Name: isolating brown adipocytes from murine interscapular brown adipose tissue for gene and protein expression analysis
Uploaded: 2021-03-12T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolating Brown Adipocytes from Murine Interscapular Brown Adipose Tissue for Gene and Protein Expression Analysis at JoVE.com

Z. Lin был поддержан фондами Национального института здравоохранения HL138454-01 и Масонского медицинского научно-исследовательского института.

Все мыши содержались в условиях, свободных от патогенов, и все процедуры были одобрены Масонским медицинским исследовательским Комитетом по уходу и использованию животных (IACUC). UCP1::Cre9 и Rosa 26tdTomato мыши линии13 были зарегистрированы ранее. Всех мышей держали...

<ol>
	<li>Zwick, R. K., Guerrero-Juarez, C. F., Horsley, V., Plikus, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomical,+physiological,+and+functional+diversity+of+adipose+tissue.">Anatomical, physiological, and functional diversity of adipose tissue.</a> Cell Metabolism. 27, 68-83 (2018).</li><li>Symonds, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brown+adipose+tissue+growth+and+development.">Brown adipose tissue growth and development.</a> Scientifica. 2013, 305763 (2013).</li><li>Giralt, M., Villarroya, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=White,+brown,+beige/brite:+Different+adipose+cells+for+different+functions.">White, brown, beige/brite: Different adipose cells for different functions.</a> Endocrinology. 154, 2992-3000 (2013).</li><li>Cannon, B., Nedergaard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brown+adipose+tissue:+function+and+physiological+significance.">Brown adipose tissue: function and physiological significance.</a> Physiological Reviews. 84, 277-359 (2004).</li><li>Cinti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adipose+organ.">The adipose organ.</a> Prostaglandins, Leukotrienes and Essential Fatty Acids. 73, 9-15 (2005).</li><li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beige+adipocytes+are+a+distinct+type+of+thermogenic+fat+cell+in+mouse+and+human.">Beige adipocytes are a distinct type of thermogenic fat cell in mouse and human.</a> Cell. 150, 366-376 (2012).</li><li>Cypess, A. M., Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brown+fat+as+a+therapy+for+obesity+and+diabetes.">Brown fat as a therapy for obesity and diabetes.</a> Current Opinion in Endocrinology, Diabetes and Obesity. 17, 143-149 (2010).</li><li>Schoettl, T., Fischer, I. P., Ussar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+adipose+tissue+in+development+and+metabolic+function.">Heterogeneity of adipose tissue in development and metabolic function.</a> Journal of Experimental Biology. 221, (2018).</li><li>Kong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IRF4+is+a+key+thermogenic+transcriptional+partner+of+PGC-1&#945;.">IRF4 is a key thermogenic transcriptional partner of PGC-1&#945;.</a> Cell. 158, 69-83 (2014).</li><li>Lee, Y. H., Petkova, A. P., Konkar, A. A., Granneman, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+origins+of+cold-induced+brown+adipocytes+in+adult+mice.">Cellular origins of cold-induced brown adipocytes in adult mice.</a> The FASEB Journal. 29, 286-299 (2015).</li><li>Kim, W. -. S., Park, H. -. S., Sung, J. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pivotal+role+of+PDGF+and+its+receptor+isoforms+in+adipose-derived+stem+cells.">The pivotal role of PDGF and its receptor isoforms in adipose-derived stem cells.</a> Histology and Histopathology. 30 (7), 793-799 (2015).</li><li>Hagberg, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+of+mouse+and+human+adipocytes+for+the+analysis+of+browning+and+cellular+heterogeneity.">Flow cytometry of mouse and human adipocytes for the analysis of browning and cellular heterogeneity.</a> Cell Report. 24, 2746-2756 (2018).</li><li>Madisen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+and+high-throughput+Cre+reporting+and+characterization+system+for+the+whole+mouse+brain.">A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain.</a> Nature Neuroscience. 13, 133-140 (2010).</li><li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid.">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Analytical biochemistry. 150, 76-85 (1985).</li><li>Chey, S., Claus, C., Liebert, U. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+method+for+simultaneous+isolation+of+proteins+and+nucleic+acids.">Improved method for simultaneous isolation of proteins and nucleic acids.</a> Analytical Biochemistry. 411, 164-166 (2011).</li><li>Ford, T., Graham, J., Rickwood, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iodixanol:+A+nonionic+iso-osmotic+centrifugation+medium+for+the+formation+of+self-generated+gradients.">Iodixanol: A nonionic iso-osmotic centrifugation medium for the formation of self-generated gradients.</a> Analytical Biochemistry. 220, 360-366 (1994).</li><li>Kovacovicova, K., Vinciguerra, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+senescent+cells+by+iodixanol+(OptiPrep)+density+gradient-based+separation.">Isolation of senescent cells by iodixanol (OptiPrep) density gradient-based separation.</a> Cell Proliferation. 52, 12674 (2019).</li><li>Lock, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=versatile+manufacturing+of+recombinant+adeno-associated+viral+vectors+at+scale.">versatile manufacturing of recombinant adeno-associated viral vectors at scale.</a> Human Gene Therapy. 21, 1259-1271 (2010).</li><li>Marin, R. D., Crespo-Garcia, S., Wilson, A. M., Sapieha, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RELi+protocol:+Optimization+for+protein+extraction+from+white,+brown,+and+beige+adipose+tissues.">RELi protocol: Optimization for protein extraction from white, brown, and beige adipose tissues.</a> MethodsX. 6, 918-928 (2019).</li><li>Sonna, L. A., Fujita, J., Gaffin, S. L., Lilly, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invited+Review:+effects+of+heat+and+cold+stress+on+mammalian+gene+expression.">Invited Review: effects of heat and cold stress on mammalian gene expression.</a> Journal of Applied Physiology. 92, 1725-1742 (2002).</li><li>Gensch, N., Borchardt, T., Schneider, A., Riethmacher, D., Braun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+autonomous+myogenic+cell+populations+revealed+by+ablation+of+Myf5-expressing+cells+during+mouse+embryogenesis.">Different autonomous myogenic cell populations revealed by ablation of Myf5-expressing cells during mouse embryogenesis.</a> Development. 135, 1597-1604 (2008).</li></ol>

В этом исследовании был разработан новый метод выделения БА для анализа экспрессии генов и белков.
В опубликованном протоколе изоляции БА для обогащения БА12 использовался 3% раствор BSA. Тем не менее, обогащенные БА, достигнутые этим опубликованным протоколом...

Как мыши, так и люди имеют два типа жировых тканей: белая жировая ткань (WAT) и коричневая жировая ткань (BAT)1. WAT хранит энергию в виде триглицеридов в белых адипоцитах, а коричневые адипоциты (BA) BAT рассеивают химическую энергию в виде тепла2. Основываясь на своем происхождении развития, БА далее классифицируются на классические БА (цБА), которые образовались во время развития эмбриона, и белые адипоциты, полученные из БА (бежевые / бритовые клетки, преобразованные из белых адипоцитов в условиях стресса)3. БА являются многолокулярными и экспрессируют термогенный белок, разъединяющий белок 1 (UCP1)4. Депо межлопастных BAT (iBAT) является одним из основных депо cBA у мелких млекопитающих5, тогда как бежевые клетки диспергированы внутри WAT6. 
Из-за своей природы рассеивания энергии, БА получили большое внимание в качестве терапевтической мишени для снижения ожирения7. Чтобы использовать БА для лечения ожирения, важно понимать молекулярные механизмы, которые контролируют функцию, выживание и рекрутирование БА. Жировые ткани, включая BAT и WAT, неоднородны. За исключением адипоцитов, жировые ткани содержат много других типов клеток, таких как эндотелиальные клетки, мезенхимальные стволовые клетки и макрофаги8. Хотя доступны генетические инструменты для конкретного истощения генов-кандидатов у мышей, такие как UCP1: Cre line9, методы очистки БА от BAT или WAT ограничены, что затрудняет изучение БА на уровне одноклеточного типа. Кроме того, без получения чистых БА отношения между БА и не-БА не будут четко очерчены. Например, рецептор фактора роста тромбоцитов альфа (PDGFRα) был использован в качестве маркера для недифференцированных мезенхимальных клеток, и он экспрессируется в эндотелиальных и интерстициальных клетках BAT. При холодном стрессе BAT PDGFRα положительные клетки-предшественники дают начало новым BA10. PDGFRα активируется его лигандом PDGF, фактором роста, который регулирует рост и пролиферацию мезенхимальных клеток11; однако неясно, влияют ли БА на поведение PDGFRα-положительных клеток-предшественников путем секреции PDGF. 
Недавно был опубликован протокол изоляции БА, который основан на флуоресцентно-активированной сортировке клеток (FACS)12. В этом протоколе 3% раствор бычьего сывороточного альбумина (BSA) использовался для отделения БА от не-БА, а обогащенные БА дополнительно очищались FACS. Применение этого протокола ограничено требованием процесса СУИМ, который опирается как на оборудование, так и на опыт работы СУИМ. В этом исследовании был разработан новый протокол изоляции БА от НИМ. БА, выделенные этим протоколом, могут быть непосредственно использованы для исследований экспрессии генов и белков. Кроме того, данные этого исследования свидетельствуют о том, что БА являются основным ресурсом PDGF.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antigen</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PPAR&#947;</td>
			<td>LSBio</td>
			<td>Ls-C368478</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDGFRa</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-398206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UCP1</td>
			<td>R&#38;D system</td>
			<td>IC6158P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemical and solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type II</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17101015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Bromo-3-chloropropane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B62404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)&#160;</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>A-421-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>CT1330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>IB05040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II, protease</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5693</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>EB0107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>IB15724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiQuant Universal Green qPCR Master Mix</td>
			<td>LifeSct</td>
			<td>LS01131905Y</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride Hexahydrate</td>
			<td>Boston BioProducts</td>
			<td>P-855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OneScrip Plus cDNA Synthesis SuperMix</td>
			<td>ABM</td>
			<td>G454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep (Iodixanol)</td>
			<td>Cosmo Bio USA</td>
			<td>AXS-1114542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10x)</td>
			<td>Caisson Labs</td>
			<td>PBL07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (1x)</td>
			<td>Caisson Labs</td>
			<td>PBL06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Boston BioProducts</td>
			<td>P-1435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SimplyBlue safe Stain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC6060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>75746</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol reagent</td>
			<td>Life technoologies</td>
			<td>15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene name (Species)&#160;</td>
			<td>Forward</td>
			<td>Reverse</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pdgfra (Mouse)</td>
			<td>CTCAGCTGTCTCCTCACAgG</td>
			<td>CAACGCATCTCAGAGAAAAGG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pdgfa (Mouse)</td>
			<td>TGTGCCCATTCGCAGGAAGAG</td>
			<td>TTGGCCACCTTGACACTGCG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>36B4(Mouse)</td>
			<td>TGCTGAACATCTCCCCCTTCTC</td>
			<td colspan="2">TCTCCACAGACAATGCCAGGAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ucp1</td>
			<td>ACTGCCACACCTCCAGTCATT</td>
			<td>CTTTGCCTCACTCAGGATTGG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Application</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keyence BZ-X700</td>
			<td>Keyence</td>
			<td colspan="2">Imaging brown adipocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>Dissociate BAT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System</td>
			<td>Applied Biosystem</td>
			<td>Quantitative PCR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Odyssey Fc Imaging system</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>Western blot immaging</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolating brown adipocytes from murine interscapular brown adipose tissue for gene and protein expression analysis

Коричневая жировая ткань (BAT) отвечает за недрожащий термогенез у млекопитающих, а коричневые адипоциты (BA) являются функциональными единицами BAT. БА содержат как мультилокулярные липидные капли, так и обильные митохондрии, и они экспрессируют разъединяющий белок 1 (UCP1). БА подразделяются на два подтипа в зависимости от их происхождения: классические БА, полученные из эмбриона (цБА), и БА, полученные из белых адипоцитов. Из-за их относительно низкой плотности БА не могут быть выделены из НИМ традиционным методом центрифугирования. В этом исследовании был разработан новый метод выделения БА от мышей для анализа экспрессии генов и белков. В этом протоколе межлопаточный BAT у взрослых мышей переваривали раствором коллагеназы и диспазы, а диссоциированные БА обогащали 6% раствором йодиксанола. Затем выделенные БА лизировали реагентом тризол для одновременного выделения РНК, ДНК и белка. После выделения РНК органическая фаза лизата использовалась для экстракции белка. Наши данные показали, что 6% раствор йодиксанола эффективно обогащал БА, не вмешиваясь в последующие исследования экспрессии генов и белков. Тромбоцитарный фактор роста (PDGF) является фактором роста, который регулирует рост и пролиферацию мезенхимальных клеток. По сравнению с коричневой жировой тканью, изолированные БА имели значительно более высокую экспрессию Pdgfa. Таким образом, этот новый метод обеспечивает платформу для изучения биологии коричневых адипоцитов на уровне одного клеточного типа.

Препарат интеракапулярного НИМ для выделения коричневых адипоцитов Процесс выделения коричневых адипоцитов (БА) изображен на рисунке 1А. Весь процесс, от приготовления НИМ и растворов для сбраживания/разделения до получения изолированных БА, займет около 4 ч...

Watch this Scientific Journal Video about Isolating Brown Adipocytes from Murine Interscapular Brown Adipose Tissue for Gene and Protein Expression Analysis at JoVE.com

Isolating Brown Adipocytes from Murine Interscapular Brown Adipose Tissue for Gene and Protein Expression Analysis

Это исследование описывает новый метод выделения мышиных коричневых адипоцитов для анализа экспрессии генов и белков.

Выделение коричневых адипоцитов из мышиной межлопаточной коричневой жировой ткани для анализа экспрессии генов и белков

Brown adipose tissue (BAT) is responsible for non-shivering thermogenesis in mammals, and brown adipocytes (BAs) are the functional units of BAT. BAs ...

Чтобы исследовать биологические аспекты коричневой жировой ткани, важно очистить очищенный коричневый жировой размер. В настоящее время нет входящих в коричневый жировой размер очистки и массы доступны. В этом исследовании мы разработали простой протокол для решения этой проблемы.Теперь для этого протокола требуется один навык. Он требует гораздо меньше учебных материалов, чем другие методы, а очищенный размер коричневой жировой ткани может быть непосредственно использован для анализа экспрессии генов и белков. Этот протокол предоставляет новый метод изучения биологии классического размера бурого жировика.Он также может быть применен для изучения процесса потемнения белых адипоцитов. Продемонстрировать процедуру будет Аманда, научный сотрудник из моей лаборатории. Начните с размещения колбы с BAT и раствором для пищеварения на магнитной мешалке со скоростью 60 оборотов в минуту в инкубаторе с температурой 35 градусов Цельсия в течение 30 минут.Используйте одну миллилитровую пипетку, чтобы разрушить агрегированные сгустки тканей ломтиков BAT вокруг бара мешалки. После пищеварения поместите 70-микрометровый фильтр сетчатого фильтра поверх чистой 50-миллилитровой центрифужной трубки и пипетки вокруг четырех миллилитров клеточной суспензии через ситечко. Затем промыть его четырьмя миллилитрами 12% раствора йодиксанола.Пипетка вверх и вниз, чтобы смешать клетки с раствором йодиксанола, затем перенести клеточную смесь в две прозрачные пробирки из полистирола пять миллилитров. Поместите полистирольные трубки, содержащие смесь ячеек, на лед в течение одного часа, в результате чего БА образуют слой сверху. Выньте 20 микролитров изолированных БА для исследования в микроскоп.Для выделения РНК и белка пипетка слоя БА в две 1,7-миллилитровые микроцентровые трубки. Затем осторожно удаляют избыточный раствор йодиксонала, не нарушая слой БА. Затем добавьте один миллилитр TRIzol в клеточный раствор, чтобы одновременно выделить РНК, ДНК и белок и смешать достаточно, чтобы щелкнуть клетки.Чтобы разделить фазы, добавьте 200 микролитров хлороформа и центрифуги в трубку при 9, 981 г в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. После центрифугирования используют водную фазу для выделения РНК. Переложите 300 микролитров органической фазы в двухмиллилитровую микроцентрифужную трубку и добавьте 750 микролитров 100% этанола.После вихря в течение 10 секунд добавьте 200 микролитров 1-бром-3-хлорпропана и снова вихрь в течение 10 секунд. Добавьте 600 микролитров двойной дистиллированной воды перед вихрем в течение 10 секунд. Дайте смешанному раствору постоять 10 минут при комнатной температуре.После центрифугирования добавляют 9 981 г в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. Фазы будут разделены белковой фазой, локализованной в среднем слое. Удалите верхний водный раствор и добавьте один миллилитр 100% этанола в оставшийся раствор.После центрифугирования при 9, 981 г в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия отбросьте надосадочное вещество и промыть гранулу одним миллилитром 100% этанола. Центрифуга при 9, 981 G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. После удаления супернатанта высушите гранулу на воздухе в течение 10 минут при комнатной температуре и измерьте вес влажной гранулы.Добавьте 1% раствор SDS в соотношении 20 микролитров на миллиграмм гранулы. Растворите гранулу полностью, поместив трубку в нагретый шейкер при 55 градусах Цельсия и 11 г в течение пяти-10 минут. В протоколе PBS, содержащий 3% BSA, использовался для отделения BA от BAT.Изолированные клетки имели малиновую форму с мультилокулярными липидными каплями внутри и были tdTom положительными, подтверждая, что они были BA. Белок был выделен из БА с улучшенным протоколом GTPC, а затем исследован гелем SDS-PAGE. Доминирующая полоса, связанная с BSA, наблюдалась в образце BA, что свидетельствует о его вмешательстве в экстракцию белка.Чтобы избежать интерференции BSA, для выделения БА использовался 6%-йодиксональный раствор, который имел типичную малиновую форму и содержал многочелюстные липидные капли. Белки, извлеченные из этих БА, были хорошо разделены в геле SDS-PAGE. Было обнаружено, что эти клетки являются tdTomato положительными, тогда как клетки, извлеченные из гранулы, были tdTomato отрицательными без явных липидных капель, что предполагает эффективное отделение BA от нежировых клеток.При анализе экспрессии генов уровни мРНК UCP1 и PDGFA были значительно выше в изолированных БА. Но мРНК PDGFRA была обнаружена только в BAT. Белок UCP1 был обнаружен обогащенным изолированными БА.ЭдГФР альфа была обнаружена в BAT, но не в изолированных БА. Эти результаты подтверждают эффективность метода выделения БА и демонстрируют, что выделенные БА подходят для исследований экспрессии генов и белков. При попытке этого протокола используйте свежий буфер пищеварения, чтобы диссоциировать коричневую жировую ткань и избежать образования тканевого комка в период пищеварения.Этот новый метод позволяет легко исследовать биологию коричневой жировой ткани на уровне одной клетки. Применяя этот метод, можно выполнять исследования GN и экспрессии белка с чистыми коричневыми адипоцитами, точно рассекающими программу экспрессии генов коричневых адипоцитов, не беспокоясь о загрязнении первоначально из обезжиренных клеток.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Real-time Imaging of Leukotriene B4 Mediated Cell Migration and BLT1 Interactions with &beta;-arrestin

Real-time Imaging of Leukotriene B4 Mediated Cell Migration and BLT1 Interactions with ÃƒÅ½Ã‚Â²-arrestin

В режиме реального времени Визуализация лейкотриена B 4 Опосредованного миграции клеток и BLT1 Взаимодействие с β-arrestin

G-protein coupled receptors (GPCRs) belong to the seven transmembrane protein family and mediate the transduction of extracellular signals to ...

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Использование изображений Биолюминесцентный по расследованию синергизм между Пневмококк И вируса гриппа А в младенческой Мыши

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

Дифференцируя функциональной роли экспрессии генов от иммунной и не-иммунных клеток в мышь колит трансплантацией костного мозга

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice ...

Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer's Patches

Изоляция и Иммуноокрашивание лимфоциты и дендритные клетки из мышиных Патчи Пейера

Peyer's  patches (PPs) are integral components of the gut-associated lymphoid tissues  (GALT) and play a central role in intestinal immunosurveillance and ...

Isolation of Adipose Tissue Immune Cells

Изоляция жировой ткани иммунных клеток

The discovery of increased macrophage infiltration in  the adipose tissue (AT) of obese rodents and humans has led to an  intensification of interest in ...

Isolation of Murine Peritoneal Macrophages to Carry Out Gene Expression Analysis Upon Toll-like Receptors Stimulation

Выделение перитонеальных макрофагов Carry Out Gene Expression анализ По Toll-подобные рецепторы стимуляции

During infection and inflammation, circulating monocytes leave the bloodstream and migrate into tissues, where they differentiate into macrophages. ...

Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials

Качественный и количественный анализы для обнаружения и определения характеристик белка Противомикробные

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods ...

SILAC Based Proteomic Characterization of Exosomes from HIV-1 Infected Cells

SILAC основе Протеомный Характеристика экзосомы от ВИЧ-1-инфицированных клеток

Proteomics is the large-scale analysis of proteins. Proteomic techniques, such as liquid chromatography tandem mass spectroscopy (LC-MS/MS), can ...

Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System

Изоляция лимфоциты от мыши небольшой кишечной иммунной системы

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to ...

Isolation, Expansion, and Adipogenic Induction of CD34+CD31+ Endothelial Cells from Human Omental and Subcutaneous Adipose Tissue

Изоляция, расширение и адипогенном индукции CD34 + CD31 + эндотелиальных клеток от человека сальниковый и подкожной жировой ткани

Obesity is accompanied by an extensive remodeling of adipose tissue primarily via adipocyte hypertrophy. Extreme adipocyte growth results in a poor ...