Name: isolating brown adipocytes from murine interscapular brown adipose tissue for gene and protein expression analysis
Uploaded: 2021-03-12T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolating Brown Adipocytes from Murine Interscapular Brown Adipose Tissue for Gene and Protein Expression Analysis at JoVE.com

Z. Lin ble støttet av National Institutes of Health HL138454-01 og Masonic Medical Research Institute midler.

Alle mus ble opprettholdt i patogenfrie forhold, og alle prosedyrer ble godkjent av Masonic Medical Research Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). UCP1::Cre9 og Rosa 26tdTomato mus linje13 ble rapportert tidligere. Alle musene ble holdt i romtemperatur med en 12 timers lys / mørk syklus.
1. Klargjøring av oppløsninger og brunt fettvev (BAT)
<ol><li>Forbered fordøyelsesløsning og separasjonsløsning i 15 ml sentrif...

<ol>
	<li>Zwick, R. K., Guerrero-Juarez, C. F., Horsley, V., Plikus, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomical,+physiological,+and+functional+diversity+of+adipose+tissue.">Anatomical, physiological, and functional diversity of adipose tissue.</a> Cell Metabolism. 27, 68-83 (2018).</li><li>Symonds, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brown+adipose+tissue+growth+and+development.">Brown adipose tissue growth and development.</a> Scientifica. 2013, 305763 (2013).</li><li>Giralt, M., Villarroya, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=White,+brown,+beige/brite:+Different+adipose+cells+for+different+functions.">White, brown, beige/brite: Different adipose cells for different functions.</a> Endocrinology. 154, 2992-3000 (2013).</li><li>Cannon, B., Nedergaard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brown+adipose+tissue:+function+and+physiological+significance.">Brown adipose tissue: function and physiological significance.</a> Physiological Reviews. 84, 277-359 (2004).</li><li>Cinti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adipose+organ.">The adipose organ.</a> Prostaglandins, Leukotrienes and Essential Fatty Acids. 73, 9-15 (2005).</li><li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beige+adipocytes+are+a+distinct+type+of+thermogenic+fat+cell+in+mouse+and+human.">Beige adipocytes are a distinct type of thermogenic fat cell in mouse and human.</a> Cell. 150, 366-376 (2012).</li><li>Cypess, A. M., Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brown+fat+as+a+therapy+for+obesity+and+diabetes.">Brown fat as a therapy for obesity and diabetes.</a> Current Opinion in Endocrinology, Diabetes and Obesity. 17, 143-149 (2010).</li><li>Schoettl, T., Fischer, I. P., Ussar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+adipose+tissue+in+development+and+metabolic+function.">Heterogeneity of adipose tissue in development and metabolic function.</a> Journal of Experimental Biology. 221, (2018).</li><li>Kong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IRF4+is+a+key+thermogenic+transcriptional+partner+of+PGC-1&#945;.">IRF4 is a key thermogenic transcriptional partner of PGC-1&#945;.</a> Cell. 158, 69-83 (2014).</li><li>Lee, Y. H., Petkova, A. P., Konkar, A. A., Granneman, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+origins+of+cold-induced+brown+adipocytes+in+adult+mice.">Cellular origins of cold-induced brown adipocytes in adult mice.</a> The FASEB Journal. 29, 286-299 (2015).</li><li>Kim, W. -. S., Park, H. -. S., Sung, J. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pivotal+role+of+PDGF+and+its+receptor+isoforms+in+adipose-derived+stem+cells.">The pivotal role of PDGF and its receptor isoforms in adipose-derived stem cells.</a> Histology and Histopathology. 30 (7), 793-799 (2015).</li><li>Hagberg, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+of+mouse+and+human+adipocytes+for+the+analysis+of+browning+and+cellular+heterogeneity.">Flow cytometry of mouse and human adipocytes for the analysis of browning and cellular heterogeneity.</a> Cell Report. 24, 2746-2756 (2018).</li><li>Madisen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+and+high-throughput+Cre+reporting+and+characterization+system+for+the+whole+mouse+brain.">A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain.</a> Nature Neuroscience. 13, 133-140 (2010).</li><li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid.">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Analytical biochemistry. 150, 76-85 (1985).</li><li>Chey, S., Claus, C., Liebert, U. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+method+for+simultaneous+isolation+of+proteins+and+nucleic+acids.">Improved method for simultaneous isolation of proteins and nucleic acids.</a> Analytical Biochemistry. 411, 164-166 (2011).</li><li>Ford, T., Graham, J., Rickwood, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iodixanol:+A+nonionic+iso-osmotic+centrifugation+medium+for+the+formation+of+self-generated+gradients.">Iodixanol: A nonionic iso-osmotic centrifugation medium for the formation of self-generated gradients.</a> Analytical Biochemistry. 220, 360-366 (1994).</li><li>Kovacovicova, K., Vinciguerra, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+senescent+cells+by+iodixanol+(OptiPrep)+density+gradient-based+separation.">Isolation of senescent cells by iodixanol (OptiPrep) density gradient-based separation.</a> Cell Proliferation. 52, 12674 (2019).</li><li>Lock, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=versatile+manufacturing+of+recombinant+adeno-associated+viral+vectors+at+scale.">versatile manufacturing of recombinant adeno-associated viral vectors at scale.</a> Human Gene Therapy. 21, 1259-1271 (2010).</li><li>Marin, R. D., Crespo-Garcia, S., Wilson, A. M., Sapieha, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RELi+protocol:+Optimization+for+protein+extraction+from+white,+brown,+and+beige+adipose+tissues.">RELi protocol: Optimization for protein extraction from white, brown, and beige adipose tissues.</a> MethodsX. 6, 918-928 (2019).</li><li>Sonna, L. A., Fujita, J., Gaffin, S. L., Lilly, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invited+Review:+effects+of+heat+and+cold+stress+on+mammalian+gene+expression.">Invited Review: effects of heat and cold stress on mammalian gene expression.</a> Journal of Applied Physiology. 92, 1725-1742 (2002).</li><li>Gensch, N., Borchardt, T., Schneider, A., Riethmacher, D., Braun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+autonomous+myogenic+cell+populations+revealed+by+ablation+of+Myf5-expressing+cells+during+mouse+embryogenesis.">Different autonomous myogenic cell populations revealed by ablation of Myf5-expressing cells during mouse embryogenesis.</a> Development. 135, 1597-1604 (2008).</li></ol>

I denne studien ble det utviklet en ny metode for å isolere BAs for gen- og proteinuttrykksanalyse.
I en publisert BAs-isolasjonsprotokoll ble 3% BSA-løsning brukt til å berike BAs12. Likevel kunne de berikede BAene oppnådd av denne publiserte protokollen ikke brukes direkte til proteinuttrykksanalyse. Dette skyldes at den konsentrerte BSA som eksisterer i BAs-løsningen forstyrrer oppfølging av proteinekstraksjon. Når BAene som er beriket i 3% BSA-løsningen ble ...

Både mus og mennesker har to typer fettvev: hvitt fettvev (WAT) og brunt fettvev (BAT)1. WAT lagrer energi i form av triglyserider i hvite adipocytter, og de brune adipocyttene (BAs) av BAT sprer kjemisk energi som varme2. Basert på deres utviklingsmessige opprinnelse, er BAs videre kategorisert i klassiske BAs (cBAs) som dannet under embryoutvikling og hvite adipocytter avledet BAs (beige / brite celler, omdannet fra hvite adipocytter under stressforhold)3. BA er multilokulære og uttrykker det termogene proteinet som kobler fra protein 1 (UCP1)4. Interscapular BAT (iBAT) depot er et av de primære cBAs depotene i små pattedyr5, mens beige celler er spredt i WAT6. 
På grunn av deres natur å spre energi, har BAs fått mye oppmerksomhet som et terapeutisk mål for å redusere fedme7. For å utnytte BAs med det formål å behandle fedme, er det viktig å forstå de molekylære mekanismene som styrer BAs funksjon, overlevelse og rekruttering. Fettvev inkludert BAT og WAT er heterogene. Bortsett fra adipocytter inneholder fettvev mange andre celletyper, som endotelceller, mesenkymale stamceller og makrofager8. Selv om genetiske verktøy for å spesifikt tømme kandidatgener hos mus BAs er tilgjengelige, for eksempel UCP1: : Cre linje9, er teknikker for rensing av BAs fra BAT eller WAT begrenset, noe som gjør det vanskelig å studere BAs på encellet type nivå. I tillegg, uten å oppnå rene BAer, vil forholdet mellom BAs og ikke-BAs ikke være klart avgrenset. For eksempel har blodplate-avledet vekstfaktorreseptor alfa (PDGFRα) blitt brukt som en markør for udifferensierte mesenkymale celler, og det uttrykkes i endotel- og interstitielle celler av BAT. Ved kuldestresset BAT gir PDGFRα-positive stamceller opphav til nye BAs10. PDGFRα aktiveres av liganden PDGF, en vekstfaktor som regulerer vekst og spredning av mesenkymale celler11; Det er imidlertid uklart om BA påvirker oppførselen til PDGFRα-positive stamceller ved å utskille PDGF. 
Nylig er det publisert en BAs-isolasjonsprotokoll, som er basert på fluorescensaktivert cellesortering (FACS)12. I denne protokollen ble 3 % bovin serumalbumin (BSA)-løsning brukt til å skille BAer fra ikke-BAer, og de berikede BAene ble ytterligere renset av FACS. Anvendelsen av denne protokollen er begrenset av kravet til FACS-prosess, som er avhengig av både utstyr og FACS-driftsopplevelser. I denne studien ble det utviklet en ny protokoll for isolering av BAer fra BAT. BAene isolert av denne protokollen kan brukes direkte til gen- og proteinuttrykksstudier. Videre tyder data fra denne studien på at BA er en stor PDGF-ressurs.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antigen</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PPAR&#947;</td>
			<td>LSBio</td>
			<td>Ls-C368478</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDGFRa</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-398206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UCP1</td>
			<td>R&#38;D system</td>
			<td>IC6158P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemical and solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type II</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17101015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Bromo-3-chloropropane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B62404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)&#160;</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>A-421-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>CT1330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>IB05040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II, protease</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5693</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>EB0107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>IB15724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiQuant Universal Green qPCR Master Mix</td>
			<td>LifeSct</td>
			<td>LS01131905Y</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride Hexahydrate</td>
			<td>Boston BioProducts</td>
			<td>P-855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OneScrip Plus cDNA Synthesis SuperMix</td>
			<td>ABM</td>
			<td>G454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep (Iodixanol)</td>
			<td>Cosmo Bio USA</td>
			<td>AXS-1114542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10x)</td>
			<td>Caisson Labs</td>
			<td>PBL07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (1x)</td>
			<td>Caisson Labs</td>
			<td>PBL06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Boston BioProducts</td>
			<td>P-1435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SimplyBlue safe Stain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC6060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>75746</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol reagent</td>
			<td>Life technoologies</td>
			<td>15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene name (Species)&#160;</td>
			<td>Forward</td>
			<td>Reverse</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pdgfra (Mouse)</td>
			<td>CTCAGCTGTCTCCTCACAgG</td>
			<td>CAACGCATCTCAGAGAAAAGG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pdgfa (Mouse)</td>
			<td>TGTGCCCATTCGCAGGAAGAG</td>
			<td>TTGGCCACCTTGACACTGCG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>36B4(Mouse)</td>
			<td>TGCTGAACATCTCCCCCTTCTC</td>
			<td colspan="2">TCTCCACAGACAATGCCAGGAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ucp1</td>
			<td>ACTGCCACACCTCCAGTCATT</td>
			<td>CTTTGCCTCACTCAGGATTGG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Application</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keyence BZ-X700</td>
			<td>Keyence</td>
			<td colspan="2">Imaging brown adipocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>Dissociate BAT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System</td>
			<td>Applied Biosystem</td>
			<td>Quantitative PCR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Odyssey Fc Imaging system</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>Western blot immaging</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolating brown adipocytes from murine interscapular brown adipose tissue for gene and protein expression analysis

Brunt fettvev (BAT) er ansvarlig for ikke-rystende termogenese hos pattedyr, og brune adipocytter (BA) er de funksjonelle enhetene til BAT. BA inneholder både multilokulære lipiddråper og rikelig mitokondrier, og de uttrykker frakobling av protein 1 (UCP1). BAs er kategorisert i to undertyper basert på deres opprinnelse: embryo avledet klassisk BAs (cBAs) og hvite adipocytter avledet BAs. På grunn av deres relativt lave tetthet kan BAer ikke isoleres fra BAT med tradisjonell sentrifugeringsmetode. I denne studien ble det utviklet en ny metode for å isolere BA fra mus for gen- og proteinuttrykksanalyse. I denne protokollen ble interscapular BAT fra voksne mus fordøyd med kollagenase og dispase løsning, og de dissosierte BAene ble beriket med 6% jodxanoloppløsning. Isolerte BAer ble deretter lysnet med Trizol-reagens for samtidig isolering av RNA, DNA og protein. Etter RNA-isolasjon ble den organiske fasen av lysatet brukt til proteinekstraksjon. Våre data viste at 6% jodxanolløsning effektivt beriket BA uten å forstyrre oppfølgingsgen- og proteinuttrykksstudier. Blodplateavledet vekstfaktor (PDGF) er en vekstfaktor som regulerer vekst og spredning av mesenkymale celler. Sammenlignet med brunt fettvev hadde isolerte BAer signifikant høyere uttrykk for Pdgfa. Oppsummert gir denne nye metoden en plattform for å studere biologien til brune adipocytter på et enkelt celletypenivå.

Fremstilling av interacapular BAT for isolasjon av brune adipocytter Isolasjonsprosessen for brune adipocytter (BAs) er avbildet i figur 1A. Hele prosessen, fra å forberede flaggermus og fordøyelses- / separasjonsløsninger for å oppnå isolerte BAer, vil ta rundt 4 timer.
Hos voksne mus finnes rikelig BAT i interscapular regionen. Denne interscapular BAT (iBAT) er dekket av muskellag og WAT (figur 1B). Før du ...

Watch this Scientific Journal Video about Isolating Brown Adipocytes from Murine Interscapular Brown Adipose Tissue for Gene and Protein Expression Analysis at JoVE.com

Isolating Brown Adipocytes from Murine Interscapular Brown Adipose Tissue for Gene and Protein Expression Analysis

Denne studien beskriver en ny metode for å isolere murine brune adipocytter for gen- og proteinuttrykksanalyse.

Isolering av brune adipocytter fra murine interscapular brunt fettvev for gen- og proteinuttrykksanalyse

Brown adipose tissue (BAT) is responsible for non-shivering thermogenesis in mammals, and brown adipocytes (BAs) are the functional units of BAT. BAs ...

For å undersøke de biologiske aspektene ved brunt fettvev, er det viktig å fjerne renset brun fettstørrelse. Foreløpig ingen kom i brun fett størrelse rensing og massene er tilgjengelige. I denne studien utviklet vi en enkel protokoll for å løse dette problemet.Nå kreves det én kompetanse for denne protokollen. Det trenger mye færre studiematerialer enn andre metoder, og den rensede brune fettstørrelsen kan brukes direkte til gen- og proteinuttrykksanalyse. Denne protokollen gir en ny metode for å studere biologien til klassisk brun fettstørrelse.Det kan også brukes til å studere hvite adipocytter bruningsprosess. Demonstrere prosedyren vil være Amanda, en forskningsassistent fra laboratoriet mitt. Start med å plassere kolben med BAT og fordøyelsesløsningen på en magnetisk omrører ved 60 rotasjoner per minutt i en 35 grader Celsius inkubator i 30 minutter.Bruk en milliliter pipette for å forstyrre de aggregerte vevsklumpene av BAT-skiver rundt omrørerstangen. Etter fordøyelsen, plasser et 70 mikrometer silfilter på toppen av et rent 50 milliliter sentrifugerrør og pipette rundt fire milliliter cellesuspensjon gjennom silen. Vask den deretter med fire milliliter 12% iodixanol-løsning.Pipette opp og ned for å blande cellene med jodxanoloppløsning overfører deretter celleblandingen til to klare fem milliliter polystyren reagensrør. Plasser polystyrenrørene som inneholder celleblandingen på is i en time, noe som får BAene til å danne et lag på toppen. Ta ut 20 mikroliter av de isolerte BAene for mikroskopundersøkelse.For RNA og proteinisolasjon, pipetter BA-laget i to 1,7 milliliter mikrocenterfugerør. Fjern deretter den overdrevne iodixonale løsningen forsiktig uten å forstyrre BA-laget. Deretter tilsettes en milliliter TRIzol i celleoppløsningen for samtidig å isolere RNA, DNA og protein og blandes tilstrekkelig til å lyce cellene.For å skille fasene, tilsett 200 mikroliter kloroform og sentrifuge til røret ved 9.981 G i 10 minutter ved fire grader Celsius. Etter sentrifugering, bruk den vandige fasen for RNA-isolasjon. Overfør 300 mikroliter av den organiske fasen til et to milliliter mikrocentrifugerør og tilsett 750 mikroliter 100% etanol.Etter vortexing i 10 sekunder, tilsett 200 mikroliter 1-Bromo-3-klorpropan og virvel igjen i 10 sekunder. Tilsett 600 mikroliter dobbelt destillert vann før du virvler i 10 sekunder. La den blandede løsningen stå i 10 minutter ved romtemperatur.Etter sentrifugering, tilsett 9.981 G i 10 minutter ved fire grader Celsius. Fasene vil bli separert med proteinfasen lokalisert i mellomlaget. Fjern den øverste vandige løsningen og tilsett en milliliter 100% etanol i den gjenværende løsningen.Etter sentrifugering ved 9.981 G i 10 minutter ved fire grader Celsius, kast supernatanten og vask pelleten med en milliliter 100% etanol. Sentrifuge ved 9.981 G i 10 minutter ved fire grader Celsius. Etter å ha fjernet supernatanten, lufttørk pelleten i 10 minutter ved romtemperatur og mål vekten av den våte pelleten.Tilsett 1% SDS-løsning i forholdet 20 mikroliter per milligram pellet. Løs opp pelleten helt ved å sette røret i en oppvarmet shaker ved 55 grader Celsius og 11 G i fem til 10 minutter. I protokollen ble PBS som inneholdt 3% BSA brukt til å skille BA fra BAT.De isolerte cellene var bringebærformede med multilokulære lipiddråper inni og var tdTom-positive, noe som bekreftet at de var BAer. Protein ble isolert fra BAene med en forbedret GTPC-protokoll og ble deretter undersøkt med en SDS-PAGE-gel. Et dominerende bånd assosiert med BSA ble observert i BA-prøven, noe som tyder på interferens i proteinekstraksjon.For å unngå BSA-interferens ble en 6% iodixonal løsning brukt til isolering av BA, som hadde en typisk bringebærform og inneholdt multilokulære lipiddråper. Proteiner ekstrahert fra disse BAene ble godt separert i SDS-PAGE gelen. Disse cellene ble funnet å være tdTomato positive, mens celler gjenvunnet fra pelleten var tdTomato negative uten åpenbare lipiddråper, noe som tyder på effektiv separasjon av BAene fra de ikke-fete cellene.I genuttrykksanalyse var mRNA-nivåene av UCP1 og PDGFA signifikant høyere i de isolerte BAene. Men mRNA av PDGFRA ble bare påvist i BAT. UCP1-protein ble funnet beriket i isolerte BAer.EDGFR alfa ble påvist i BAT, men ikke i isolerte BAer. Disse resultatene bekrefter effektiviteten av metoden for å isolere BAs og viser at de isolerte BAene er egnet for gen- og proteinuttrykksstudier. Når du prøver denne protokollen, bruk fersk fordøyelsesbuffer for å dissosiere brunt fettvev og unngå dannelse av vevklumper i fordøyelsesperioden.Denne nye metoden gjør det enkelt å undersøke biologien til brunt fettvev på et enkeltcelletrykknivå. Ved å bruke denne metoden kan man utføre GN- og proteinuttrykksstudier med rene brune adipocytter som nøyaktig dissekerer brune adipocytter genuttrykksprogram, uten å bekymre seg for forurensning opprinnelig fra fettfrie celler.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Real-time Imaging of Leukotriene B4 Mediated Cell Migration and BLT1 Interactions with &beta;-arrestin

Real-time Imaging of Leukotriene B4 Mediated Cell Migration and BLT1 Interactions with ÃƒÅ½Ã‚Â²-arrestin

G-protein coupled receptors (GPCRs) belong to the seven transmembrane protein family and mediate the transduction of extracellular signals to ...

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

Skille funksjonelle roller av genuttrykk fra immune og ikke-immune celler i mus Kolitt av benmargstransplantasjon

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice ...

Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer's Patches

Isolere og farging Lymfocytter og dendrittiske celler fra Murine Peyer er Patches

Peyer's  patches (PPs) are integral components of the gut-associated lymphoid tissues  (GALT) and play a central role in intestinal immunosurveillance and ...

Isolation of Adipose Tissue Immune Cells

Isolering av fettvev immunceller

The discovery of increased macrophage infiltration in  the adipose tissue (AT) of obese rodents and humans has led to an  intensification of interest in ...

Isolation of Murine Peritoneal Macrophages to Carry Out Gene Expression Analysis Upon Toll-like Receptors Stimulation

Isolering av Murine peritonealmakrofager å gjennomføre Gene Expression Analysis Ved Toll-lignende reseptorer Stimulering

During infection and inflammation, circulating monocytes leave the bloodstream and migrate into tissues, where they differentiate into macrophages. ...

Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials

Kvalitative og kvantitative analyser for påvisning og karakterisering av Protein antimicrobials

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods ...

SILAC Based Proteomic Characterization of Exosomes from HIV-1 Infected Cells

SILAC basert proteomikk Karakterisering av Exosomes fra HIV-1 infiserte celler

Proteomics is the large-scale analysis of proteins. Proteomic techniques, such as liquid chromatography tandem mass spectroscopy (LC-MS/MS), can ...

Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System

Isolere lymfocytter fra musen liten Intestinal immunsystemet

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to ...

Isolation, Expansion, and Adipogenic Induction of CD34+CD31+ Endothelial Cells from Human Omental and Subcutaneous Adipose Tissue

Isolasjon, utvidelse og Adipogenic induksjon av CD34 + CD31 + endotelceller fra menneskelig Omental og underhud fettvev

Obesity is accompanied by an extensive remodeling of adipose tissue primarily via adipocyte hypertrophy. Extreme adipocyte growth results in a poor ...