Name: isolating brown adipocytes from murine interscapular brown adipose tissue for gene and protein expression analysis
Uploaded: 2021-03-12T14:30:00
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Z. Linは、国立衛生研究所HL138454-01とフリーメーソン医学研究所の資金によって支援されました。

すべてのマウスは病原体のない状態で維持され、すべての手順はフリーメーソン医学研究施設動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認されました。UCP1::Cre9 およびRosa 26tdTomatoes マウス系統13 が以前に報告された。すべてのマウスを12時間の明暗サイクルで室温に保ちました。
1.溶液と褐色脂肪組織(BAT)の準備
<ol><li>消化液?...

<ol>
	<li>Zwick, R. K., Guerrero-Juarez, C. F., Horsley, V., Plikus, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomical,+physiological,+and+functional+diversity+of+adipose+tissue.">Anatomical, physiological, and functional diversity of adipose tissue.</a> Cell Metabolism. 27, 68-83 (2018).</li><li>Symonds, M. 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M., Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brown+fat+as+a+therapy+for+obesity+and+diabetes.">Brown fat as a therapy for obesity and diabetes.</a> Current Opinion in Endocrinology, Diabetes and Obesity. 17, 143-149 (2010).</li><li>Schoettl, T., Fischer, I. 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K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid.">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Analytical biochemistry. 150, 76-85 (1985).</li><li>Chey, S., Claus, C., Liebert, U. 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本研究では、遺伝子およびタンパク質発現解析のためのBAを単離する新しい方法を開発しました。
公開されているBA分離プロトコルでは、3%BSA溶液を使用してBA12を濃縮しました。それにもかかわらず、この公開されたプロトコルによって達成された濃縮BAは、タンパク質発現分析に直接使用することはできませんでした。これは、BAs溶液に存在する濃縮BS...

マウスとヒトの両方に、白色脂肪組織(WAT)と褐色脂肪組織(BAT)の2種類の脂肪組織があります1。WATは白色脂肪細胞に中性脂肪の形でエネルギーを蓄え、BATの褐色脂肪細胞(BA)は化学エネルギーを熱2として放散します。BAは、その発生起源に基づいて、胚発生中に形成される古典的なBA(cBA)と、ストレス条件下で白色脂肪細胞から変換された白色脂肪細胞由来のBA(ベージュ/ブライト細胞)にさらに分類されます3。BAは多房性であり、熱発生タンパク質脱共役タンパク質1(UCP1)4を発現します。肩甲骨間BAT(iBAT)デポーは、小型哺乳類の主要なcBAデポの1つです5が、ベージュ色の細胞はWAT6内に分散しています。 
エネルギーを散逸させる性質上、BAは肥満を減らすための治療標的として多くの注目を集めています7。肥満の治療を目的としてBAを利用するためには、BAの機能、生存、および動員を制御する分子メカニズムを理解することが不可欠です。BATおよびWATを含む脂肪組織は不均一である。脂肪細胞を除いて、脂肪組織には内皮細胞、間葉系幹細胞、マクロファージなど、他の多くの細胞タイプが含まれています8。UCP1::Creライン9など、マウスBAの候補遺伝子を特異的に枯渇させる遺伝的ツールが利用可能であるが、BATまたはWATからBAを精製する技術は限られており、単一細胞レベルでBAを研究することは困難である。さらに、純粋なBAを取得しないと、BAと非BAの関係が明確に描写されません。例えば、血小板由来成長因子受容体α(PDGFRα)は、未分化間葉系細胞のマーカーとして使用されており、BATの内皮細胞や間質細胞で発現しています。低温ストレスBATでは、PDGFRα陽性前駆細胞が新しいBA10を生じさせる。PDGFRαは、間葉系細胞の成長および増殖を調節する成長因子であるリガンドPDGFによって活性化される11;しかし、BAがPDGFを分泌することによってPDGFRα陽性前駆細胞の挙動に影響を与えるかどうかは不明である。 
最近、蛍光活性化セルソーティング(FACS)12に基づくBAs分離プロトコルが公開されました。このプロトコルでは、3%ウシ血清アルブミン(BSA)溶液を使用してBAを非BAから分離し、濃縮BAをFACSでさらに精製しました。このプロトコルの適用は、機器とFACSの両方の操作経験に依存するFACSプロセスの要件によって制限されます。本研究では、BATからBAを分離するための新しいプロトコルが開発されました。このプロトコルによって単離されたBAは、遺伝子およびタンパク質発現研究に直接使用できます。さらに、この研究のデータは、BAが主要なPDGFリソースであることを示唆しています。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antigen</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PPAR&#947;</td>
			<td>LSBio</td>
			<td>Ls-C368478</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDGFRa</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-398206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UCP1</td>
			<td>R&#38;D system</td>
			<td>IC6158P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemical and solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type II</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17101015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Bromo-3-chloropropane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B62404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)&#160;</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>A-421-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>CT1330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>IB05040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II, protease</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5693</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>EB0107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>IB15724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiQuant Universal Green qPCR Master Mix</td>
			<td>LifeSct</td>
			<td>LS01131905Y</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride Hexahydrate</td>
			<td>Boston BioProducts</td>
			<td>P-855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OneScrip Plus cDNA Synthesis SuperMix</td>
			<td>ABM</td>
			<td>G454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep (Iodixanol)</td>
			<td>Cosmo Bio USA</td>
			<td>AXS-1114542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10x)</td>
			<td>Caisson Labs</td>
			<td>PBL07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (1x)</td>
			<td>Caisson Labs</td>
			<td>PBL06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Boston BioProducts</td>
			<td>P-1435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SimplyBlue safe Stain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC6060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>75746</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol reagent</td>
			<td>Life technoologies</td>
			<td>15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene name (Species)&#160;</td>
			<td>Forward</td>
			<td>Reverse</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pdgfra (Mouse)</td>
			<td>CTCAGCTGTCTCCTCACAgG</td>
			<td>CAACGCATCTCAGAGAAAAGG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pdgfa (Mouse)</td>
			<td>TGTGCCCATTCGCAGGAAGAG</td>
			<td>TTGGCCACCTTGACACTGCG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>36B4(Mouse)</td>
			<td>TGCTGAACATCTCCCCCTTCTC</td>
			<td colspan="2">TCTCCACAGACAATGCCAGGAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ucp1</td>
			<td>ACTGCCACACCTCCAGTCATT</td>
			<td>CTTTGCCTCACTCAGGATTGG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Application</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keyence BZ-X700</td>
			<td>Keyence</td>
			<td colspan="2">Imaging brown adipocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>Dissociate BAT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System</td>
			<td>Applied Biosystem</td>
			<td>Quantitative PCR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Odyssey Fc Imaging system</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>Western blot immaging</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolating brown adipocytes from murine interscapular brown adipose tissue for gene and protein expression analysis

褐色脂肪組織(BAT)は哺乳類の非震え熱発生に関与しており、褐色脂肪細胞(BA)はBATの機能単位です。BAは多房性脂肪滴と豊富なミトコンドリアの両方を含み、脱共役タンパク質1(UCP1)を発現します。BAは、その起源に基づいて、胚由来の古典的BA(cBA)と白色脂肪細胞由来のBAの2つのサブタイプに分類されます。BAは密度が比較的低いため、従来の遠心分離法ではBATから分離できません。本研究では、遺伝子およびタンパク質発現解析のためにマウスからBAを単離する新しい方法を開発しました。このプロトコルでは、成体マウスの肩甲骨間BATをコラゲナーゼおよびディスパーゼ溶液で消化し、解離したBAを6%ヨージキサノール溶液で濃縮した。次に、単離したBAをTrizol試薬で溶解し、RNA、DNA、およびタンパク質を同時に単離しました。RNA単離後、ライセートの有機相をタンパク質抽出に使用した。私たちのデータは、6%ヨージキサノール溶液がフォローアップ遺伝子およびタンパク質発現研究を妨げることなくBAを効率的に濃縮することを示しました。血小板由来成長因子(PDGF)は、間葉系細胞の増殖および増殖を調節する成長因子である。褐色脂肪組織と比較して、単離されたBAは Pdgfaの発現が有意に高かった。要約すると、この新しい方法は、褐色脂肪細胞の生物学を単一の細胞型レベルで研究するためのプラットフォームを提供します。

褐色脂肪細胞単離のための肩甲間BATの調製 褐色脂肪細胞(BA)の単離プロセスを 図1Aに示します。BATおよび消化/分離溶液の調製から単離されたBAの取得までのプロセス全体には、約4時間かかります。
成体マウスでは、肩甲骨間領域に豊富なBATが存在する。この肩甲骨間BAT(iBAT)は、筋肉層とWATで覆われています(図1B...

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Isolating Brown Adipocytes from Murine Interscapular Brown Adipose Tissue for Gene and Protein Expression Analysis

この研究では、遺伝子およびタンパク質発現解析のためにマウス褐色脂肪細胞を単離する新しい方法について説明します。

遺伝子およびタンパク質発現解析のためのマウス肩甲間褐色脂肪組織からの褐色脂肪細胞の単離(英語)

Brown adipose tissue (BAT) is responsible for non-shivering thermogenesis in mammals, and brown adipocytes (BAs) are the functional units of BAT. BAs ...

褐色脂肪組織の生物学的側面を調べるためには、精製された褐色脂肪サイズをクリアすることが不可欠です。現在、褐色脂肪サイズの精製は行われておらず、質量が利用可能です。この研究では、この問題に対処するための簡単なプロトコルを開発しました。現在、このプロトコルには1つのスキルが必要です。他の方法よりもはるかに少ない研究材料を必要とし、精製された褐色脂肪サイズは遺伝子およびタンパク質発現分析に直接使用できます。このプロトコルは、古典的な褐色脂肪サイズの生物学を研究するための新しい方法を提供します。また、白色脂肪細胞の褐変過程の研究にも適用することができる。手順を実演するのは、私の研究室の研究助手であるアマンダです。BATと消化溶液を入れたフラスコを、摂氏35度のインキュベーター内で毎分60回転のマグネチックスターラーに30分間置くことから始めます。1ミリリットルのピペットを使用して、スターラーバーの周りのBATスライスの凝集組織塊を破壊します。消化後、清潔な50ミリリットルの遠沈管の上に70マイクロメートルのストレーナーフィルターを置き、ストレーナーを通して約4ミリリットルの細胞懸濁液をピペットで送ります。次に、4ミリリットルの12%ヨージキサノール溶液で洗浄します。ピペットを上下に動かして細胞をヨージキサノール溶液と混合し、細胞混合物を2本の透明な5ミリリットルのポリスチレン試験管に移します。セル混合物を含むポリスチレンチューブを氷上に1時間置き、BAを上部に層を形成します。顕微鏡検査のために20マイクロリットルの分離されたBAを取り出します。RNAとタンパク質を単離するには、BA層を2本の1.7ミリリットルのマイクロセンターフュージチューブにピペットで入れます。次に、BA層を乱すことなく、過剰なヨウ素溶液を慎重に除去します。次に、1ミリリットルのTRIzolを細胞溶液に加え、RNA、DNA、およびタンパク質を同時に分離し、細胞を溶解するのに十分な混合を行います。相を分離するには、200マイクロリットルのクロロホルムと遠心分離機を9, 981 Gで摂氏4度で10分間チューブに加えます。遠心分離後、RNA単離には水相を使用します。300マイクロリットルの有機相を2ミリリットルの微量遠心チューブに移し、750マイクロリットルの100%エタノールを加える。10秒間ボルテックスした後、200マイクロリットルの1-ブロモ-3-クロロプロパンを加え、再び10秒間ボルテックスします。600マイクロリットルの二重蒸留水を加えてから、10秒間ボルテックスします。混合溶液を室温で10分間放置する。遠心分離後、摂氏4度で10分間9, 981 Gを加えます。相は、中間層に局在するタンパク質相と分離されます。一番上の水溶液を取り除き、残りの溶液に1ミリリットルの100%エタノールを加えます。摂氏4度で10分間9, 981 gで遠心分離した後、上清を捨て、ペレットを1ミリリットルの100%エタノールで洗浄します。摂氏4度で10分間9, 981 gで遠心分離します。上澄み液を除去した後、ペレットを室温で10分間風乾し、湿潤ペレットの重量を測定する。ペレット1ミリグラムあたり20マイクロリットルの比率で1%SDS溶液を追加します。チューブを摂氏55度と11Gの加熱シェーカーに5〜10分間入れて、ペレットを完全に溶解します。プロトコルでは、3%BSAを含むPBSを使用してBAをBATから分離しました。単離された細胞はラズベリー型で、内部に多房性脂肪滴があり、tdTom陽性であり、BAであることが確認されました。タンパク質は、改良されたGTPCプロトコルを用いてBAから単離され、次いでSDS-PAGEゲルで検査された。BSAに関連する優勢なバンドがBAサンプルで観察され、タンパク質抽出におけるBSAの干渉を示唆しています。BSA干渉を回避するために、典型的なラズベリー形状を有し、多房性脂肪滴を含むBAの単離に6%ヨージキソナール溶液を使用した。これらのBAから抽出されたタンパク質は、SDS-PAGEゲル中で十分に分離された。これらの細胞はtdTomato陽性であるのに対し、ペレットから回収された細胞はtdTomatoes陰性であり、明らかな脂肪滴はなく、非脂肪細胞からのBAの効率的な分離が示唆された。遺伝子発現解析では、UCP1およびPDGFAのmRNAレベルは、単離されたBAで有意に高かった。しかし、PDGFRAのmRNAはBATでのみ検出されました。UCP1タンパク質は、単離されたBAに富んでいることがわかりました。EDGFRアルファはBATでは検出されましたが、単離されたBAでは検出されませんでした。これらの結果は、BAの単離方法の効率を確認し、単離されたBAが遺伝子およびタンパク質発現研究に適していることを示しています。このプロトコルを試みるときは、新鮮な消化バッファーを使用して褐色脂肪組織を解離し、消化期間中の組織塊の形成を回避します。この新しい方法により、単一細胞タップレベルで褐色脂肪組織の生物学を簡単に調査できます。この方法を応用することで、褐色脂肪細胞遺伝子発現プログラムを精密に解剖した純褐色脂肪細胞を用いたGNおよびタンパク質発現研究を、もともと無脂肪細胞由来のコンタミネーションを心配することなく行うことができる。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Real-time Imaging of Leukotriene B4 Mediated Cell Migration and BLT1 Interactions with &beta;-arrestin

Real-time Imaging of Leukotriene B4 Mediated Cell Migration and BLT1 Interactions with ÃƒÅ½Ã‚Â²-arrestin

ロイコトリエンBのリアルタイムイメージング 4介在細胞の移行とβ-アレスチンとBLT1の相互作用

G-protein coupled receptors (GPCRs) belong to the seven transmembrane protein family and mediate the transduction of extracellular signals to ...

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

の間に相乗効果を調査するために生物発光イメージングを使用して肺炎球菌幼児マウスで>とインフルエンザウイルス

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

骨髄移植によるマウス大腸炎における免疫および非免疫細胞からの遺伝子発現の機能的役割を差別化

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice ...

Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer's Patches

マウスのパイエル板のリンパ球や樹状細胞を単離し、免疫染色

Peyer's  patches (PPs) are integral components of the gut-associated lymphoid tissues  (GALT) and play a central role in intestinal immunosurveillance and ...

Isolation of Adipose Tissue Immune Cells

脂肪組織の免疫細胞の単離

The discovery of increased macrophage infiltration in  the adipose tissue (AT) of obese rodents and humans has led to an  intensification of interest in ...

Isolation of Murine Peritoneal Macrophages to Carry Out Gene Expression Analysis Upon Toll-like Receptors Stimulation

Toll様受容体刺激時の遺伝子発現解析を行うためにマウス腹腔マクロファージの単離

During infection and inflammation, circulating monocytes leave the bloodstream and migrate into tissues, where they differentiate into macrophages. ...

Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials

定性的および定量的検出のためのアッセイおよびタンパク質の抗菌薬のキャラクタリゼーション

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods ...

SILAC Based Proteomic Characterization of Exosomes from HIV-1 Infected Cells

HIV-1感染細胞からのエキソソームのSILACベースのプロテオミクス特性評価

Proteomics is the large-scale analysis of proteins. Proteomic techniques, such as liquid chromatography tandem mass spectroscopy (LC-MS/MS), can ...

Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System

マウス小腸管免疫系からリンパ球を分離すること

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to ...

Isolation, Expansion, and Adipogenic Induction of CD34+CD31+ Endothelial Cells from Human Omental and Subcutaneous Adipose Tissue

分離、拡張、および CD31 cd34 陽性 + + ひと大網と皮下脂肪組織から血管内皮細胞の脂肪分化誘導

Obesity is accompanied by an extensive remodeling of adipose tissue primarily via adipocyte hypertrophy. Extreme adipocyte growth results in a poor ...