Name: isolating brown adipocytes from murine interscapular brown adipose tissue for gene and protein expression analysis
Uploaded: 2021-03-12T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolating Brown Adipocytes from Murine Interscapular Brown Adipose Tissue for Gene and Protein Expression Analysis at JoVE.com

Z. Lin foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde HL138454-01 e fundos do Instituto de Pesquisa Médica Maçônica.

Todos os camundongos foram mantidos em condições livres de patógenos, e todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da pesquisa médica maçônica. UCP1::Cre9 e Rosa 26tdLinhagens de camundongos tomateiro13 foram relatadas anteriormente. Todos os camundongos foram mantidos à temperatura ambiente com um ciclo claro/escuro de 12 h.
1. Preparação das Soluções e do tecido adi...

<ol>
	<li>Zwick, R. K., Guerrero-Juarez, C. F., Horsley, V., Plikus, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomical,+physiological,+and+functional+diversity+of+adipose+tissue.">Anatomical, physiological, and functional diversity of adipose tissue.</a> Cell Metabolism. 27, 68-83 (2018).</li><li>Symonds, M. 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K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid.">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Analytical biochemistry. 150, 76-85 (1985).</li><li>Chey, S., Claus, C., Liebert, U. 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Neste estudo, um novo método de isolamento de BAs para análise de expressão gênica e proteica foi desenvolvido.
Em um protocolo de isolamento de BAs publicado, uma solução de BSA a 3% foi utilizada para enriquecer os BAs12. No entanto, os BAs enriquecidos alcançados por este protocolo publicado não puderam ser usados diretamente para a análise da expressão proteica. Isso ocorre porque a BSA concentrada existente na solução de BAs interfere no acompanhamento ...

Tanto camundongos quanto humanos possuem dois tipos de tecido adiposo: tecido adiposo branco (WAT) e tecido adiposo marrom (BAT)1. WAT armazena energia na forma de triglicerídeos em adipócitos brancos, e os adipócitos marrons (BAs) de MTD dissipam energia química como calor2. Com base em sua origem desenvolvimentista, os BAs são categorizados em BAs clássicos (cBAs) que se formaram durante o desenvolvimento embrionário e os BAs derivados de adipócitos brancos (células bege/brite, convertidas de adipócitos brancos sob condições de estresse)3. Os BAs são multiloculares e expressam a proteína termogênica de desacoplamento da proteína 1 (UCP1)4. O depósito de MTD interescapular (iBAT) é um dos principais depósitos de cBAs em pequenos mamíferos5, enquanto as células beges estão dispersas no WAT6. 
Devido à sua natureza de dissipação de energia, os BAs têm recebido muita atenção como alvo terapêutico para a redução da obesidade7. Para explorar os BAs com a finalidade de tratar a obesidade, é essencial entender os mecanismos moleculares que controlam a função, a sobrevivência e o recrutamento dos BAs. Os tecidos adiposos, incluindo MTD e MTD, são heterogêneos. Com exceção dos adipócitos, os tecidos adiposos contêm muitos outros tipos de células, como células endoteliais, células-tronco mesenquimais e macrófagos8. Embora ferramentas genéticas para esgotar especificamente genes candidatos em BAs de camundongos estejam disponíveis, como UCP1::Cre linha9, as técnicas para purificar BAs de BAT ou WAT são limitadas, dificultando o estudo de BAs em um nível de tipo de célula única. Além disso, sem a obtenção de BAs puros, a relação entre BAs e não-BAs não será claramente delineada. Por exemplo, o receptor alfa do fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGFRα) tem sido usado como um marcador para células mesenquimais indiferenciadas, e é expresso nas células endoteliais e intersticiais de BAT. Em MTD estressadas a frio, as células progenitoras positivas para PDGFRα dão origem a novas BAs10. O PDGFRα é ativado por seu ligante PDGF, fator de crescimento que regula o crescimento e a proliferação de células mesenquimais11; no entanto, não está claro se os BAs influenciam o comportamento das células progenitoras positivas para PDGFRα secretando PDGF. 
Recentemente, foi publicado um protocolo de isolamento de BAs, que se baseia na classificação celular ativada por fluorescência (FACS)12. Neste protocolo, a solução de albumina sérica bovina (BSA) a 3% foi usada para separar BAs de não-BAs, e os BAs enriquecidos foram purificados por FACS. A aplicação deste protocolo é limitada pela exigência do processo FACS, que depende de equipamentos e experiências de operação FACS. Neste estudo, um novo protocolo para o isolamento de BAs de MTD foi desenvolvido. Os BAs isolados por este protocolo podem ser usados diretamente para estudos de expressão gênica e proteica. Além disso, os dados deste estudo sugerem que os BAs são um importante recurso do PDGF.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antigen</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PPAR&#947;</td>
			<td>LSBio</td>
			<td>Ls-C368478</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDGFRa</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-398206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UCP1</td>
			<td>R&#38;D system</td>
			<td>IC6158P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemical and solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type II</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17101015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Bromo-3-chloropropane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B62404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)&#160;</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>A-421-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>CT1330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>IB05040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II, protease</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5693</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>EB0107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>IB15724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiQuant Universal Green qPCR Master Mix</td>
			<td>LifeSct</td>
			<td>LS01131905Y</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride Hexahydrate</td>
			<td>Boston BioProducts</td>
			<td>P-855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OneScrip Plus cDNA Synthesis SuperMix</td>
			<td>ABM</td>
			<td>G454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep (Iodixanol)</td>
			<td>Cosmo Bio USA</td>
			<td>AXS-1114542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10x)</td>
			<td>Caisson Labs</td>
			<td>PBL07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (1x)</td>
			<td>Caisson Labs</td>
			<td>PBL06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Boston BioProducts</td>
			<td>P-1435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SimplyBlue safe Stain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC6060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>75746</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol reagent</td>
			<td>Life technoologies</td>
			<td>15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene name (Species)&#160;</td>
			<td>Forward</td>
			<td>Reverse</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pdgfra (Mouse)</td>
			<td>CTCAGCTGTCTCCTCACAgG</td>
			<td>CAACGCATCTCAGAGAAAAGG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pdgfa (Mouse)</td>
			<td>TGTGCCCATTCGCAGGAAGAG</td>
			<td>TTGGCCACCTTGACACTGCG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>36B4(Mouse)</td>
			<td>TGCTGAACATCTCCCCCTTCTC</td>
			<td colspan="2">TCTCCACAGACAATGCCAGGAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ucp1</td>
			<td>ACTGCCACACCTCCAGTCATT</td>
			<td>CTTTGCCTCACTCAGGATTGG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Application</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keyence BZ-X700</td>
			<td>Keyence</td>
			<td colspan="2">Imaging brown adipocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>Dissociate BAT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System</td>
			<td>Applied Biosystem</td>
			<td>Quantitative PCR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Odyssey Fc Imaging system</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>Western blot immaging</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolating brown adipocytes from murine interscapular brown adipose tissue for gene and protein expression analysis

O tecido adiposo marrom (BAT) é responsável pela termogênese não trêmula em mamíferos, e os adipócitos marrons (BAs) são as unidades funcionais dos BAT. Os BAs contêm gotículas lipídicas multiloculares e mitocôndrias abundantes, e expressam a proteína de desacoplamento 1 (UCP1). Os BAs são categorizados em dois subtipos com base em sua origem: BAs clássicos derivados de embriões (cBAs) e BAs derivados de adipócitos brancos. Devido à sua densidade relativamente baixa, os BAs não podem ser isolados do MTD com o método tradicional de centrifugação. Neste estudo, um novo método foi desenvolvido para isolar BAs de camundongos para análise de expressão gênica e proteica. Neste protocolo, a MTD interescapular de camundongos adultos foi digerida com solução de colagenase e dispase, e os BAs dissociados foram enriquecidos com solução de iodixanol a 6%. BAs isolados foram então lisados com reagente Trizol para isolamento simultâneo de RNA, DNA e proteína. Após o isolamento do RNA, a fase orgânica do lisado foi utilizada para a extração proteica. Nossos dados mostraram que a solução de iodixanol a 6% enriqueceu eficientemente os BAs sem interferir nos estudos de acompanhamento de expressão gênica e proteica. O fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) é um fator de crescimento que regula o crescimento e a proliferação de células mesenquimais. Em comparação com o tecido adiposo marrom, os BAs isolados apresentaram expressão significativamente maior de Pdgfa. Em resumo, este novo método fornece uma plataforma para estudar a biologia dos adipócitos marrons em um único nível de tipo celular.

Preparação de MTD interacapular para isolamento de adipócitos marrons O processo de isolamento dos adipócitos marrons (BAs) está representado na Figura 1A. Todo o processo, desde a preparação das MTD e das soluções de digestão/separação até à obtenção de AG isoladas, demorará cerca de 4 h.
Em camundongos adultos, existe MTD abundante na região interescapular. Esta MTD interescapular (BATi) é recoberta por camadas musculares e...

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Isolating Brown Adipocytes from Murine Interscapular Brown Adipose Tissue for Gene and Protein Expression Analysis

Este estudo descreve um novo método de isolamento de adipócitos marrons murinos para análise da expressão gênica e proteica.

Isolando Adipócitos Castanhos do Tecido Adiposo Castanho Interescapular Murino para Análise da Expressão Gênica e Proteica

Brown adipose tissue (BAT) is responsible for non-shivering thermogenesis in mammals, and brown adipocytes (BAs) are the functional units of BAT. BAs ...

Para investigar os aspectos biológicos do tecido adiposo marrom, é essencial limpar o tamanho adiposo marrom purificado. Atualmente não veio na purificação de tamanho adiposo marrom e as massas estão disponíveis. Neste estudo, desenvolvemos um protocolo simples para abordar essa questão.Agora, uma habilidade é necessária para este protocolo. Ele precisa de muito menos materiais de estudo do que outros métodos e o tamanho adiposo marrom purificado pode ser usado diretamente para análise de expressão gênica e proteica. Este protocolo fornece um novo método para estudar a biologia do tamanho adiposo marrom clássico.Também pode ser aplicado para estudar o processo de escurecimento dos adipócitos brancos. Demonstrando o procedimento estará Amanda, uma assistente de pesquisa do meu laboratório. Comece por colocar o balão com MTD e solução de digestão num agitador magnético a 60 rotações por minuto numa incubadora de 35 graus Celsius durante 30 minutos.Use uma pipeta de um mililitro para interromper os aglomerados de tecido agregados de fatias de MTD ao redor da barra do agitador. Após a digestão, coloque um filtro de filtro de 70 micrômetros em cima de um tubo de centrífuga limpo de 50 mililitros e pipeta em torno de quatro mililitros de suspensão celular através do filtro. Em seguida, lave-o com quatro mililitros de solução de iodixanol a 12%.Pipetar para cima e para baixo para misturar as células com solução de iodixanol e, em seguida, transferir a mistura celular para dois tubos de ensaio de poliestireno de cinco mililitros transparentes. Coloque os tubos de poliestireno contendo a mistura celular no gelo por uma hora, fazendo com que os BAs formem uma camada no topo. Retirar 20 microlitros dos BAs isolados para exame microscópico.Para isolamento de RNA e proteína, pipete a camada de BA em dois tubos de microcenterfuge de 1,7 mililitro. Em seguida, remova cuidadosamente a solução iodixonal excessiva sem interromper a camada de BA. Em seguida, adicione um mililitro de TRIzol na solução celular para isolar simultaneamente RNA, DNA e proteína e misture o suficiente para lisar as células.Para separar as fases, adicione 200 microlitros de clorofórmio e centrífuga ao tubo a 9, 981 G por 10 minutos a quatro graus Celsius. Após a centrifugação, use a fase aquosa para isolamento de RNA. Transfira 300 microlitros da fase orgânica para um tubo de microcentrífuga de dois mililitros e adicione 750 microlitros de etanol a 100%.Após o vórtice por 10 segundos, adicione 200 microlitros de 1-Bromo-3-cloropropano e vórtice novamente por 10 segundos. Adicione 600 microlitros de água destilada dupla antes de vórtice por 10 segundos. Deixar repousar a solução misturada durante 10 minutos à temperatura ambiente.Após a centrifugação, adicionar 9.981 G por 10 minutos a quatro graus Celsius. As fases serão separadas com a fase proteica localizada na camada intermediária. Remova a solução aquosa superior e adicione um mililitro de etanol a 100% na solução restante.Após centrifugação a 9, 981 G por 10 minutos a quatro graus Celsius, descarte o sobrenadante e lave o pellet com um mililitro de etanol a 100%. Centrífuga a 9, 981 G por 10 minutos a quatro graus Celsius. Depois de remover o sobrenadante, seque o pellet ao ar por 10 minutos à temperatura ambiente e meça o peso do pellet molhado.Adicionar solução de SDS a 1% a uma proporção de 20 microlitros por miligrama de pellet. Dissolva o pellet completamente colocando o tubo em um agitador aquecido a 55 graus Celsius e 11 G por cinco a 10 minutos. No protocolo, PBS contendo 3%BSA foi utilizado para separar BAs de BATs.As células isoladas eram em forma de framboesa com gotículas lipídicas multiloculares no interior e eram tdTom positivas, confirmando que eram BAs. A proteína foi isolada dos BAs com um protocolo GTPC melhorado e, em seguida, foi examinada com um gel SDS-PAGE. Uma banda dominante associada à ASC foi observada na amostra de BA, sugerindo sua interferência na extração proteica.Para evitar a interferência da ASC, uma solução iodixonal a 6% foi utilizada para o isolamento de BAs, que tinham uma forma típica de framboesa e continham gotículas lipídicas multiloculares. As proteínas extraídas desses BAs foram bem separadas no gel SDS-PAGE. Essas células foram consideradas tdTomato positivas, enquanto as células recuperadas do pellet foram tdTomato negativas, sem gotículas lipídicas óbvias, sugerindo uma separação eficiente dos BAs das células sem gordura.Na análise da expressão gênica, os níveis de mRNA de UCP1 e PDGFA foram significativamente maiores nos BAs isolados. Mas o mRNA do PDGFRA só foi detectado em BAT. A proteína UCP1 foi encontrada enriquecida em BAs isolados.O EDGFR alfa foi detectado em MTD, mas não em BAs isolados. Esses resultados confirmam a eficiência do método de isolamento de BAs e demonstram que os BAs isolados são adequados para estudos de expressão gênica e proteica. Ao tentar este protocolo, use tampão de digestão fresco para dissociar o tecido adiposo marrom e evitar a formação de aglomerados de tecido durante o período de digestão.Este novo método facilita a investigação da biologia do tecido adiposo marrom em um único nível de torneira celular. Aplicando este método, pode-se realizar estudos de GN e expressão de proteínas com adipócitos marrons puros dissecando com precisão o programa de expressão gênica de adipócitos marrons, sem se preocupar com a contaminação originária de células não gordurosas.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Real-time Imaging of Leukotriene B4 Mediated Cell Migration and BLT1 Interactions with &beta;-arrestin

Real-time Imaging of Leukotriene B4 Mediated Cell Migration and BLT1 Interactions with ÃƒÅ½Ã‚Â²-arrestin

Em tempo real de imagens de leucotrienos B 4 Migração mediada por células e BLT1 Interações com β-arrestina

G-protein coupled receptors (GPCRs) belong to the seven transmembrane protein family and mediate the transduction of extracellular signals to ...

Imunologia e Infecção

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Usando imagens Bioluminescent para Investigar sinergismo entre Streptococcus pneumoniae E Vírus da Influenza A em Ratos infantil

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

Diferenciando papéis funcionais da expressão do gene de células imunes e não-imunes na colite Rato por Transplante de Medula Óssea

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice ...

Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer's Patches

Isolar e imunocoloração linfócitos e células dendríticas a partir de placas de Peyer Murino

Peyer's  patches (PPs) are integral components of the gut-associated lymphoid tissues  (GALT) and play a central role in intestinal immunosurveillance and ...

Isolation of Adipose Tissue Immune Cells

Isolamento de tecido adiposo de células imunes

The discovery of increased macrophage infiltration in  the adipose tissue (AT) of obese rodents and humans has led to an  intensification of interest in ...

Isolation of Murine Peritoneal Macrophages to Carry Out Gene Expression Analysis Upon Toll-like Receptors Stimulation

Isolamento de Murino macrófagos peritoniais de Cumprir a análise de expressão gênica Após Toll-like receptors Estimulação

During infection and inflammation, circulating monocytes leave the bloodstream and migrate into tissues, where they differentiate into macrophages. ...

Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials

Qualitativos e quantitativos Os ensaios para a detecção e caracterização de antimicrobianos Proteína

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods ...

SILAC Based Proteomic Characterization of Exosomes from HIV-1 Infected Cells

SILAC Based proteômica Caracterização de exossomas de HIV-1 células infectadas

Proteomics is the large-scale analysis of proteins. Proteomic techniques, such as liquid chromatography tandem mass spectroscopy (LC-MS/MS), can ...

Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System

Isolando os linfócitos de rato pequeno Intestinal sistema imunológico

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to ...

Isolation, Expansion, and Adipogenic Induction of CD34+CD31+ Endothelial Cells from Human Omental and Subcutaneous Adipose Tissue

Isolamento, expansão e indução de Adipogenic de CD34 + CD31 + células endoteliais de tecido adiposo humano de Omental e subcutâneo

Obesity is accompanied by an extensive remodeling of adipose tissue primarily via adipocyte hypertrophy. Extreme adipocyte growth results in a poor ...