Name: isolating brown adipocytes from murine interscapular brown adipose tissue for gene and protein expression analysis
Uploaded: 2021-03-12T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolating Brown Adipocytes from Murine Interscapular Brown Adipose Tissue for Gene and Protein Expression Analysis at JoVE.com

Z. Lin stöddes av National Institutes of Health HL138454-01 och Masonic Medical Research Institute-medel.

Alla möss upprätthölls under patogenfria förhållanden, och alla procedurer godkändes av Masonic Medical Research Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). UCP1::Cre9 och Rosa 26tdTomato möss linjer13 rapporterades tidigare. Alla möss hölls i rumstemperatur med en ljus/mörk cykel på 12 timmar.
1. Beredning av lösningar och brun fettvävnad (BAT)
<ol><li>Förbered matsmältningslösning och separationslösning i ...

<ol>
	<li>Zwick, R. K., Guerrero-Juarez, C. F., Horsley, V., Plikus, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomical,+physiological,+and+functional+diversity+of+adipose+tissue.">Anatomical, physiological, and functional diversity of adipose tissue.</a> Cell Metabolism. 27, 68-83 (2018).</li><li>Symonds, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brown+adipose+tissue+growth+and+development.">Brown adipose tissue growth and development.</a> Scientifica. 2013, 305763 (2013).</li><li>Giralt, M., Villarroya, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=White,+brown,+beige/brite:+Different+adipose+cells+for+different+functions.">White, brown, beige/brite: Different adipose cells for different functions.</a> Endocrinology. 154, 2992-3000 (2013).</li><li>Cannon, B., Nedergaard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brown+adipose+tissue:+function+and+physiological+significance.">Brown adipose tissue: function and physiological significance.</a> Physiological Reviews. 84, 277-359 (2004).</li><li>Cinti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adipose+organ.">The adipose organ.</a> Prostaglandins, Leukotrienes and Essential Fatty Acids. 73, 9-15 (2005).</li><li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beige+adipocytes+are+a+distinct+type+of+thermogenic+fat+cell+in+mouse+and+human.">Beige adipocytes are a distinct type of thermogenic fat cell in mouse and human.</a> Cell. 150, 366-376 (2012).</li><li>Cypess, A. M., Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brown+fat+as+a+therapy+for+obesity+and+diabetes.">Brown fat as a therapy for obesity and diabetes.</a> Current Opinion in Endocrinology, Diabetes and Obesity. 17, 143-149 (2010).</li><li>Schoettl, T., Fischer, I. P., Ussar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+adipose+tissue+in+development+and+metabolic+function.">Heterogeneity of adipose tissue in development and metabolic function.</a> Journal of Experimental Biology. 221, (2018).</li><li>Kong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IRF4+is+a+key+thermogenic+transcriptional+partner+of+PGC-1&#945;.">IRF4 is a key thermogenic transcriptional partner of PGC-1&#945;.</a> Cell. 158, 69-83 (2014).</li><li>Lee, Y. H., Petkova, A. P., Konkar, A. A., Granneman, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+origins+of+cold-induced+brown+adipocytes+in+adult+mice.">Cellular origins of cold-induced brown adipocytes in adult mice.</a> The FASEB Journal. 29, 286-299 (2015).</li><li>Kim, W. -. S., Park, H. -. S., Sung, J. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pivotal+role+of+PDGF+and+its+receptor+isoforms+in+adipose-derived+stem+cells.">The pivotal role of PDGF and its receptor isoforms in adipose-derived stem cells.</a> Histology and Histopathology. 30 (7), 793-799 (2015).</li><li>Hagberg, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+of+mouse+and+human+adipocytes+for+the+analysis+of+browning+and+cellular+heterogeneity.">Flow cytometry of mouse and human adipocytes for the analysis of browning and cellular heterogeneity.</a> Cell Report. 24, 2746-2756 (2018).</li><li>Madisen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+and+high-throughput+Cre+reporting+and+characterization+system+for+the+whole+mouse+brain.">A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain.</a> Nature Neuroscience. 13, 133-140 (2010).</li><li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid.">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Analytical biochemistry. 150, 76-85 (1985).</li><li>Chey, S., Claus, C., Liebert, U. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+method+for+simultaneous+isolation+of+proteins+and+nucleic+acids.">Improved method for simultaneous isolation of proteins and nucleic acids.</a> Analytical Biochemistry. 411, 164-166 (2011).</li><li>Ford, T., Graham, J., Rickwood, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iodixanol:+A+nonionic+iso-osmotic+centrifugation+medium+for+the+formation+of+self-generated+gradients.">Iodixanol: A nonionic iso-osmotic centrifugation medium for the formation of self-generated gradients.</a> Analytical Biochemistry. 220, 360-366 (1994).</li><li>Kovacovicova, K., Vinciguerra, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+senescent+cells+by+iodixanol+(OptiPrep)+density+gradient-based+separation.">Isolation of senescent cells by iodixanol (OptiPrep) density gradient-based separation.</a> Cell Proliferation. 52, 12674 (2019).</li><li>Lock, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=versatile+manufacturing+of+recombinant+adeno-associated+viral+vectors+at+scale.">versatile manufacturing of recombinant adeno-associated viral vectors at scale.</a> Human Gene Therapy. 21, 1259-1271 (2010).</li><li>Marin, R. D., Crespo-Garcia, S., Wilson, A. M., Sapieha, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RELi+protocol:+Optimization+for+protein+extraction+from+white,+brown,+and+beige+adipose+tissues.">RELi protocol: Optimization for protein extraction from white, brown, and beige adipose tissues.</a> MethodsX. 6, 918-928 (2019).</li><li>Sonna, L. A., Fujita, J., Gaffin, S. L., Lilly, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invited+Review:+effects+of+heat+and+cold+stress+on+mammalian+gene+expression.">Invited Review: effects of heat and cold stress on mammalian gene expression.</a> Journal of Applied Physiology. 92, 1725-1742 (2002).</li><li>Gensch, N., Borchardt, T., Schneider, A., Riethmacher, D., Braun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+autonomous+myogenic+cell+populations+revealed+by+ablation+of+Myf5-expressing+cells+during+mouse+embryogenesis.">Different autonomous myogenic cell populations revealed by ablation of Myf5-expressing cells during mouse embryogenesis.</a> Development. 135, 1597-1604 (2008).</li></ol>

I denna studie utvecklades en ny metod för att isolera BA för gen- och proteinuttrycksanalys.
I ett publicerat BAs-isoleringsprotokoll användes 3% BSA-lösning för att berika BAs12. De berikade BA som uppnåddes genom detta publicerade protokoll kunde dock inte användas direkt för proteinuttrycksanalys. Detta beror på att den koncentrerade BSA som finns i BAs-lösningen stör uppföljningen av proteinextraktionen. När BA berikade i 3% BSA-lösningen behandlades ...

Både möss och människor har två typer av fettvävnader: vit fettvävnad (WAT) och brun fettvävnad (BAT)1. WAT lagrar energi i form av triglycerider i vita adipocyter, och de bruna adipocyterna (BA) i BAT sprider kemisk energi som värme2. Baserat på deras utvecklingsursprung kategoriseras BA vidare i klassiska BA (cBA) som bildades under embryoutveckling och vita adipocyter härledda BA (beige / brite-celler, konverterade från vita adipocyter under stressförhållanden)3. BA är multilokulära och uttrycker det termogena proteinfrikopplingsproteinet 1 (UCP1)4. Interscapular BAT (iBAT) depå är en av de primära cBAs-depåerna i små däggdjur5, medan beige celler sprids inom WAT6. 
På grund av deras natur att sprida energi har BA fått mycket uppmärksamhet som ett terapeutiskt mål för att minska fetma7. För att utnyttja BA för att behandla fetma är det viktigt att förstå de molekylära mekanismerna som styr BAs funktion, överlevnad och rekrytering. Fettvävnader inklusive BAT och WAT är heterogena. Med undantag för adipocyter innehåller fettvävnader många andra celltyper, såsom endotelceller, mesenkymala stamceller och makrofager8. Även om genetiska verktyg för att specifikt tömma kandidatgener hos möss BAs finns tillgängliga, såsom UCP1::Cre line9, är tekniker för att rena BA från BAT eller WAT begränsade, vilket gör det svårt att studera BA på encellstypnivå. Dessutom, utan att erhålla rena BAs, kommer förhållandet mellan BA och icke-BAs inte att vara tydligt avgränsat. Till exempel har trombocyt-härledd tillväxtfaktorreceptor alfa (PDGFRα) använts som en markör för odifferentierade mesenkymala celler, och det uttrycks i endotel- och interstitiella celler i BAT. Vid kallstressad BAT ger PDGFRα-positiva stamceller upphov till nya BAs10. PDGFRα aktiveras av dess ligand PDGF, en tillväxtfaktor som reglerar tillväxten och spridningen av mesenkymala celler11; Det är dock oklart om BA påverkar beteendet hos PDGFRα-positiva stamceller genom att utsöndra PDGF. 
Nyligen har ett BAs-isoleringsprotokoll publicerats, som är baserat på fluorescensaktiverad cellsortering (FACS)12. I detta protokoll användes 3% bovint serumalbumin (BSA) lösning för att separera BA från icke-BA, och de berikade BA: erna renades ytterligare av FACS. Tillämpningen av detta protokoll begränsas av kravet på FACS-processen, som bygger på både utrustning och FACS-driftsupplevelser. I denna studie utvecklades ett nytt protokoll för att isolera BA från BAT. De BA som isoleras av detta protokoll kan användas direkt för gen- och proteinuttrycksstudier. Dessutom tyder data från denna studie på att BA är en viktig PDGF-resurs.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antigen</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PPAR&#947;</td>
			<td>LSBio</td>
			<td>Ls-C368478</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDGFRa</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-398206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UCP1</td>
			<td>R&#38;D system</td>
			<td>IC6158P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemical and solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type II</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17101015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Bromo-3-chloropropane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B62404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)&#160;</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>A-421-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>CT1330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>IB05040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II, protease</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5693</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>EB0107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>IB15724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiQuant Universal Green qPCR Master Mix</td>
			<td>LifeSct</td>
			<td>LS01131905Y</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride Hexahydrate</td>
			<td>Boston BioProducts</td>
			<td>P-855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OneScrip Plus cDNA Synthesis SuperMix</td>
			<td>ABM</td>
			<td>G454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep (Iodixanol)</td>
			<td>Cosmo Bio USA</td>
			<td>AXS-1114542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10x)</td>
			<td>Caisson Labs</td>
			<td>PBL07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (1x)</td>
			<td>Caisson Labs</td>
			<td>PBL06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Boston BioProducts</td>
			<td>P-1435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SimplyBlue safe Stain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC6060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>75746</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol reagent</td>
			<td>Life technoologies</td>
			<td>15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene name (Species)&#160;</td>
			<td>Forward</td>
			<td>Reverse</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pdgfra (Mouse)</td>
			<td>CTCAGCTGTCTCCTCACAgG</td>
			<td>CAACGCATCTCAGAGAAAAGG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pdgfa (Mouse)</td>
			<td>TGTGCCCATTCGCAGGAAGAG</td>
			<td>TTGGCCACCTTGACACTGCG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>36B4(Mouse)</td>
			<td>TGCTGAACATCTCCCCCTTCTC</td>
			<td colspan="2">TCTCCACAGACAATGCCAGGAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ucp1</td>
			<td>ACTGCCACACCTCCAGTCATT</td>
			<td>CTTTGCCTCACTCAGGATTGG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Application</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keyence BZ-X700</td>
			<td>Keyence</td>
			<td colspan="2">Imaging brown adipocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>Dissociate BAT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System</td>
			<td>Applied Biosystem</td>
			<td>Quantitative PCR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Odyssey Fc Imaging system</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>Western blot immaging</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolating brown adipocytes from murine interscapular brown adipose tissue for gene and protein expression analysis

Brun fettvävnad (BAT) är ansvarig för icke-skakande termogenes hos däggdjur, och bruna adipocyter (BA) är de funktionella enheterna i BAT. BA innehåller både multilokulära lipiddroppar och rikliga mitokondrier, och de uttrycker frikopplingsprotein 1 (UCP1). BA kategoriseras i två undertyper baserat på deras ursprung: embryo-härledda klassiska BA (cBA) och vita adipocyter härledda BA. På grund av sin relativt låga densitet kan BA inte isoleras från BAT med traditionell centrifugeringsmetod. I denna studie utvecklades en ny metod för att isolera BA från möss för gen- och proteinuttrycksanalys. I detta protokoll smältes interscapular BAT från vuxna möss med kollagenas och Dispase-lösning, och de dissocierade BA berikades med 6% jodoxanollösning. Isolerade BA lyserades sedan med Trizol-reagens för samtidig isolering av RNA, DNA och protein. Efter RNA-isolering användes den organiska fasen av lysatet för proteinextraktion. Våra data visade att 6% jodoxanollösning effektivt berikade BA utan att störa uppföljande gen- och proteinuttrycksstudier. Trombocyt-härledd tillväxtfaktor (PDGF) är en tillväxtfaktor som reglerar tillväxten och spridningen av mesenkymala celler. Jämfört med den bruna fettvävnaden hade isolerade BA signifikant högre uttryck av Pdgfa. Sammanfattningsvis ger denna nya metod en plattform för att studera biologin hos bruna adipocyter på en enda celltypsnivå.

Beredning av interakapulär BAT för isolering av bruna adipocyter Isoleringsprocessen för bruna adipocyter (BAs) visas i figur 1A. Hela processen, från beredning av BAT- och digestions-/separationslösningar till att erhålla isolerade BAs, kommer att ta cirka 4 timmar.
Hos vuxna möss finns riklig BAT i den interscapulära regionen. Denna interskapulära BAT (iBAT) täcks av muskellager och WAT (figur 1B). Inna...

Watch this Scientific Journal Video about Isolating Brown Adipocytes from Murine Interscapular Brown Adipose Tissue for Gene and Protein Expression Analysis at JoVE.com

Isolating Brown Adipocytes from Murine Interscapular Brown Adipose Tissue for Gene and Protein Expression Analysis

Denna studie beskriver en ny metod för att isolera murinbruna adipocyter för gen- och proteinuttrycksanalys.

Isolerande bruna adipocyter från murin interscapular brun fettvävnad för gen- och proteinuttrycksanalys

Brown adipose tissue (BAT) is responsible for non-shivering thermogenesis in mammals, and brown adipocytes (BAs) are the functional units of BAT. BAs ...

För att undersöka de biologiska aspekterna av brun fettvävnad är det viktigt att rensa renad brun fettstorlek. För närvarande kom ingen i brun fettstorleksrening och massorna finns tillgängliga. I den här studien utvecklade vi ett enkelt protokoll för att ta itu med denna fråga.Nu krävs en färdighet för detta protokoll. Det behöver mycket färre studiematerial än andra metoder och den renade bruna fettstorleken kan användas direkt för gen- och proteinuttrycksanalys. Detta protokoll ger en ny metod för att studera biologin för klassisk brun fettstorlek.Det kan också appliceras för att studera vita adipocyter brunningsprocess. Demonstrerar proceduren kommer att vara Amanda, en forskningsassistent från mitt laboratorium. Börja med att placera kolven med BAT och uppslutningslösning på en magnetomrörare med 60 varv per minut i en 35 grader Celsius inkubator i 30 minuter.Använd en pipett på en milliliter för att störa de aggregerade vävnadsklumparna av BAT-skivor runt omrörarstången. Efter matsmältningen, placera ett 70 mikrometer silfilter ovanpå ett rent 50 ml centrifugrör och pipettera runt fyra milliliter cellsuspension genom silen. Tvätta sedan med fyra milliliter 12% jodoxanollösning.Pipettera upp och ner för att blanda cellerna med jodoxanollösning och överför sedan cellblandningen till två klara fem milliliter polystyrenprovrör. Placera polystyrenrören som innehåller cellblandningen på is i en timme, vilket får BA: erna att bilda ett lager på toppen. Ta ut 20 mikroliter av de isolerade BA för mikroskopundersökning.För RNA- och proteinisolering, pipettera BA-skiktet i två 1,7 ml mikrocenterfugerör. Ta sedan försiktigt bort den överdrivna jodoxonala lösningen utan att störa BA-skiktet. Tillsätt sedan en milliliter TRIzol i celllösningen för att samtidigt isolera RNA, DNA och protein och blanda tillräckligt för att lysa cellerna.För att separera faserna, tillsätt 200 mikroliter kloroform och centrifug till röret vid 9 981 G i 10 minuter vid fyra grader Celsius. Efter centrifugering, använd vattenfasen för RNA-isolering. Överför 300 mikroliter av den organiska fasen till ett två milliliter mikrocentrifugrör och tillsätt 750 mikroliter 100% etanol.Efter virvel i 10 sekunder, tillsätt 200 mikroliter 1-Bromo-3-klorpropan och virvel igen i 10 sekunder. Tillsätt 600 mikroliter dubbeldestillerat vatten innan du virvlar i 10 sekunder. Låt den blandade lösningen stå i 10 minuter vid rumstemperatur.Efter centrifugering tillsätt 9 981 G i 10 minuter vid fyra grader Celsius. Faserna kommer att separeras med proteinfasen lokaliserad i mellanskiktet. Ta bort den övre vattenlösningen och tillsätt en milliliter 100% etanol i den återstående lösningen.Efter centrifugering vid 9 981 G i 10 minuter vid fyra grader Celsius, kassera supernatanten och tvätta pelleten med en milliliter 100% etanol. Centrifugera vid 9 981 G i 10 minuter vid fyra grader Celsius. Efter att ha tagit bort supernatanten, lufttorka pelleten i 10 minuter vid rumstemperatur och mät vikten på den våta pelleten.Tillsätt 1% SDS-lösning i ett förhållande av 20 mikroliter per milligram pellet. Lös upp pelleten helt genom att sätta röret i en uppvärmd shaker vid 55 grader Celsius och 11 G i fem till 10 minuter. I protokollet användes PBS innehållande 3% BSA för att separera BA från BAT.De isolerade cellerna var hallonformade med multilokulära lipiddroppar inuti och var tdTom-positiva, vilket bekräftade att de var BA. Protein isolerades från BA med ett förbättrat GTPC-protokoll och undersöktes sedan med en SDS-PAGE-gel. Ett dominerande band associerat med BSA observerades i BA-provet, vilket tyder på dess interferens i proteinutvinning.För att undvika BSA-interferens användes en 6% jodoxonal lösning för isolering av BA, som hade en typisk hallonform och innehöll multilokulära lipiddroppar. Proteiner extraherade från dessa BA separerades väl i SDS-PAGE-gelén. Dessa celler visade sig vara tdToto-positiva medan celler som återhämtades från pelleten var tdTomato-negativa utan några uppenbara lipiddroppar, vilket tyder på effektiv separation av BA från de fettfria cellerna.I genuttrycksanalys var mRNA-nivåerna av UCP1 och PDGFA signifikant högre i de isolerade BA: erna. Men mRNA för PDGFRA upptäcktes bara i BAT. UCP1-protein hittades berikat i isolerade BA.EDGFR-alfa upptäcktes i BAT, men inte i isolerade BA. Dessa resultat bekräftar effektiviteten hos metoden för att isolera BA och visar att de isolerade BAs är lämpliga för gen- och proteinuttrycksstudier. När du försöker detta protokoll, använd färsk matsmältningsbuffert för att dissociera brun fettvävnad och undvika vävnadsklumpbildning under matsmältningsperioden.Denna nya metod gör det enkelt att undersöka biologin hos brun fettvävnad på en enda cellkrannivå. Genom att tillämpa denna metod kan man utföra GN- och proteinuttrycksstudier med rena bruna adipocyter som exakt dissekerar bruna adipocyter genuttrycksprogram, utan att oroa sig för kontaminering ursprungligen från fettfria celler.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Real-time Imaging of Leukotriene B4 Mediated Cell Migration and BLT1 Interactions with &beta;-arrestin

Real-time Imaging of Leukotriene B4 Mediated Cell Migration and BLT1 Interactions with ÃƒÅ½Ã‚Â²-arrestin

Realtid avbildning av Leukotriene B 4 Medierad Cell Migration och BLT1 Interaktioner med β-arrestin

G-protein coupled receptors (GPCRs) belong to the seven transmembrane protein family and mediate the transduction of extracellular signals to ...

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Använda Bioluminescent Imaging för att undersöka synergi mellan Streptococcus pneumoniae Och influensa A-virus i modersmjölksersättning Möss

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

Skilja funktionella roller av genuttryck från immuna och icke-immuna celler i mus Kolit av benmärgstransplantation

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice ...

Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer's Patches

Isolera och immunofärgning Lymfocyter och dendritiska celler från murina Peyers plack

Peyer's  patches (PPs) are integral components of the gut-associated lymphoid tissues  (GALT) and play a central role in intestinal immunosurveillance and ...

Isolation of Adipose Tissue Immune Cells

Isolering av immun fettvävnad celler

The discovery of increased macrophage infiltration in  the adipose tissue (AT) of obese rodents and humans has led to an  intensification of interest in ...

Isolation of Murine Peritoneal Macrophages to Carry Out Gene Expression Analysis Upon Toll-like Receptors Stimulation

Isolering av Murina peritoneala makrofager att utföra genuttrycksanalys Vid Toll-like receptorer Stimulering

During infection and inflammation, circulating monocytes leave the bloodstream and migrate into tissues, where they differentiate into macrophages. ...

Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials

Kvalitativa och kvantitativa analyser för att upptäcka och karakterisering av protein Antimicrobials

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods ...

SILAC Based Proteomic Characterization of Exosomes from HIV-1 Infected Cells

SILAC Based proteomik karakterisering av exosomes från HIV-1-infekterade celler

Proteomics is the large-scale analysis of proteins. Proteomic techniques, such as liquid chromatography tandem mass spectroscopy (LC-MS/MS), can ...

Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System

Isolera lymfocyter från mus små Intestinal immunförsvaret

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to ...

Isolation, Expansion, and Adipogenic Induction of CD34+CD31+ Endothelial Cells from Human Omental and Subcutaneous Adipose Tissue

Isolering, Expansion och adipogena induktion av CD34 + CD31 + Endothelial celler från mänskliga Omental och subkutan fettvävnad

Obesity is accompanied by an extensive remodeling of adipose tissue primarily via adipocyte hypertrophy. Extreme adipocyte growth results in a poor ...