruna.Può anche essere applicato per studiare il processo di imbrunimento degli adipociti bianchi. A dimostrare la procedura sarà Amanda, un'assistente di ricerca del mio laboratorio. Iniziare posizionando il pallone con BAT e soluzione di digestione su un agitatore magnetico a 60 rotazioni al minuto in un incubatore a 35 gradi Celsius per 30 minuti.Utilizzare una pipetta da un millilitro per interrompere i grumi di tessuto aggregato di fette BAT attorno alla barra dell'agitatore. Dopo la digestione, posizionare un filtro filtrante da 70 micrometri sopra un tubo di centrifuga pulito da 50 millilitri e pipettare circa quattro millilitri di sospensione cellulare attraverso il filtro. Quindi lavarlo con quattro millilitri di soluzione di iodixanolo al 12%.Pipettare su e giù per mescolare le cellule con la soluzione di iodixanolo, quindi trasferire la miscela di cellule in due provette di polistirene trasparente da cinque millilitri. Posizionare i tubi di polistirene contenenti la miscela cellulare sul ghiaccio per un'ora, facendo sì che i BA formino uno strato sulla parte superiore. Estrarre 20 microlitri dei BA isolati per l'esame al microscopio.Per l'isolamento di RNA e proteine, pipettare lo strato di BA in due tubi microcenterfuge da 1,7 millilitri. Quindi rimuovere con attenzione la soluzione iodissonale eccessiva senza interrompere lo strato BA. Quindi aggiungere un millilitro di TRIzol nella soluzione cellulare per isolare simultaneamente RNA, DNA e proteine e mescolare sufficientemente per licare le cellule.Per separare le fasi, aggiungere 200 microlitri di cloroformio e centrifugare al tubo a 9.981 G per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Dopo la centrifugazione, utilizzare la fase acquosa per l'isolamento dell'RNA. Trasferire 300 microlitri della fase organica in un tubo di microcentrifuga da due millilitri e aggiungere 750 microlitri di etanolo al 100%.Dopo il vortice per 10 secondi, aggiungere 200 microlitri di 1-Bromo-3-cloropropano e vortice di nuovo per 10 secondi. Aggiungere 600 microlitri di acqua doppia distillata prima di vorticare per 10 secondi. Lasciare riposare la soluzione miscelata per 10 minuti a temperatura ambiente.Dopo la centrifugazione, aggiungere 9.981 G per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Le fasi saranno separate con la fase proteica localizzata nello strato intermedio. Rimuovere la soluzione acquosa superiore e aggiungere un millilitro di etanolo al 100% nella soluzione rimanente.Dopo la centrifugazione a 9.981 G per 10 minuti a quattro gradi Celsius, scartare il surnatante e lavare il pellet con un millilitro di etanolo al 100%. Centrifugare a 9, 981 g per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Dopo aver rimosso il surnatante, asciugare all'aria il pellet per 10 minuti a temperatura ambiente e misurare il peso del pellet umido.Aggiungere la soluzione SDS all'1% con un rapporto di 20 microlitri per milligrammo di pellet. Sciogliere completamente il pellet mettendo il tubo in uno shaker riscaldato a 55 gradi Celsius e 11 G per cinque o 10 minuti. Nel protocollo, PBS contenente il 3% di BSA è stato utilizzato per separare i BA dai BAT.Le cellule isolate erano a forma di lampone con goccioline lipidiche multiloculari all'interno ed erano tdTom positive, confermando che erano BA. La proteina è stata isolata dai BA con un protocollo GTPC migliorato ed è stata quindi esaminata con un gel SDS-PAGE. Una banda dominante associata alla BSA è stata osservata nel campione di BA, suggerendo la sua interferenza nell'estrazione delle proteine.Per evitare l'interferenza BSA, è stata utilizzata una soluzione iodissonale al 6% per l'isolamento dei BA, che avevano una tipica forma a lampone e contenevano goccioline lipidiche multiloculari. Le proteine estratte da questi BA erano ben separate nel gel SDS-PAGE. Queste cellule sono risultate essere tdTomato positive mentre le cellule recuperate dal pellet erano tdTomato negative senza evidenti goccioline lipidiche, suggerendo un'efficiente separazione dei BA dalle cellule non adipose.Nell'analisi dell'espressione genica, i livelli di mRNA di UCP1 e PDGFA erano significativamente più alti nei BA isolati. Ma l'mRNA di PDGFRA è stato rilevato solo in BAT. La proteina UCP1 è stata trovata arricchita in BA isolati.EDGFR alfa è stato rilevato in BAT, ma non in BA isolati. Questi risultati confermano l'efficacia del metodo per isolare i BA e dimostrano che i BA isolati sono adatti per studi di espressione genica e proteica. Quando si tenta questo protocollo, utilizzare un tampone di digestione fresco per dissociare il tessuto adiposo bruno ed evitare la formazione di grumi di tessuto durante il periodo di digestione.Questo nuovo metodo rende facile studiare la biologia del tessuto adiposo bruno su un livello di rubinetto di una singola cellula. Applicando questo metodo, è possibile eseguire studi di espressione di GN e proteine con adipociti bruni puri che sezionano con precisione il programma di espressione genica degli adipociti bruni, senza preoccuparsi della contaminazione originariamente da cellule non adipose.

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Isolamento di murini peritoneale macrofagi di effettuare analisi di espressione genica Al Toll-like recettori stimolazione

During infection and inflammation, circulating monocytes leave the bloodstream and migrate into tissues, where they differentiate into macrophages. ...

Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials

Saggi qualitativi e quantitativi per il rilevamento e la caratterizzazione di proteine ​​antimicrobici

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods ...

SILAC Based Proteomic Characterization of Exosomes from HIV-1 Infected Cells

SILAC Based proteomica Caratterizzazione di Esosomi da HIV-1 le cellule infette

Proteomics is the large-scale analysis of proteins. Proteomic techniques, such as liquid chromatography tandem mass spectroscopy (LC-MS/MS), can ...

Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System

Isolando i linfociti del sistema immunitario intestinale piccolo per Mouse

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to ...

Isolation, Expansion, and Adipogenic Induction of CD34+CD31+ Endothelial Cells from Human Omental and Subcutaneous Adipose Tissue

Isolamento, espansione e adipogenico induzione di CD34 + CD31 + cellule endoteliali dal tessuto adiposo umano omentale e sottocutaneo

Obesity is accompanied by an extensive remodeling of adipose tissue primarily via adipocyte hypertrophy. Extreme adipocyte growth results in a poor ...