Name: isolating brown adipocytes from murine interscapular brown adipose tissue for gene and protein expression analysis
Uploaded: 2021-03-12T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolating Brown Adipocytes from Murine Interscapular Brown Adipose Tissue for Gene and Protein Expression Analysis at JoVE.com

Z. Lin fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud HL138454-01 y los fondos del Instituto de Investigación Médica Masónica.

Todos los ratones se mantuvieron en condiciones libres de patógenos, y todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de Investigación Médica Masónica (IACUC). UCP1::Cre9 y Rosa 26tdTomato ratones líneas13 fueron reportados previamente. Todos los ratones se mantuvieron a temperatura ambiente con un ciclo de luz/oscuridad de 12 h.
1. Preparación de las soluciones y el tejido adipo...

<ol>
	<li>Zwick, R. K., Guerrero-Juarez, C. F., Horsley, V., Plikus, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomical,+physiological,+and+functional+diversity+of+adipose+tissue.">Anatomical, physiological, and functional diversity of adipose tissue.</a> Cell Metabolism. 27, 68-83 (2018).</li><li>Symonds, M. 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M., Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brown+fat+as+a+therapy+for+obesity+and+diabetes.">Brown fat as a therapy for obesity and diabetes.</a> Current Opinion in Endocrinology, Diabetes and Obesity. 17, 143-149 (2010).</li><li>Schoettl, T., Fischer, I. 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K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid.">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Analytical biochemistry. 150, 76-85 (1985).</li><li>Chey, S., Claus, C., Liebert, U. 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D., Crespo-Garcia, S., Wilson, A. M., Sapieha, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RELi+protocol:+Optimization+for+protein+extraction+from+white,+brown,+and+beige+adipose+tissues.">RELi protocol: Optimization for protein extraction from white, brown, and beige adipose tissues.</a> MethodsX. 6, 918-928 (2019).</li><li>Sonna, L. A., Fujita, J., Gaffin, S. L., Lilly, C. 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En este estudio, se desarrolló un nuevo método para aislar BA para el análisis de expresión génica y proteica.
En un protocolo de aislamiento de BA publicado, se utilizó una solución BSA al 3% para enriquecer los BA12. Sin embargo, los BA enriquecidos logrados por este protocolo publicado no pudieron usarse directamente para el análisis de expresión de proteínas. Esto se debe a que la BSA concentrada existente en la solución de BA interfiere con la extracció...

Tanto los ratones como los humanos tienen dos tipos de tejidos adiposos: tejido adiposo blanco (WAT) y tejido adiposo marrón (BAT)1. WAT almacena energía en forma de triglicéridos en los adipocitos blancos, y los adipocitos marrones (BA) de BAT disipan la energía química en forma de calor2. Según su origen en el desarrollo, los BA se clasifican en BA clásicos (cBA) que se formaron durante el desarrollo embrionario y BA derivados de adipocitos blancos (células beige / brite, convertidas de adipocitos blancos en condiciones de estrés)3. Los BA son multiloculares y expresan la proteína termogénica de desacoplamiento 1 (UCP1)4. El depósito interescapular de BAT (iBAT) es uno de los principales depósitos de cBA en pequeños mamíferos5, mientras que las células beige se dispersan dentro de WAT6. 
Debido a su naturaleza de disipación de energía, los BA han recibido mucha atención como una diana terapéutica para reducir la obesidad7. Para explotar los BA con el propósito de tratar la obesidad, es esencial comprender los mecanismos moleculares que controlan la función, la supervivencia y el reclutamiento de los BA. Los tejidos adiposos, incluidos BAT y WAT, son heterogéneos. A excepción de los adipocitos, los tejidos adiposos contienen muchos otros tipos de células, como las células endoteliales, las células madre mesenquimales y los macrófagos8. Aunque existen herramientas genéticas para agotar específicamente los genes candidatos en ratones BA, como UCP1::Cre línea9, las técnicas para purificar BAT o WAT son limitadas, lo que dificulta el estudio de BA a nivel de tipo unicelular. Además, sin obtener BA puros, la relación entre BA y no BA no estará claramente delineada. Por ejemplo, el receptor alfa del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFRα) se ha utilizado como marcador para células mesenquimales indiferenciadas, y se expresa en las células endoteliales e intersticiales de BAT. En las MTD estresadas por frío, las células progenitoras PDGFRα positivas dan lugar a nuevas BAs10. PDGFRα es activado por su ligando PDGF, un factor de crecimiento que regula el crecimiento y la proliferación de células mesenquimales11; sin embargo, no está claro si las BA influyen en el comportamiento de las células progenitoras PDGFRα positivas mediante la secreción de PDGF. 
Recientemente, se ha publicado un protocolo de aislamiento de BAs, que se basa en la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS)12. En este protocolo, se utilizó una solución de albúmina sérica bovina (BSA) al 3% para separar los BA de los no BA, y los BA enriquecidos se purificaron aún más mediante FACS. La aplicación de este protocolo está limitada por el requisito del proceso FACS, que se basa tanto en el equipo como en las experiencias de operación del FACS. En este estudio, se desarrolló un nuevo protocolo para aislar los BAT de las MTD. Los BA aislados por este protocolo se pueden utilizar directamente para estudios de expresión génica y proteica. Además, los datos de este estudio sugieren que los BA son un recurso importante de PDGF.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antigen</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PPAR&#947;</td>
			<td>LSBio</td>
			<td>Ls-C368478</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDGFRa</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-398206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UCP1</td>
			<td>R&#38;D system</td>
			<td>IC6158P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemical and solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type II</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17101015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Bromo-3-chloropropane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B62404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)&#160;</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>A-421-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>CT1330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>IB05040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II, protease</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5693</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>EB0107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>IB15724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiQuant Universal Green qPCR Master Mix</td>
			<td>LifeSct</td>
			<td>LS01131905Y</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride Hexahydrate</td>
			<td>Boston BioProducts</td>
			<td>P-855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OneScrip Plus cDNA Synthesis SuperMix</td>
			<td>ABM</td>
			<td>G454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep (Iodixanol)</td>
			<td>Cosmo Bio USA</td>
			<td>AXS-1114542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10x)</td>
			<td>Caisson Labs</td>
			<td>PBL07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (1x)</td>
			<td>Caisson Labs</td>
			<td>PBL06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Boston BioProducts</td>
			<td>P-1435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SimplyBlue safe Stain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC6060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>75746</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol reagent</td>
			<td>Life technoologies</td>
			<td>15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene name (Species)&#160;</td>
			<td>Forward</td>
			<td>Reverse</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pdgfra (Mouse)</td>
			<td>CTCAGCTGTCTCCTCACAgG</td>
			<td>CAACGCATCTCAGAGAAAAGG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pdgfa (Mouse)</td>
			<td>TGTGCCCATTCGCAGGAAGAG</td>
			<td>TTGGCCACCTTGACACTGCG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>36B4(Mouse)</td>
			<td>TGCTGAACATCTCCCCCTTCTC</td>
			<td colspan="2">TCTCCACAGACAATGCCAGGAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ucp1</td>
			<td>ACTGCCACACCTCCAGTCATT</td>
			<td>CTTTGCCTCACTCAGGATTGG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Application</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keyence BZ-X700</td>
			<td>Keyence</td>
			<td colspan="2">Imaging brown adipocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>Dissociate BAT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System</td>
			<td>Applied Biosystem</td>
			<td>Quantitative PCR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Odyssey Fc Imaging system</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>Western blot immaging</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolating brown adipocytes from murine interscapular brown adipose tissue for gene and protein expression analysis

El tejido adiposo marrón (BAT) es responsable de la termogénesis sin temblores en los mamíferos, y los adipocitos marrones (BA) son las unidades funcionales de BAT. Las BA contienen gotitas lipídicas multiloculares y abundantes mitocondrias, y expresan la proteína de desacoplamiento 1 (UCP1). Los BA se clasifican en dos subtipos según su origen: BA clásicos derivados de embriones (cBA) y BA derivados de adipocitos blancos. Debido a su densidad relativamente baja, los BA no pueden aislarse de las MTD con el método de centrifugación tradicional. En este estudio, se desarrolló un nuevo método para aislar BA de ratones para el análisis de expresión génica y proteica. En este protocolo, el BAT interescapular de ratones adultos se digirió con solución de colagenasa y dispase, y los BA disociados se enriquecieron con solución de iodixanol al 6%. Los BA aislados se lisaron con el reactivo Trizol para el aislamiento simultáneo de ARN, ADN y proteína. Después del aislamiento del ARN, la fase orgánica del lisado se utilizó para la extracción de proteínas. Nuestros datos mostraron que la solución de iodixanol al 6% enriqueció eficientemente los BA sin interferir con los estudios de seguimiento de expresión génica y proteica. El factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) es un factor de crecimiento que regula el crecimiento y la proliferación de células mesenquimales. En comparación con el tejido adiposo marrón, los BA aislados tenían una expresión significativamente mayor de Pdgfa. En resumen, este nuevo método proporciona una plataforma para estudiar la biología de los adipocitos marrones a nivel de tipo celular único.

Preparación de MTD interacapular para el aislamiento de adipocitos marrones El proceso de aislamiento de los adipocitos marrones (BA) se muestra en la Figura 1A. Todo el proceso, desde la preparación de las MTD y las soluciones de digestión/separación hasta la obtención de BA aislados, tomará alrededor de 4 h.
En ratones adultos, existe abundante BAT en la región interescapular. Este BAT interescapular (iBAT) está cubierto por capas mus...

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Isolating Brown Adipocytes from Murine Interscapular Brown Adipose Tissue for Gene and Protein Expression Analysis

Este estudio describe un nuevo método para aislar adipocitos marrones murinos para el análisis de expresión génica y proteica.

Aislar adipocitos marrones del tejido adiposo marrón interescapular murino para el análisis de expresión génica y proteica

Brown adipose tissue (BAT) is responsible for non-shivering thermogenesis in mammals, and brown adipocytes (BAs) are the functional units of BAT. BAs ...

Para investigar los aspectos biológicos del tejido adiposo marrón, es esencial eliminar el tamaño adiposo marrón purificado. Actualmente no viene en purificación de tamaño adiposo marrón y las masas están disponibles. En este estudio, desarrollamos un protocolo sencillo para abordar este problema.Ahora, se requieren habilidades para este protocolo. Necesita muchos menos materiales de estudio que otros métodos y el tamaño adiposo marrón purificado se puede utilizar directamente para el análisis de expresión génica y proteica. Este protocolo proporciona un nuevo método para estudiar la biología del tamaño adiposo marrón clásico.También se puede aplicar para estudiar el proceso de pardeamiento de los adipocitos blancos. Demostrando el procedimiento estará Amanda, una asistente de investigación de mi laboratorio. Comience colocando el matraz con MTD y solución digestiva en un agitador magnético a 60 rotaciones por minuto en una incubadora de 35 grados centígrados durante 30 minutos.Use una pipeta de un mililitro para interrumpir los grupos de tejido agregados de las rodajas BAT alrededor de la barra de agitación. Después de la digestión, coloque un filtro de filtro de 70 micrómetros sobre un tubo de centrífuga limpio de 50 mililitros y pipete alrededor de cuatro mililitros de suspensión celular a través del filtro. Luego lávelo con cuatro mililitros de solución de iodixanol al 12%.Pipetear hacia arriba y hacia abajo para mezclar las células con solución de iodixanol y luego transferir la mezcla celular a dos tubos de ensayo de poliestireno transparente de cinco mililitros. Coloque los tubos de poliestireno que contienen la mezcla celular en hielo durante una hora, haciendo que los BA formen una capa en la parte superior. Saque 20 microlitros de los BA aislados para examinarlos con microscopio.Para el aislamiento de ARN y proteínas, pipetear la capa de BA en dos tubos de microcentfuga de 1,7 mililitros. Luego retire con cuidado la solución yodixonal excesiva sin interrumpir la capa de BA. Luego agregue un mililitro de TRIzol en la solución celular para aislar simultáneamente el ARN, el ADN y la proteína y mezclar lo suficiente como para afectar a las células.Para separar las fases, agregue 200 microlitros de cloroformo y centrifugar al tubo a 9, 981 G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Después de la centrifugación, use la fase acuosa para el aislamiento de ARN. Transfiera 300 microlitros de la fase orgánica a un tubo de microcentrífuga de dos mililitros y agregue 750 microlitros de etanol al 100%.Después de vortexing durante 10 segundos, agregue 200 microlitros de 1-Bromo-3-cloropropano y vortex nuevamente durante 10 segundos. Agregue 600 microlitros de agua destilada doble antes de vortex durante 10 segundos. Deje reposar la solución mezclada durante 10 minutos a temperatura ambiente.Después de la centrifugación, agregue 9, 981 G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Las fases se separarán con la fase proteica localizada en la capa media. Retire la solución acuosa superior y agregue un mililitro de etanol al 100% en la solución restante.Después de la centrifugación a 9, 981 G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados, deseche el sobrenadante y lave el pellet con un mililitro de etanol al 100%. Centrifugar a 9, 981 G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Después de retirar el sobrenadante, seque al aire el pellet durante 10 minutos a temperatura ambiente y mida el peso del pellet húmedo.Agregue una solución de SDS al 1% en una proporción de 20 microlitros por miligramo de pellet. Disuelva el pellet completamente colocando el tubo en una coctelera caliente a 55 grados centígrados y 11 g durante cinco a 10 minutos. En el protocolo, PBS que contenía 3% BSA se utilizó para separar los BA de BAT.Las células aisladas tenían forma de frambuesa con gotitas de lípidos multiloculares en el interior y eran tdTom positivo, lo que confirma que eran BA. La proteína se aisló de los BA con un protocolo GTPC mejorado y luego se examinó con un gel SDS-PAGE. Se observó una banda dominante asociada con BSA en la muestra de BA, lo que sugiere su interferencia en la extracción de proteínas.Para evitar la interferencia de BSA, se utilizó una solución de yododinonal al 6% para el aislamiento de BA, que tenía una forma típica de frambuesa y contenía gotas de lípidos multiloculares. Las proteínas extraídas de estos BA se separaron bien en el gel SDS-PAGE. Se encontró que estas células eran tdTomato positivas, mientras que las células recuperadas del pellet eran tdTomato negativas sin gotas de lípidos obvias, lo que sugiere una separación eficiente de las BA de las células no grasas.En el análisis de expresión génica, los niveles de ARNm de UCP1 y PDGFA fueron significativamente más altos en los BA aislados. Pero el ARNm de PDGFRA solo se detectó en BAT. Se encontró proteína UCP1 enriquecida en BA aisladas.Se detectó EDGFR alfa en las MTD, pero no en las BA aisladas. Estos resultados confirman la eficacia del método para aislar BA y demuestran que los BA aislados son adecuados para estudios de expresión génica y proteica. Al intentar este protocolo, use tampón de digestión fresco para disociar el tejido adiposo marrón y evitar la formación de grumos de tejido durante el período de digestión.Este nuevo método facilita la investigación de la biología del tejido adiposo marrón en un solo nivel de toma celular. Al aplicar este método, se pueden realizar estudios de GN y expresión de proteínas con adipocitos marrones puros que diseccionan con precisión el programa de expresión génica de los adipocitos marrones, sin preocuparse por la contaminación original de las células no grasas.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Real-time Imaging of Leukotriene B4 Mediated Cell Migration and BLT1 Interactions with &beta;-arrestin

Real-time Imaging of Leukotriene B4 Mediated Cell Migration and BLT1 Interactions with ÃƒÅ½Ã‚Â²-arrestin

Imágenes en tiempo real de los leucotrienos B 4 La migración mediada por células y BLT1 interacciones con β-arrestina

G-protein coupled receptors (GPCRs) belong to the seven transmembrane protein family and mediate the transduction of extracellular signals to ...

Investigación

Inmunología e Infección

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Utilizando imágenes bioluminiscentes encargado de investigar la sinergia entre Streptococcus pneumoniae Y el Virus de la Influenza en ratones lactantes

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

Diferenciar los roles funcionales de la expresión génica de las células inmunes y no inmunes en la colitis de ratón por Trasplante de Médula Ósea

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice ...

Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer's Patches

Aislar y inmunoticción Los linfocitos y las células dendríticas de las placas de Peyer murinas de

Peyer's  patches (PPs) are integral components of the gut-associated lymphoid tissues  (GALT) and play a central role in intestinal immunosurveillance and ...

Isolation of Adipose Tissue Immune Cells

Aislamiento de tejido adiposo células inmunes

The discovery of increased macrophage infiltration in  the adipose tissue (AT) of obese rodents and humans has led to an  intensification of interest in ...

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Aislamiento de macrófagos peritoneales murinos para llevar a cabo análisis de expresión génica Al Toll-like Receptores Estimulación

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Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials

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SILAC basada en proteómica Caracterización de exosomas del VIH-1 en células infectadas

Proteomics is the large-scale analysis of proteins. Proteomic techniques, such as liquid chromatography tandem mass spectroscopy (LC-MS/MS), can ...

Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System

Aislar los linfocitos desde el sistema de inmune Intestinal pequeño ratón

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to ...

Isolation, Expansion, and Adipogenic Induction of CD34+CD31+ Endothelial Cells from Human Omental and Subcutaneous Adipose Tissue

Aislamiento, expansión y Adipogenic inducción de CD31 + CD34 + células endoteliales del humano omentales y subcutáneos de tejido adiposo

Obesity is accompanied by an extensive remodeling of adipose tissue primarily via adipocyte hypertrophy. Extreme adipocyte growth results in a poor ...