Name: isolating brown adipocytes from murine interscapular brown adipose tissue for gene and protein expression analysis
Uploaded: 2021-03-12T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolating Brown Adipocytes from Murine Interscapular Brown Adipose Tissue for Gene and Protein Expression Analysis at JoVE.com

Z. Lin, Ulusal Sağlık Enstitüleri HL138454-01 ve Masonik Tıbbi Araştırma Enstitüsü fonları tarafından desteklenmiştir.

Tüm fareler patojensiz koşullarda tutuldu ve tüm prosedürler Masonik Tıbbi araştırma Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylandı. UCP1::Cre9 ve Rosa 26tdDomates fareleri hatları13 daha önce bildirilmişti. Tüm fareler 12 saatlik bir ışık / karanlık döngüsü ile oda sıcaklığında tutuldu.
1. Solüsyonların ve kahverengi yağ dokusunun (BAT) hazırlanması
<ol><li>15 mL santrifüj...

<ol>
	<li>Zwick, R. K., Guerrero-Juarez, C. F., Horsley, V., Plikus, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomical,+physiological,+and+functional+diversity+of+adipose+tissue.">Anatomical, physiological, and functional diversity of adipose tissue.</a> Cell Metabolism. 27, 68-83 (2018).</li><li>Symonds, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brown+adipose+tissue+growth+and+development.">Brown adipose tissue growth and development.</a> Scientifica. 2013, 305763 (2013).</li><li>Giralt, M., Villarroya, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=White,+brown,+beige/brite:+Different+adipose+cells+for+different+functions.">White, brown, beige/brite: Different adipose cells for different functions.</a> Endocrinology. 154, 2992-3000 (2013).</li><li>Cannon, B., Nedergaard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brown+adipose+tissue:+function+and+physiological+significance.">Brown adipose tissue: function and physiological significance.</a> Physiological Reviews. 84, 277-359 (2004).</li><li>Cinti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adipose+organ.">The adipose organ.</a> Prostaglandins, Leukotrienes and Essential Fatty Acids. 73, 9-15 (2005).</li><li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beige+adipocytes+are+a+distinct+type+of+thermogenic+fat+cell+in+mouse+and+human.">Beige adipocytes are a distinct type of thermogenic fat cell in mouse and human.</a> Cell. 150, 366-376 (2012).</li><li>Cypess, A. M., Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brown+fat+as+a+therapy+for+obesity+and+diabetes.">Brown fat as a therapy for obesity and diabetes.</a> Current Opinion in Endocrinology, Diabetes and Obesity. 17, 143-149 (2010).</li><li>Schoettl, T., Fischer, I. P., Ussar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+adipose+tissue+in+development+and+metabolic+function.">Heterogeneity of adipose tissue in development and metabolic function.</a> Journal of Experimental Biology. 221, (2018).</li><li>Kong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IRF4+is+a+key+thermogenic+transcriptional+partner+of+PGC-1&#945;.">IRF4 is a key thermogenic transcriptional partner of PGC-1&#945;.</a> Cell. 158, 69-83 (2014).</li><li>Lee, Y. H., Petkova, A. P., Konkar, A. A., Granneman, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+origins+of+cold-induced+brown+adipocytes+in+adult+mice.">Cellular origins of cold-induced brown adipocytes in adult mice.</a> The FASEB Journal. 29, 286-299 (2015).</li><li>Kim, W. -. S., Park, H. -. S., Sung, J. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pivotal+role+of+PDGF+and+its+receptor+isoforms+in+adipose-derived+stem+cells.">The pivotal role of PDGF and its receptor isoforms in adipose-derived stem cells.</a> Histology and Histopathology. 30 (7), 793-799 (2015).</li><li>Hagberg, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+of+mouse+and+human+adipocytes+for+the+analysis+of+browning+and+cellular+heterogeneity.">Flow cytometry of mouse and human adipocytes for the analysis of browning and cellular heterogeneity.</a> Cell Report. 24, 2746-2756 (2018).</li><li>Madisen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+and+high-throughput+Cre+reporting+and+characterization+system+for+the+whole+mouse+brain.">A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain.</a> Nature Neuroscience. 13, 133-140 (2010).</li><li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid.">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Analytical biochemistry. 150, 76-85 (1985).</li><li>Chey, S., Claus, C., Liebert, U. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+method+for+simultaneous+isolation+of+proteins+and+nucleic+acids.">Improved method for simultaneous isolation of proteins and nucleic acids.</a> Analytical Biochemistry. 411, 164-166 (2011).</li><li>Ford, T., Graham, J., Rickwood, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iodixanol:+A+nonionic+iso-osmotic+centrifugation+medium+for+the+formation+of+self-generated+gradients.">Iodixanol: A nonionic iso-osmotic centrifugation medium for the formation of self-generated gradients.</a> Analytical Biochemistry. 220, 360-366 (1994).</li><li>Kovacovicova, K., Vinciguerra, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+senescent+cells+by+iodixanol+(OptiPrep)+density+gradient-based+separation.">Isolation of senescent cells by iodixanol (OptiPrep) density gradient-based separation.</a> Cell Proliferation. 52, 12674 (2019).</li><li>Lock, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=versatile+manufacturing+of+recombinant+adeno-associated+viral+vectors+at+scale.">versatile manufacturing of recombinant adeno-associated viral vectors at scale.</a> Human Gene Therapy. 21, 1259-1271 (2010).</li><li>Marin, R. D., Crespo-Garcia, S., Wilson, A. M., Sapieha, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RELi+protocol:+Optimization+for+protein+extraction+from+white,+brown,+and+beige+adipose+tissues.">RELi protocol: Optimization for protein extraction from white, brown, and beige adipose tissues.</a> MethodsX. 6, 918-928 (2019).</li><li>Sonna, L. A., Fujita, J., Gaffin, S. L., Lilly, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invited+Review:+effects+of+heat+and+cold+stress+on+mammalian+gene+expression.">Invited Review: effects of heat and cold stress on mammalian gene expression.</a> Journal of Applied Physiology. 92, 1725-1742 (2002).</li><li>Gensch, N., Borchardt, T., Schneider, A., Riethmacher, D., Braun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+autonomous+myogenic+cell+populations+revealed+by+ablation+of+Myf5-expressing+cells+during+mouse+embryogenesis.">Different autonomous myogenic cell populations revealed by ablation of Myf5-expressing cells during mouse embryogenesis.</a> Development. 135, 1597-1604 (2008).</li></ol>

Bu çalışmada, gen ve protein ekspresyon analizi için BA'ları izole etmek için yeni bir yöntem geliştirilmiştir.
Yayınlanmış bir BA izolasyon protokolünde, BA'ları zenginleştirmek için% 3 BSA çözeltisi kullanılmıştır12. Bununla birlikte, bu yayınlanmış protokol ile elde edilen zenginleştirilmiş BA'lar, protein ekspresyon analizi için doğrudan kullanılamamıştır. Bunun nedeni, BA çözeltisinde bulunan konsantre BSA'nın, takip eden protein...

Hem fareler hem de insanlar iki tür yağ dokusuna sahiptir: beyaz yağ dokusu (WAT) ve kahverengi yağ dokusu (BAT)1. WAT enerjiyi beyaz adipositlerde trigliseritler şeklinde depolar ve BAT'ın kahverengi adipositleri (BA'lar) kimyasal enerjiyi ısı2 olarak dağıtır. Gelişimsel kökenlerine bağlı olarak, BA'lar embriyo gelişimi sırasında oluşan klasik BA'lar (cBA'lar) ve beyaz adipositler türevi BA'lar (stres koşulları altında beyaz adipositlerden dönüştürülen bej / brit hücreleri) olarak kategorize edilir3. BA'lar multilokülerdir ve termojenik protein ayrışma proteini 1'i (UCP1)4 eksprese eder. İnterskapüler BAT (iBAT) deposu, küçük memelilerde birincil cBA depolarından biridir5, bej hücreler ise WAT6 içinde dağılmıştır. 
Enerjiyi dağıtma doğası gereği, BA'lar obeziteyi azaltmak için terapötik bir hedef olarak çok dikkat çekmiştir7. Obeziteyi tedavi etmek amacıyla BA'lardan yararlanmak için, BA'ların işlevini, hayatta kalmasını ve işe alımını kontrol eden moleküler mekanizmaları anlamak önemlidir. BAT ve WAT gibi yağ dokuları heterojendir. Adipositler dışında, yağ dokuları endotel hücreleri, mezenkimal kök hücreler ve makrofajlar8 gibi birçok başka hücre tipi içerir. UCP1: Cre hat9 gibi farelerde aday genleri spesifik olarak tüketmek için genetik araçlar mevcut olsa da, BA'ları BAT veya WAT'tan arındırma teknikleri sınırlıdır ve bu da BA'ları tek hücreli tip düzeyinde incelemeyi zorlaştırmaktadır. Ek olarak, saf BA'lar elde edilmeden, BA'lar ve BA'lar olmayanlar arasındaki ilişki açıkça tanımlanmayacaktır. Örneğin, trombosit kaynaklı büyüme faktörü reseptörü alfa (PDGFRa), farklılaşmamış mezenkimal hücreler için bir belirteç olarak kullanılmıştır ve BAT'nin endotel ve interstisyel hücrelerinde eksprese edilir. Soğuk stresli BAT'ta, PDGFRα pozitif progenitör hücreler yeni BA10'a yol açar. PDGFRa, mezenkimal hücrelerin büyümesini ve çoğalmasını düzenleyen bir büyüme faktörü olan ligand PDGF'si tarafından aktive edilir11; Bununla birlikte, BA'ların PDGF'yi salgılayarak PDGFRα pozitif progenitör hücrelerin davranışını etkileyip etkilemediği açık değildir. 
Son zamanlarda, floresan ile aktive edilmiş hücre sıralamaya (FACS) dayanan bir BA izolasyon protokolü yayınlanmıştır12. Bu protokolde, BA'ları BA olmayanlardan ayırmak için% 3 sığır serum albümini (BSA) çözeltisi kullanıldı ve zenginleştirilmiş BA'lar FACS tarafından daha da saflaştırıldı. Bu protokolün uygulanması, hem ekipmana hem de FACS operasyon deneyimlerine dayanan FACS sürecinin gerekliliği ile sınırlıdır. Bu çalışmada, BA'ları BAT'tan izole etmek için yeni bir protokol geliştirilmiştir. Bu protokol tarafından izole edilen BA'lar doğrudan gen ve protein ekspresyon çalışmaları için kullanılabilir. Ayrıca, bu çalışmadan elde edilen veriler, BA'ların önemli bir PDGF kaynağı olduğunu göstermektedir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antigen</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PPAR&#947;</td>
			<td>LSBio</td>
			<td>Ls-C368478</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDGFRa</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-398206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UCP1</td>
			<td>R&#38;D system</td>
			<td>IC6158P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemical and solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type II</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17101015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Bromo-3-chloropropane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B62404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)&#160;</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>A-421-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>CT1330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>IB05040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II, protease</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5693</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>EB0107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>IB15724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiQuant Universal Green qPCR Master Mix</td>
			<td>LifeSct</td>
			<td>LS01131905Y</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride Hexahydrate</td>
			<td>Boston BioProducts</td>
			<td>P-855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OneScrip Plus cDNA Synthesis SuperMix</td>
			<td>ABM</td>
			<td>G454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep (Iodixanol)</td>
			<td>Cosmo Bio USA</td>
			<td>AXS-1114542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10x)</td>
			<td>Caisson Labs</td>
			<td>PBL07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (1x)</td>
			<td>Caisson Labs</td>
			<td>PBL06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Boston BioProducts</td>
			<td>P-1435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SimplyBlue safe Stain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC6060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>75746</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol reagent</td>
			<td>Life technoologies</td>
			<td>15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene name (Species)&#160;</td>
			<td>Forward</td>
			<td>Reverse</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pdgfra (Mouse)</td>
			<td>CTCAGCTGTCTCCTCACAgG</td>
			<td>CAACGCATCTCAGAGAAAAGG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pdgfa (Mouse)</td>
			<td>TGTGCCCATTCGCAGGAAGAG</td>
			<td>TTGGCCACCTTGACACTGCG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>36B4(Mouse)</td>
			<td>TGCTGAACATCTCCCCCTTCTC</td>
			<td colspan="2">TCTCCACAGACAATGCCAGGAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ucp1</td>
			<td>ACTGCCACACCTCCAGTCATT</td>
			<td>CTTTGCCTCACTCAGGATTGG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Application</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keyence BZ-X700</td>
			<td>Keyence</td>
			<td colspan="2">Imaging brown adipocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>Dissociate BAT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System</td>
			<td>Applied Biosystem</td>
			<td>Quantitative PCR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Odyssey Fc Imaging system</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>Western blot immaging</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolating brown adipocytes from murine interscapular brown adipose tissue for gene and protein expression analysis

Kahverengi yağ dokusu (BAT) memelilerde titremeyen termojenezden sorumludur ve kahverengi adipositler (BA'lar) BAT'ın fonksiyonel birimleridir. BA'lar hem multiloküler lipid damlacıkları hem de bol miktarda mitokondri içerir ve ayrışma proteini 1'i (UCP1) eksprese ederler. BA'lar, kökenlerine göre iki alt tipe ayrılır: embriyo kaynaklı klasik BA'lar (cBA'lar) ve beyaz adipositlerden türetilmiş BA'lar. Nispeten düşük yoğunlukları nedeniyle, BA'lar geleneksel santrifüjleme yöntemiyle BAT'tan izole edilemez. Bu çalışmada, gen ve protein ekspresyon analizi için BA'ları farelerden izole etmek için yeni bir yöntem geliştirilmiştir. Bu protokolde, yetişkin farelerden interskapuler BAT, Kollajenaz ve Dispase çözeltisi ile sindirildi ve ayrışmış BA'lar% 6 iyodiksanol çözeltisi ile zenginleştirildi. İzole BA'lar daha sonra RNA, DNA ve proteinin eşzamanlı izolasyonu için Trizol reaktifi ile lize edildi. RNA izolasyonundan sonra, lizatın organik fazı protein ekstraksiyonu için kullanıldı. Verilerimiz,% 6'lık iyotiksanol çözeltisinin, takip geni ve protein ekspresyon çalışmalarına müdahale etmeden BA'ları verimli bir şekilde zenginleştirdiğini göstermiştir. Trombosit kaynaklı büyüme faktörü (PDGF), mezenkimal hücrelerin büyümesini ve çoğalmasını düzenleyen bir büyüme faktörüdür. Kahverengi yağ dokusu ile karşılaştırıldığında, izole BA'lar Pdgfa'nın anlamlı derecede daha yüksek ekspresyonuna sahipti. Özetle, bu yeni yöntem, kahverengi adipositlerin biyolojisini tek bir hücre tipi seviyesinde incelemek için bir platform sağlar.

Kahverengi adiposit izolasyonu için interakapuler BAT'ın hazırlanması Kahverengi adipositler (BA'lar) izolasyon süreci Şekil 1A'da gösterilmiştir. BAT ve sindirim / ayırma çözeltilerinin hazırlanmasından izole edilmiş BA'ların elde edilmesine kadar tüm süreç yaklaşık 4 saat sürecektir.
Yetişkin farelerde, interskapuler bölgede bol miktarda BAT bulunur. Bu interskapuler BAT (iBAT) kas katmanları ve WAT ile kaplıdır (<st...

Watch this Scientific Journal Video about Isolating Brown Adipocytes from Murine Interscapular Brown Adipose Tissue for Gene and Protein Expression Analysis at JoVE.com

Isolating Brown Adipocytes from Murine Interscapular Brown Adipose Tissue for Gene and Protein Expression Analysis

Bu çalışmada, gen ve protein ekspresyon analizi için murin kahverengi adipositlerin izole edilmesinde yeni bir yöntem açıklanmaktadır.

Gen ve Protein İfade Analizi için Murin İnterskapüler Kahverengi Yağ Dokusundan Kahverengi Adipositlerin İzolesi

Brown adipose tissue (BAT) is responsible for non-shivering thermogenesis in mammals, and brown adipocytes (BAs) are the functional units of BAT. BAs ...

Kahverengi yağ dokusunun biyoloji yönlerini araştırmak için, saflaştırılmış kahverengi yağ boyutunu temizlemek önemlidir. Şu anda kahverengi yağ büyüklüğünde saflaştırma yapılmadı ve kütleler mevcut. Bu çalışmada, bu konuyu ele almak için basit bir protokol geliştirdik.Şimdi, bu protokol için bir beceri gereklidir. Diğer yöntemlerden çok daha az çalışma materyaline ihtiyaç duyar ve saflaştırılmış kahverengi yağ boyutu doğrudan gen ve protein ekspresyon analizi için kullanılabilir. Bu protokol, klasik kahverengi yağ boyutunun biyolojisini incelemek için yeni bir yöntem sağlar.Beyaz adipositlerin kahverengileşme sürecini incelemek için de uygulanabilir. Prosedürü gösteren, laboratuvarımdan bir araştırma görevlisi olan Amanda olacak. BAT ve sindirim çözeltisi içeren şişeyi, 35 santigrat derecelik bir inkübatörde dakikada 60 dönüşte manyetik bir karıştırıcıya 30 dakika boyunca yerleştirerek başlayın.Karıştırıcı çubuğunun etrafındaki BAT dilimlerinin toplanmış doku kümelerini bozmak için bir mililitrelik pipet kullanın. Sindirimden sonra, 50 mililitrelik temiz bir santrifüj tüpünün üzerine 70 mikrometrelik bir süzgeç filtresi yerleştirin ve süzgeçten yaklaşık dört mililitre hücre süspansiyonu pipet yerleştirin. Daha sonra dört mililitre% 12 iyodiksanol çözeltisi ile yıkayın.Hücreleri iyotlaksanol çözeltisi ile karıştırmak için yukarı ve aşağı pipetleyin, ardından hücre karışımını iki şeffaf beş mililitrelik polistiren test tüpüne aktarın. Hücre karışımını içeren polistiren tüpleri bir saat boyunca buz üzerine yerleştirin ve BA'ların üstte bir tabaka oluşturmasına neden olun. Mikroskop incelemesi için izole edilmiş BA'ların 20 mikrolitresini çıkarın.RNA ve protein izolasyonu için, BA tabakasını iki adet 1.7 mililitrelik mikrocenterfuge tüpüne pipetleyin. Ardından, BA tabakasını bozmadan aşırı iyodiksonal çözeltiyi dikkatlice çıkarın. Daha sonra RNA, DNA ve proteini aynı anda izole etmek için hücre çözeltisine bir mililitre TRIzol ekleyin ve hücreleri lize etmek için yeterince karıştırın.Fazları ayırmak için, tüpe dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 9.981 G'de 200 mikrolitre kloroform ve santrifüj ekleyin. Santrifüjlemeden sonra, RNA izolasyonu için sulu fazı kullanın. Organik fazın 300 mikrolitresini iki mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve 750 mikrolitre% 100 etanol ekleyin.10 saniye boyunca vorteksten sonra, 200 mikrolitre 1-Bromo-3-kloropropan ekleyin ve 10 saniye boyunca tekrar vorteks ekleyin. 10 saniye boyunca vortekslemeden önce 600 mikrolitre çift damıtılmış su ekleyin. Karışık çözeltinin oda sıcaklığında 10 dakika bekletin.Santrifüjlemeden sonra, dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 9.981 G ekleyin. Fazlar, orta tabakada lokalize olan protein fazı ile ayrılacaktır. Üst sulu çözeltiyi çıkarın ve kalan çözeltiye bir mililitre% 100 etanol ekleyin.Dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 9, 981 G'de santrifüjlemeyi takiben, süpernatantı atın ve peleti bir mililitre% 100 etanol ile yıkayın. Dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 9.981 G'de santrifüj. Süpernatanı çıkardıktan sonra, pelet oda sıcaklığında 10 dakika boyunca hava ile kurutun ve ıslak peletin ağırlığını ölçün.Pelet miligramı başına 20 mikrolitre oranında %1 SDS çözeltisi ekleyin. Tüpü beş ila 10 dakika boyunca 55 santigrat derece ve 11 G'de ısıtılmış bir çalkalayıcıya koyarak peleti tamamen çözün. Protokolde, BA'ları BAT'den ayırmak için %3 BSA içeren PBS kullanılmıştır.İzole edilen hücreler, içinde multiloküler lipid damlacıkları ile ahududu şeklindeydi ve tdTom pozitifti ve BA olduklarını doğruladı. Protein, geliştirilmiş bir GTPC protokolü ile BA'lardan izole edildi ve daha sonra bir SDS-PAGE jeli ile incelendi. BA örneğinde BSA ile ilişkili baskın bir bant gözlendi ve bu da protein ekstraksiyonuna girişimini düşündürdü.BSA girişimini önlemek için, tipik bir ahududu şekline sahip olan ve çok loküler lipit damlacıkları içeren BA'ların izolasyonu için% 6'lık bir iyodiksonal çözelti kullanıldı. Bu BA'lardan ekstrakte edilen proteinler SDS-PAGE jelinde iyi ayrıldı. Bu hücrelerin tdDomates pozitif olduğu bulunurken, peletten geri kazanılan hücreler belirgin lipit damlacıkları olmadan tdDomates negatifti, bu da BA'ların yağ olmayan hücrelerden etkili bir şekilde ayrıldığını düşündürmektedir.Gen ekspresyon analizinde, UCP1 ve PDGFA'nın mRNA seviyeleri izole BA'larda anlamlı derecede yüksekti. Ancak PDGFRA'nın mRNA'sı sadece BAT'de tespit edildi. UCP1 proteini izole BA'larda zenginleştirilmiş olarak bulundu.EDGFR alfa BAT'ta tespit edildi, ancak izole BA'larda tespit edilmedi. Bu sonuçlar, BA'ları izole etme yönteminin etkinliğini doğrulamakta ve izole edilen BA'ların gen ve protein ekspresyon çalışmaları için uygun olduğunu göstermektedir. Bu protokolü denerken, kahverengi yağ dokusunu ayrıştırmak ve sindirim döneminde doku kümelenmesi oluşumunu önlemek için taze sindirim tamponu kullanın.Bu yeni yöntem, kahverengi yağ dokusunun biyolojisini tek bir hücre musluk seviyesinde araştırmayı kolaylaştırır. Bu yöntemi uygulayarak, orijinal olarak yağsız hücrelerden kontaminasyon konusunda endişelenmeden, kahverengi adipositler gen ekspresyon programını hassas bir şekilde diseke eden saf kahverengi adipositlerle GN ve protein ekspresyon çalışmaları yapılabilir.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Real-time Imaging of Leukotriene B4 Mediated Cell Migration and BLT1 Interactions with &beta;-arrestin

Real-time Imaging of Leukotriene B4 Mediated Cell Migration and BLT1 Interactions with ÃƒÅ½Ã‚Â²-arrestin

Lökotrien B Gerçek zamanlı görüntüleme 4 Hücre aracılığı ile Göç ve β-arrestin BLT1 Etkileşimleri

G-protein coupled receptors (GPCRs) belong to the seven transmembrane protein family and mediate the transduction of extracellular signals to ...

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Yılları arasında sinerjistik Araştırma Bioluminescent Görüntüleme kullanma Streptococcus pneumoniae Bebek Fare ve İnfluenza A Virüsü

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

Kemik İliği Transplantasyonu tarafından Fare Kolit immün ve non-immün Hücreler Gen Ekspresyonu İşlevsel Rolleri Farklılaşan

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice ...

Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer's Patches

Lenfositler ve mürin Peyer en Yamalar itibaren Dendritik Hücreler İzolasyon Ve immün

Peyer's  patches (PPs) are integral components of the gut-associated lymphoid tissues  (GALT) and play a central role in intestinal immunosurveillance and ...

Isolation of Adipose Tissue Immune Cells

Yağ Doku Bağışıklık Hücre İzolasyonu

The discovery of increased macrophage infiltration in  the adipose tissue (AT) of obese rodents and humans has led to an  intensification of interest in ...

Isolation of Murine Peritoneal Macrophages to Carry Out Gene Expression Analysis Upon Toll-like Receptors Stimulation

Fare Periton Makrofagların izolasyonu Toll-benzeri reseptörler Uyarım üzerine Gen İfadesi Analizi Yapacak

During infection and inflammation, circulating monocytes leave the bloodstream and migrate into tissues, where they differentiate into macrophages. ...

Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials

Nitel ve Nicel Saptanması için Tahliller ve Protein Antimikrobiyal karakterizasyonu

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods ...

SILAC Based Proteomic Characterization of Exosomes from HIV-1 Infected Cells

HIV-1 enfekte olmuş hücrelerden eksozom SILAC Bazlı proteomik Karakterizasyon

Proteomics is the large-scale analysis of proteins. Proteomic techniques, such as liquid chromatography tandem mass spectroscopy (LC-MS/MS), can ...

Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System

Lenfositler fare küçük bağırsak bağışıklık sistemi yalıtma

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to ...

Isolation, Expansion, and Adipogenic Induction of CD34+CD31+ Endothelial Cells from Human Omental and Subcutaneous Adipose Tissue

Yalıtım, genişleme ve Adipojenik indüksiyon CD34 + CD31 + insan Omental ve deri altı yağ dokusu endotel hücrelerden

Obesity is accompanied by an extensive remodeling of adipose tissue primarily via adipocyte hypertrophy. Extreme adipocyte growth results in a poor ...