Name: natural killer (nk) and car-nk cell expansion method using membrane bound-il-21-modified b cell line
Uploaded: 2022-02-08T13:30:00
Duration: 11 min 2 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Natural Killer NK and CAR-NK Cell Expansion Method using Membrane Bound-IL-21-Modified B Cell Line at JoVE.com

Мы хотели бы поблагодарить членов лаборатории Лю (д-ра Сян-чи Цзэна, д-ра Сюэнина Вана и д-ра Чи-Сюн Чэня) за их комментарии к рукописям. Мы хотели бы поблагодарить д-ра Джанпьетро Дотти за векторы SFG и д-ра Эрика Лонга за 721.221 клетки. Эта работа была частично поддержана HL125018 (D. Liu), AI124769 (D. Liu), AI129594 (D. Liu), AI130197 (D. Liu) и Rutgers-Health Advance Funding (программа NIH REACH), U01HL150852 (R. Panettieri, S. Libutti и R. Pasqualini), S10OD025182 (D. Liu) и Rutgers University-New Jersey Medical School Startup funding for D. Liu Laboratory.

Ткани человека и работа, связанная с кровью, в этом протоколе соответствует руководящим принципам Совета по институциональному обзору Университета Рутгерса (IRB).
1. Расширение NK-клеток из тканей печени (день 0), как показано на рисунке 1.
ПРИМЕЧАНИЕ: Начальное количество клеток и жизнеспособность сильно коррелируют со временем с момента удаления органа и начальным количеством образца ткани. Однако, если ткани поместить в 30 мл сбалансированного соляного раствора Хэнка (HBSS) и хранить на льду или в холодильнике при 4 °C в течение ночи, NK-клетки все еще могут быть расширены с высокой чистотой и жизнеспособностью до 24 ч спустя.
<ol><li>Идентификация жизнеспособных участков тканей для получения лимфоцитов из тканей и срезов с помощью стерильного хирургического оборудования.</li>
	<li>Поместите ткани в 30 мл HBSS (без кальция или магния) и держите на льду до готовности к выделению.</li>
	<li>Измельчите ткань на кубики <0,5 см с помощью стерильных бритвенных лезвий или ножниц и щипцов внутри шкафа для биобезопасности.</li>
	<li>Приготовьте 1x раствор коллагеназы IV (1 мг/мл), разбавив 10x бульон в HBSS (10x Collagenase IV: 10 мг/мл или ~200 Ед/мл).</li>
	<li>Поместите измельченные кусочки ткани в тканевые диссоциаторные трубки. Заполните пробирки не более чем 4 г ткани и погрузите кусочки ткани в ~10 мл 1x коллагеназы IV. ПРИМЕЧАНИЕ: Использование ДНКазы I не рекомендуется, так как это может немного снизить жизнеспособность и выход NK. Пожалуйста, обратитесь к Таблице материалов для конкретных используемых тканевых диссоциаторных трубок.</li>
	<li>Поместите трубки тканевого диссоциатора в тканевой диссоциатор и смешайте при 37 °C, чтобы тщательно измельчить ткань. ПРИМЕЧАНИЕ: Для ткани печени это может занять более 30 минут. Для более рыхлой ткани может быть достаточно около 15 минут. Пожалуйста, обратитесь к Таблице материалов для конкретных тканевых диссоциаторных трубок и используемого тканевого диссоциатора.</li>
	<li>Удалите тканевые диссоциаторные трубки и тритурируйте через ситечко нейлоновых клеток 40 мкм, используя заднюю часть шприца объемом 5 мл. Соберите элюент и выбросьте крупные непереваренные фрагменты.</li>
	<li>Открутите элюент при 400 х г в течение 5 мин при комнатной температуре. Аспирировать супернатанта.</li>
	<li>Повторное суспендирование клеточных гранул в 30% покрытом поливинилпирролидоном (PVP) кремнеземом для удаления жировых клеток, которые в противном случае загрязнят конечную фракцию лимфоцитов.<ol><li>Чтобы приготовить 1 кремнезем с PVP-покрытием, используйте разбавление кремнезема с PVP-покрытием 9:1 в 10x PBS. ПРИМЕЧАНИЕ: Обратитесь к Таблице материалов для конкретного используемого кремнезема с PVP-покрытием.</li>
		<li>Для получения 30% кремнезема с PVP-покрытием разбавьте 1 кремнезем с PVP-покрытием PBS/HBSS.</li>
	</ol></li>
	<li>Открутите ячейку гранулы при 400 х г в течение 5 мин при комнатной температуре. Аспирировать супернатанта.</li>
	<li>Повторно суспендируют гранулу ячейки в 9 мл среды R-10. ПРИМЕЧАНИЕ: См. Таблицу материалов для состава сред R-10</li>
	<li>Осторожно нанесите клеточную суспензию на 4 мл Ficoll или среды разделения лимфоцитов, чтобы отделить лимфоциты от эритроцитов и полиморфноядерных клеток.</li>
	<li>Отделите слои центрифугированием при 400 х g в течение 23 мин при комнатной температуре с выключенным ускорением и торможением или при самой низкой настройке. Тщательно декантируйте верхний средний слой и собирайте межфазные, содержащие инфильтрирующие ткань лимфоциты.</li>
	<li>Промыть клетки 10 мл среды и приступить к подсчету клеток, проточной цитометрии, аликотированию и замораживанию клеток или первичному протоколу расширения NK.</li>
</ol>2. Первичное расширение NK-клеток из НБМК (или CB или тканей органов) (День 0), как показано на рисунке 2.
<ol><li>Разморозьте замороженный PBMC и замороженные, облученные питательные клетки на водяной бане с температурой 37 °C.</li>
	<li>Промыть PBMC и 100 гамма-облученных (Gy-облученных) 221-mIL-21 клеток центрифугированием при 400 х г в течение 5 мин с 10 мл среды R-10 отдельно.</li>
	<li>Сохраните 1 x 106 клеток PBMC для проточной цитометрии. ПРИМЕЧАНИЕ: Начальная чистота NK-ячейки является важным фактором при расчете скорости расширения NK-ячейки.</li>
	<li>Повторное суспендирование клеток в 1 мл среды R-10. Подсчитайте ячейки с помощью Trypan Blue.</li>
	<li>Смешайте 5x 106 клеток PBMC с 10 x 106 ячейками 100 Gy-облученными 221-mIL-21 ячейками в специальной 6-луночной пластине (см. Таблицу материалов).</li>
	<li>Добавить 30 мл среды R-10, дополненной человеческим IL-2 (200 ЕД/мл) и человеческим IL-15 (5 нг/мл) (см. Таблицу материалов).</li>
	<li>Инкубируйте специальную плиту из 6 скважин при 37 °C с 5% CO2.</li>
	<li>Замените среду средой R-10, дополненной человеческим IL-2 (200 Ед / мл) и человеческим IL-15 (5 нг / мл) для поддержания NK-клеток каждые 3-4 дня. ПРИМЕЧАНИЕ: Поддерживайте менее 20 x 106 ячеек на лунку для дальнейшего расширения при каждом изменении среды. Для лучшей жизнеспособности убедитесь, что общее количество клеток в каждой лунке не превышает 100 х 106 клеток.</li>
	<li>Записывайте общее количество клеток, жизнеспособность и выполняйте проточную цитометрию каждые 3-4 дня, чтобы рассчитать скорость расширения NK-клеток.</li>
</ol>3. Прикрепление клеток 293T (День 2), как показано на рисунке 2.
<ol><li>Разделение 1,8 x 106 293T клеток в 11 мл среды D-10 на обработанную пластину 100 мм. ПРИМЕЧАНИЕ: См. Таблицу материалов для состава сред Д-10</li>
	<li>Инкубировать клетки 293T при 37 °C с 5% CO2.</li>
</ol>4. Ретровирусная трансфекция (День 3)
<ol><li>В пробирке объемом 1,7 мл смешайте 470 мкл восстановленной сывороточной среды с 30 мкл трансфекционного реагента. ПРИМЕЧАНИЕ: Обратитесь к Таблице материалов для конкретных восстановленных сывороточных сред и трансфекционных реагентов, используемых.</li>
	<li>В отдельной пробирке объемом 1,7 мл добавьте 2,5 мкг плазмиды pRDF, 3,75 мкг плазмиды Pegpam3 и 2,5 мкг конструкции CAR в векторе SFG в восстановленную сывороточную среду, чтобы конечный объем составлял 500 мкл.</li>
	<li>Смешайте растворы на шагах 4.1 и 4.2 по каплям.</li>
	<li>Инкубировать пробирку при комнатной температуре в течение 15 мин.</li>
	<li>Добавьте 1 мл смеси со стадии 4,4 до 293T клеточной пластины на 1-й день по каплям.</li>
	<li>Инкубировать пластину (пластины) при 37 °C с 5% CO2 в течение 48-72 ч.</li>
</ol>5. Ретронектиновое покрытие пластин (День 3)
<ol><li>Разбавить белок ретронектина фосфатным буферизованным физиологическим раствором (PBS) до конечной концентрации 50-100 мкг/мл.</li>
	<li>Добавьте 500 мкл разбавленного ретронектина в каждую скважину необработанной плиты из 24 скважин (5 скважин на конструкцию CAR). Запечатайте пластину с помощью парапленки и инкубируйте пластину при 4 °C в течение ночи.</li>
</ol>6. Трансдукция (День 4)
<ol><li>Центрифугировать ретронектиновую пластину при 2103 х г в течение 30 мин при 4 °C. Выбросьте супернатант.</li>
	<li>Заблокируйте каждую скважину 24-луночной плиты 1 мл среды R-10.</li>
	<li>Инкубировать пластину при 37 °C с 5% CO2 в течение 1 ч.</li>
	<li>Предварительно нагрейте центрифугу до 32 °C, пока ретронектиновая пластина блокируется.</li>
	<li>Соберите супернатант ретровируса, фильтруя трансфектированные клетки 293T с помощью фильтра 0,45 мкм.</li>
	<li>Aliquot 2 мл фильтрованного супернатанта ретровируса в каждую лунку.</li>
	<li>Центрифугировать 24-луночную пластину при 2103 х г в течение 2 ч при 32 °C.</li>
	<li>Во время пластинчатого центрифугирования соберите расширенные ячейки PBNK с дня 0 и подсчитайте клетки с помощью Trypan Blue. ПРИМЕЧАНИЕ: Продолжайте расширять ячейки PBNK путем добавления среды R-10, дополненной IL-2 (200 ЕД/мл) и IL-15 (5 нг/мл).</li>
	<li>Разбавляйте расширенные ячейки ПБНК средой R-10, дополненной IL-2 (200 Ед/мл) и IL-15 (5 нг/мл) до 2,5 х 105-5 х 105 клеток/мл (0,5 х 106-1 х 106 ячеек на лунку). ПРИМЕЧАНИЕ: Запишите общее количество клеток, жизнеспособность и сохраните 5 x 105 расширенных PBNK клеток для проточной цитометрии, поскольку эти значения важны для определения скорости расширения NK-клеток.</li>
	<li>После центрифугирования частично аспирируют супернатант ретровируса из каждой лунки. ПРИМЕЧАНИЕ: Не следует полностью аспирировать, т.е. оставлять примерно 100 мкл ретровирусного супернатанта на лунку, так как это снизит эффективность трансдукции.</li>
	<li>Аликвота 2 мл разбавленных расширенных ПБНК клеток от стадии 6,8 до каждой лунки.</li>
	<li>Центрифугировать пластину при 600 х г в течение 10 мин при 32 °C. Инкубировать пластину при 37 °C с 5% CO2 в течение 48-72 ч. ПРИМЕЧАНИЕ: Не парафильмируйте пластину.</li>
</ol>7. Сбор клеток CAR-NK (день 6 или 7), как показано на рисунке 2.
<ol><li>Аккуратно соберите ячейки с 24-луночной пластины и перенесите ячейки в центрифужную трубку объемом 50 мл. ПРИМЕЧАНИЕ: Старайтесь не генерировать пузырьки, так как это приведет к снижению жизнеспособности клеток.</li>
	<li>Центрифугируйте трубку при 400 х г в течение 5 мин.</li>
	<li>Повторно суспендируйте гранулу 1 мл среды R-10 и подсчитайте клетки с помощью Trypan Blue. ПРИМЕЧАНИЕ: Сохраните 5 x 105 клеток для проточной цитометрии для определения эффективности трансдукции.</li>
	<li>Переложите повторно суспендированные ячейки на специальную 6-луночную пластину, содержащую 30 мл среды R-10, дополненную IL-2 (200 Ед/мл) и IL-15 (5 нг/мл).</li>
	<li>Инкубируйте специальную плиту из 6 скважин при 37 °C с 5% CO2.</li>
	<li>Замените носители R-10, дополненные IL-2 (200 Ед/мл) и IL-15 (5 нг/мл) для поддержания NK-клеток каждые 3 - 4 дня. ПРИМЕЧАНИЕ: Поддерживайте менее 20 x 106 ячеек на скважину для дальнейшего расширения при каждом изменении. Для лучшей жизнеспособности убедитесь, что общее количество клеток в каждой лунке не превышает 100 х 106 клеток.</li>
	<li>Записывайте общее количество клеток, жизнеспособность и выполняйте проточную цитометрию каждые 3-4 дня, чтобы рассчитать скорость расширения NK-клеток.</li>
	<li>Используйте клетки для соответствующих анализов in vitro или in vivo . ПРИМЕЧАНИЕ: Расширенный PBNK ex vivo и CAR-NK клетки можно культивировать в инкубаторе с температурой 37 °C в течение примерно 4 недель.</li>
	<li>Исследуйте количество и чистоту NK-клеток на 7-й день, 11-й день, 14-й день, 18-й день и 21-й день с помощью проточной цитометрии.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Van Acker, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD56+in+the+immune+system:+More+than+a+marker+for+cytotoxicity.">CD56 in the immune system: More than a marker for cytotoxicity.</a> Frontiers in Immunology. 8, 892 (2017).</li><li>Caligiuri, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+natural+killer+cells.">Human natural killer cells.</a> Blood. 112 (3), 461-469 (2008).</li><li>Shimizu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+and+expression+of+three+cloned+human+non-HLA-A,B,C+class+I+major+histocompatibility+complex+genes+in+mutant+lymphoblastoid+cells.">Transfer and expression of three cloned human non-HLA-A,B,C class I major histocompatibility complex genes in mutant lymphoblastoid cells.</a> Proceedings of the Nationall Academy of Sciences of the United States of America. 85 (1), 227-231 (1988).</li><li>Wu, J., Lanier, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+killer+cells+and+cancer.">Natural killer cells and cancer.</a> Advances in Cancer Research. 90, 127-156 (2003).</li><li>Liu, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+CAR-transduced+natural+killer+cells+in+CD19-positive+lymphoid+tumors.">Use of CAR-transduced natural killer cells in CD19-positive lymphoid tumors.</a> The New England Journal of Medicine. 382 (6), 545-553 (2020).</li><li>Alonso-Camino, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+and+toxicity+management+of+CAR-T-cell+immunotherapy:+a+matter+of+responsiveness+control+or+tumour-specificity.">Efficacy and toxicity management of CAR-T-cell immunotherapy: a matter of responsiveness control or tumour-specificity.</a> Biochemical Society Transactions. 44 (2), 406-411 (2016).</li><li>Bonifant, C. L., Jackson, H. J., Brentjens, R. J., Curran, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicity+and+management+in+CAR+T-cell+therapy.">Toxicity and management in CAR T-cell therapy.</a> Molecular Therapy Oncolytics. 3, 16011 (2016).</li><li>Kalaitsidou, M., Kueberuwa, G., Schitt, A., Gilham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAR+T-cell+therapy:+toxicity+and+the+relevance+of+preclinical+models.">CAR T-cell therapy: toxicity and the relevance of preclinical models.</a> Immunotherapy. 7 (5), 487-497 (2015).</li><li>Gust, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+activation+and+blood-brain+barrier+disruption+in+neurotoxicity+after+adoptive+immunotherapy+with+CD19+CAR-T+cells.">Endothelial activation and blood-brain barrier disruption in neurotoxicity after adoptive immunotherapy with CD19 CAR-T cells.</a> Cancer Discovery. 7 (12), 1404-1419 (2017).</li><li>Hay, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+and+biomarkers+of+severe+cytokine+release+syndrome+after+CD19+chimeric+antigen+receptor-modified+T-cell+therapy.">Kinetics and biomarkers of severe cytokine release syndrome after CD19 chimeric antigen receptor-modified T-cell therapy.</a> Blood. 130 (21), 2295-2306 (2017).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+kinetics+of+human+natural+killer+cells:+the+effects+of+ageing+and+acute+and+chronic+viral+infection.">In vivo kinetics of human natural killer cells: the effects of ageing and acute and chronic viral infection.</a> Immunology. 121 (2), 258-265 (2007).</li><li>Vidard, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD137+(4-1BB)+Engagement+fine-tunes+synergistic+IL-15-+and+IL-21-driven+nk+cell+proliferation.">CD137 (4-1BB) Engagement fine-tunes synergistic IL-15- and IL-21-driven nk cell proliferation.</a> Journal of Immunology. 203 (3), 676-685 (2019).</li><li>Venkatasubramanian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-21-dependent+expansion+of+memory-like+NK+cells+enhances+protective+immune+responses+against+Mycobacterium+tuberculosis.">IL-21-dependent expansion of memory-like NK cells enhances protective immune responses against Mycobacterium tuberculosis.</a> Mucosal Immunology. 10 (4), 1031-1042 (2017).</li><li>Ojo, E. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+bound+IL-21+based+NK+cell+feeder+cells+drive+robust+expansion+and+metabolic+activation+of+NK+cells.">Membrane bound IL-21 based NK cell feeder cells drive robust expansion and metabolic activation of NK cells.</a> Scientific Reports. 9 (1), 14916 (2019).</li><li>Denman, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-bound+IL-21+promotes+sustained+ex+vivo+proliferation+of+human+natural+killer+cells.">Membrane-bound IL-21 promotes sustained ex vivo proliferation of human natural killer cells.</a> PLoS One. 7 (1), 30264 (2012).</li><li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superior+expansion+and+cytotoxicity+of+human+primary+NK+and+CAR-NK+cells+from+various+sources+via+enriched+metabolic+pathways.">Superior expansion and cytotoxicity of human primary NK and CAR-NK cells from various sources via enriched metabolic pathways.</a> Molecular Therapy. Methods &amp; Clinical Development. 18, 428-445 (2020).</li><li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NK+cell-based+cancer+immunotherapy:+from+basic+biology+to+clinical+development.">NK cell-based cancer immunotherapy: from basic biology to clinical development.</a> Journal of Hematology &amp; Oncology. 14 (1), 7 (2021).</li><li>Gong, J. H., Maki, G., Klingemann, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+human+cell-line+(Nk-92)+with+phenotypical+and+functional-characteristics+of+activated+natural-killer-cells.">Characterization of a human cell-line (Nk-92) with phenotypical and functional-characteristics of activated natural-killer-cells.</a> Leukemia. 8 (4), 652-658 (1994).</li><li>Tam, Y. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+genetically+altered,+interleukin+2-independent+natural+killer+cell+lines+suitable+for+adoptive+cellular+immunotherapy.">Characterization of genetically altered, interleukin 2-independent natural killer cell lines suitable for adoptive cellular immunotherapy.</a> Human Gene Therapy. 10 (8), 1359-1373 (1999).</li><li>Robertson, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+cell+line,+NKL,+derived+from+an+aggressive+human+natural+killer+cell+leukemia.">Characterization of a cell line, NKL, derived from an aggressive human natural killer cell leukemia.</a> Experimental Hematology. 24 (3), 406-415 (1996).</li><li>Hu, Y., Tian, Z. G., Zhang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor+(CAR)-transduced+natural+killer+cells+in+tumor+immunotherapy.">Chimeric antigen receptor (CAR)-transduced natural killer cells in tumor immunotherapy.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 39 (2), 167-176 (2018).</li><li>Tseng, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+anti-CD147+chimeric+antigen+receptors+targeting+hepatocellular+carcinoma.">Efficacy of anti-CD147 chimeric antigen receptors targeting hepatocellular carcinoma.</a> Nature Communications. 11 (1), 4810 (2020).</li><li>Easom, N. J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-15+overcomes+hepatocellular+carcinoma-induced+NK+cell+dysfunction.">IL-15 overcomes hepatocellular carcinoma-induced NK cell dysfunction.</a> Frontiers in Immunology. 9, 1009 (2018).</li><li>Granzin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+IL-21+and+feeder+cell-driven+ex+vivo+expansion+of+human+NK+cells+with+therapeutic+activity+in+a+xenograft+mouse+model+of+melanoma.">Highly efficient IL-21 and feeder cell-driven ex vivo expansion of human NK cells with therapeutic activity in a xenograft mouse model of melanoma.</a> Oncoimmunology. 5 (9), 1219007 (2016).</li><li>Liu, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cord+blood+derived+natural+killer+cells+engineered+with+a+chimeric+antigen+receptor+targeting+CD19+and+expressing+IL-15+have+long+term+persistence+and+exert+potent+anti-leukemia+activity.">Cord blood derived natural killer cells engineered with a chimeric antigen receptor targeting CD19 and expressing IL-15 have long term persistence and exert potent anti-leukemia activity.</a> Blood. 126 (23), (2015).</li></ol>

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.

Большинство современных продуктов CAR-NK в клинических испытаниях используют клеточные линииNK 17, такие как NK-92, клеточная линия, выделенная из пациента с неходжкинской лимфомой18, NK-92MI, IL-2 независимая клеточная линия NK-9219 и NKL, выделенная из большого гранулированного пациента с лимфоцитами20, поскольку эти клеточные линии легко пролиферативны для «готовых» продуктов. Однако эти клеточные линии, например, клетки NK-92, имеют предельную клиническую эффективность и расширение in vivo, поскольку они требуют облучения перед инфузией, тем самым ограничивая их пролиферацию и цитотоксичность in vivo21. Учитывая эти причины, в настоящее время изучаются различные стратегии для расширения первичных NK-клеток из нескольких источников, включая периферическую кровь, CB, костный мозг (BM), эмбриональные стволовые клетки человека (HSC), индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSCs) и опухолевые ткани 21,22,23. Например, NK-клетки могут быть расширены ex vivo с использованием интерлейкинов, включая IL-15, IL-18 и IL-21. Лимфобластоидные клеточные линии, такие как клетки K562 или трансформированные вирусом Эпштейна-Барра лимфобластоидные клеточные линии, такие как клетки 721.221, также используются для расширения NK-клеток16. Однако вышеупомянутые стратегии часто генерируют недостаточное количество NK-клеток для принятия иммунотерапии CAR-NK22,24. Чтобы помочь решить эту проблему, исследование здесь показывает протокол для расширения клеток ex vivo NK с использованием генетически модифицированной EBV-трансформированной клеточной линии, 221-mIL-21 фидерных клеток.
Методология расширения с использованием 221-mIL-21 фидерных клеток, показанная в этом протоколе, оптимизирована для расширения NK-клеток со скоростью расширения по меньшей мере в 10-100 раз выше, чем другие клеточные линии лейкемии, включая HL-60 и OCl-AML3, экспрессирующие мембрану IL-21, K562 и K652-mIL21, экспрессирующую лиганд OX40 22,24,25. Выражение CAR также вычисляется в течение примерно 2 недель ex vivo. Что еще более важно, стратегия расширения 221-mIL-21 фидерных клеток может быть применена для расширения NK-клеток из различных источников, включая НБМК, CB и твердые органы, такие как печень, без начальной стадии обогащения NK. Хотя фидерная система 221-mIL-21 не так зависима от доноров, как вышеупомянутые клеточные линии кормушки, она не полностью независима от доноров. В среднем, система расширения 221-mIL-21 может достичь 90% чистоты NK-клеток с высоким числом NK-клеток, при этом примерно <5% загрязнения Т-клеток на 14-й день после расширения. Поэтому, чтобы исключить возможности загрязнения Т-клеток, необходимо изолировать NK-клетки из полученных образцов до расширения ex vivo или использовать систему отбора CD3+ для устранения Т-клеток после расширения ex vivo.
Одно из критических замечаний при использовании системы расширения NK-клеток заключается в том, что питательные клетки, возможно, не были полностью уничтожены после расширения или до переливания, что может иметь значительные регуляторные проблемы; поэтому полная эрадикация питательных клеток перед переливанием имеет решающее значение. Тем не менее, недавние клинические испытания CAR-NK, в которых клетки кормушки K562-mIL21-4-1BBL использовались для расширения клеток CBNK ex vivo 24,25, не показали осложнений. Кроме того, наши предварительные данные показали постепенное уменьшение облученной популяции 221-mIL-21 по мере продвижения расширения (данные не показаны). Однако для реализации этого метода расширения в клинических условиях требуются более обширные исследования. В совокупности система расширения 221-mIL-21 помогает решить проблему расширения первичных CAR-NK-клеток и, следовательно, будет значительно способствовать более широкому использованию иммунотерапии на основе car-NK-клеток в ближайшем будущем.

Естественные клетки-киллеры (NK) являются важным подмножеством лимфоцитов, которые экспрессируют CD56 и не экспрессируют маркер Т-клеток, CD3 1,2. Обычные NK-клетки классифицируются как врожденные иммунные клетки, ответственные за иммунонадзор вирусно инфицированных клеток и раковых клеток. В отличие от Т-клеток, NK-клетки распознают инфицированные или злокачественные клетки с помощью CD16 или других активирующих рецепторов и не требуют образования комплекса между антигенными пептидами и основным комплексом гистосовместимости (MHC) класса I молекул 3,4. Недавние клинические исследования с использованием рецепторов химерного антигена (CAR)-NK-клеток для лечения рецидивирующих или рефрактерных CD19-положительных раковых заболеваний (неходжкинская лимфома или хронический лимфоцитарный лейкоз [CLL]) показали выдающиеся преимущества безопасности CAR-NK-клеток5. Например, инфузия клеток CAR-NK связана с минимальным или незначительным трансплантатом по сравнению с болезнью хозяина (GVHD), нейротоксичностью, кардиотоксичностью и синдромом высвобождения цитокинов (CRS)6,7,8,9,10. Однако традиционные методы расширения NK-клеток человека показали исчерпывающие фенотипы с сильным братоубийственным уничтожением и нехваткой теломер, что представляет собой серьезную проблему в получении достаточного количества функциональных NK-клеток для приемной иммунотерапии11.
Для преодоления этих проблем был разработан метод расширения первичных NK-клеток непосредственно из нефракционированных мононуклеарных клеток периферической крови (PBMCs) или пуповинной крови (CB) с использованием облученной и генетически модифицированной клеточной линии 721.221 (далее 221), линии В-лимфобластоидных клеток человека с низкой экспрессией молекул MHC класса I3. Предыдущие исследования показали важность IL-21 в расширении NK-клеток; поэтому генетически модифицированный мембранно-связанный IL-21, экспрессирующий версию клеточной линии 721.221 (начиная с настоящего времени, 221-mIL-21), был разработан 11,12,13,14,15. Результаты показали, что 221-mIL-21 питательно-клеточные расширенные первичные NK-клетки были расширены в среднем до >40 000 раз с персистирующей высокой чистотой NK-клеток в течение примерно 2-3 недель. Дополнительную информацию о применении этого протокола можно найти в Yang et al.16.
Этот протокол направлен на демонстрацию пошаговой процедуры нового расширения PBNK, CBNK, тканевых NK и CAR-NK клеток ex vivo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 mm surface treated sterile tissue culture dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10062-880</td>
			<td>For transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>293T cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td>For transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well G-REX plate</td>
			<td>Wilson Wolf</td>
			<td>80240M</td>
			<td>For NK cell expansion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AF647-conjugated AffiniPure F(ab&#39;)2 fragment goat anti-human IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>109-606-088</td>
			<td>For flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAR construct in SFG vector</td>
			<td>Generated in Dr. Dongfang Liu&#39;s lab</td>
			<td></td>
			<td>For transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase IV</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C4-22-1G</td>
			<td>For TILs isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryopreserve media 
			Ingredient: Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-010-CV</td>
			<td>90%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryopreserve media 
			Ingredient: Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2050</td>
			<td>10%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-10 media 
			Ingredient: DMEM</td>
			<td>VWR</td>
			<td>45000-304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-10 media 
			Ingredient: Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-010-CV</td>
			<td>10%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-10 media 
			Ingredient: Penicillin Streptomycin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>45000-652</td>
			<td>1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastFlow &#38; Low Binding Millipore Express PES Membrane</td>
			<td>Millex</td>
			<td>SLHPR33RB</td>
			<td>For transduction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genejuice transfection reagent</td>
			<td>VWR</td>
			<td>80611-356</td>
			<td>For transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS C-tubes</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-237</td>
			<td>For TILs isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS Octo</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>Quote</td>
			<td>For TILs isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS - w/o calcium or magnesium)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14170120</td>
			<td>For TILs isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human IL-15</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>200-15</td>
			<td>For NK cell expansion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human IL-2</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>200-02</td>
			<td>For NK cell expansion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Irradiated 221-mIL21 feeder cells</td>
			<td>Generated in Dr. Dongfang Liu&#39;s lab</td>
			<td></td>
			<td>Frozen in cryopreserve media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lymphocyte Separation Media</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-072-CV</td>
			<td>For TILs isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPTI-MEM</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>31895</td>
			<td>For transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-human CD3 clone HIT3a</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>300308</td>
			<td>For flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy7 anti-human CD56 (NCAM) clone 5.1H11</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>362509</td>
			<td>For flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pegpam3 plasmid</td>
			<td>Generated in Dr. Dongfang Liu&#39;s lab</td>
			<td></td>
			<td>For transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17089101</td>
			<td>For TILs isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs)</td>
			<td>New York Blood Center</td>
			<td></td>
			<td>Isolated from plasma of healthy donors, frozen in cryopreserve media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline (PBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td>For transduction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRDF plasmid</td>
			<td>Generated in Dr. Dongfang Liu&#39;s lab</td>
			<td></td>
			<td>For transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-10 media 
			Ingredients: RPMI 1640</td>
			<td>VWR</td>
			<td>45000-404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-10 media 
			Ingredient: L-glutamine</td>
			<td>VWR</td>
			<td>45000-304</td>
			<td>1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-10 media 
			Ingredient: Penicillin Streptomycin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>45000-652</td>
			<td>1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-10 media 
			Ingredient: Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-010-CV</td>
			<td>10%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retronectin</td>
			<td>Generated in Dr. Dongfang Liu&#39;s lab</td>
			<td>home-made</td>
			<td>For transduction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-900-Cl</td>
			<td>For cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Untreated 24-well plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-690-071</td>
			<td>For transduction</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

natural killer (nk) and car-nk cell expansion method using membrane bound-il-21-modified b cell line

Терапия иммунными клетками, модифицированная рецептором химерного антигена (CAR), стала новым методом лечения рака и инфекционных заболеваний. Иммунотерапия на основе NK, особенно CAR-NK-клетки, является одной из наиболее перспективных «готовых» разработок без тяжелой опасной для жизни токсичности. Тем не менее, узким местом для разработки успешной терапии CAR-NK является достижение достаточного количества неисчерпывающих, долгоживущих, «готовых» CAR-NK клеток от третьей стороны. Здесь мы разработали новый метод расширения CAR-NK с использованием трансформированной вирусом Эпштейна-Барр (EBV) В-клеточной линии, экспрессирующей генетически модифицированную мембранную форму интерлейкина-21 (IL-21). В этом протоколе предусмотрены пошаговые процедуры по расширению NK и CAR-NK клеток из пуповинной крови и периферической крови, а также твердых тканей органов. Эта работа значительно усилит клиническую разработку иммунотерапии CAR-NK.

Схематический рабочий процесс изоляции NK-клеток, инфильтрирующих ткани, и расширения клеток PBNK с использованием методологии 221-mIL-21 фидерных клеток показан на рисунке 1 и рисунке 2. Расширенные PBNK-клетки собирали каждые 3 или 4 дня для проточной цитометрии для определения чистоты NK-клеток путем окрашивания клеток античеловеческим CD56 и античеловеческим CD3. Эксперимент был повторен с использованием двух разных доноров, чтобы показать воспроизводимость системы расширения (рисунок 3). Было показано, что клетки PBNK, расширенные на 221-mIL-21, расширяются почти в 5 × 104 раза (рисунок 3A). Кроме того, чистота NK-клеток поддерживалась высоко, около 85% на протяжении всего 21-дневного расширения (рисунок 3B). Используя систему расширения фидерных клеток 221-mIL-21, чистота NK-клеток постоянно колебалась в пределах 85-95%, независимо от доноров (данные не показаны). Чтобы продемонстрировать надежность системы расширения 221-mIL-21, NBMC были окрашены для анти-CD56 и анти-CD3 перед расширением, что показало чистоту клеток 7,09% для NK-клеток и высокий процент Т-клеток (рисунок 4A). PBMC кокультурировали с 221-mIL-21 для расширения NK-клеток; чистота NK была проверена перед трансдукцией CAR-NK на 4-й день (рисунок 4A). CAR-NK-клетки были собраны и окрашены для анти-CD56, анти-CD3 и анти-hIgG(H+L) F(ab')2, которые показали высокую популяцию NK-клеток (86,9% на 7-й день) и высокую эффективность трансдукции CAR примерно 70% (Рисунок 4). Более высокая эффективность трансдукции (до 95%) также наблюдалась с использованием системы упаковки ретровирусов. В целом, эти данные показывают, что фидерные клетки 221-mIL-21 могут успешно расширять NK-клетки и сохранять чистоту NK-клеток ex vivo.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62336/62336fig01.jpg"> Рисунок 1: Диаграмма расширения NK-клеток из твердых образцов органов человека. Вкратце, полученные образцы печени человека измельчают в небольшие кубики для механического пищеварения. Диссоциированные клетки затем изолируют с использованием кремнезема, покрытого PVP, и среды разделения лимфоцитов. Далее NK-клетки расширяются с использованием протокола расширения, описанного на рисунке 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62336/62336fig01large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62336/62336fig02.jpg"> Рисунок 2: Схематический рабочий процесс генерации клеток CAR-NK из НБМК. Вкратце, 221-mIL21 фидерные клетки были облучены при 100 Гр перед кокультурированием с ПОМОЩЬЮ PBMCs, дополненных IL-2 и IL-15 на 0-й день. Параллельно 293T-клетки были трансфектированы системой упаковки ретровируса для получения ретровируса CAR, который затем трансдуцировался в расширенные клетки PBNK в присутствии IL-2 и IL-15. Первичные клетки CAR-NK были собраны на 7-й день и продолжали расширяться в течение 21 дня. Эта цифра была изменена по сравнению с Yang et al.16. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62336/62336fig02large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62336/62336fig03.jpg"> Рисунок 3: Динамическое повременное расширение ячеек ПБНК. (А) Складное расширение ПБНК в течение 22-дневного времени. Клетки окрашивали анти-CD56 и анти-CD3 в указанные дни для проточной цитометрии. Общее количество NK-клеток определяли путем умножения чистоты NK-клеток на общее количество клеток. Скорость расширения была сгенерирована следующим образом: (Количество NK-клеток)Tn/(Число NK-клеток)T0, где Число NK-клеток = (процент чистоты NK-клеток) × (общее количество клеток),T0 - количество NK-клеток в момент 0-го дня, а Tn - количество NK-клеток в момент времени дня n. (B) Чистота NK-клеток в течение 22-дневного временного курса. Расширение NK-клеток повторялось два раза с двумя разными донорами. Полосы ошибок представляют ± SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62336/62336fig03large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62336/62336fig04.jpg"> Рисунок 4: Репрезентативный цитометрический анализ цитометрических клеток CAR-NK. (A) Репрезентативные точечные графики, показывающие динамическую покадровую четкость NK-клеток CAR-NK клеток в течение 18-дневного курса. Анализ проточной цитометрии оценивали путем окрашивания клеток анти-CD56 и анти-CD3 в указанные моменты времени. День 0 указывает на предварительное расширение ПБНК. День 4 указывает на пострасширение ПБНК и претрансдукцию CAR-NK клеток. День 7 указывает на посттрансдукцию CAR-NK клеток. (B) Репрезентативные точечные графики, показывающие эффективность трансдукции клеток CAR-NK с использованием системы упаковки ретровирусов. Клетки окрашивали анти-CD56, анти-CD3 и анти-hIgG(H+L) F(ab')2 для проточной цитометрии. (C) Репрезентативные точечные графики, показывающие выражение CAR в различных подмножествах, включая CD56+CD3-, CD56-CD3+, CD56+CD3+ и CD56-CD3- на 18-й день. Клетки окрашивали анти-CD56, анти-CD3 и анти-hIgG(H+L) F(ab')2 (что указывает на экспрессию CAR) для проточной цитометрии. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62336/62336fig04large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Natural Killer NK and CAR-NK Cell Expansion Method using Membrane Bound-IL-21-Modified B Cell Line at JoVE.com

Natural Killer NK and CAR-NK Cell Expansion Method using Membrane Bound-IL-21-Modified B Cell Line

Здесь мы представляем метод расширения естественного киллера периферической крови (PBNK), NK-клеток из тканей печени и химерных антигенных рецепторов (CAR)-NK-клеток, полученных из мононуклеарных клеток периферической крови (PBMCs) или пуповинной крови (CB). Этот протокол демонстрирует расширение NK и CAR-NK клеток с использованием питающих ячеек 221-mIL-21 в дополнение к оптимизированной чистоте расширенных NK-клеток.

Естественный киллер (NK) и метод расширения клеток CAR-NK с использованием мембранно-связанной IL-21-модифицированной В-клеточной линии

Chimeric antigen receptor (CAR)-modified immune cell therapy has become an emerging treatment for cancers and infectious diseases. NK-based immunotherapy, ...

Этот протокол может значительно улучшить расширение функциональных, неисчерпывающих, похожих на память NK-клеток ex vivo по сравнению с другими фидерными клетками, основанными на системе расширения. Это более простой метод по сравнению с другими протоколами, использующими фидерные клетки, в которых мы пропускаем этап изоляции NK-клеток до расширения NK-клеток. Этот протокол может обеспечить достаточное количество NK-клеток и CAR-NK для иммунотерапии.Этот метод обладает высокой воспроизводимостью. Тем не менее, использование свежих, новых исходных материалов и забота о том, чтобы не беспокоить NK-клетки в течение первых нескольких дней расширения, имеет решающее значение. Начните с выявления и секционирования жизнеспособных областей ткани с использованием стерильного хирургического оборудования для получения лимфоцитов.Затем поместите разрезанные ткани в 30 миллилитров HBSS без кальция или магния и держите ткань на льду до готовности к выделению. Работая внутри шкафа биобезопасности, измельчите ткань на кубики размером менее 0,5 сантиметра стерильными лезвиями бритвы и щипцами. Поместите измельченные кусочки ткани, не более 4 грамм, в тканевые диссоциаторные трубки и добавьте 10 миллилитров коллагеназы IV к кусочкам ткани.Чтобы тщательно измельчить ткань, обработайте трубки тканевого диссоциатора диссоциатором тканей при температуре 37 градусов Цельсия. После удаления трубок из тканевого диссоциатора тритурируют измельченную ткань через 40-микронный нейлоновый клеточный сетчатый фильтр, используя заднюю часть 5-миллилитрового шприца. Отбросьте крупные непереваренные фрагменты.Открутите собранный элюент при 400G в течение 5 минут при комнатной температуре и аспирируйте супернатант перед повторным использованием клеточных гранул в 30% покрытом поливинилпирролидоном кремнеземе для удаления жировых клеток. Раскрутите клетки, как описано до повторного использования клеточной гранулы в 9 миллилитрах среды R-10. Чтобы отделить лимфоциты от эритроцитов и полиморфноядерных клеток, аккуратно наложите клеточную суспензию на 4 миллилитра Фиколла или среды разделения лимфоцитов.Отделите слои центрифугированием при 400G в течение 23 минут при комнатной температуре с выключенным ускорением и торможением. Затем тщательно декантируют верхний средний слой и собирают интерфазу, содержащую инфильтрирующие ткани лимфоциты. Промыть клетки 10 миллилитрами среды и приступить к анализу или первичному природному киллеру, или NK, протоколу расширения клеток.Промыть мононуклеарные клетки периферической крови, или PBMCs, и 100 гамма-облученных 221-mIL-21 клеток отдельно центрифугированием при 400G в течение 5 минут 10 миллилитрами среды R-10. После центрифугирования сохраните 1 х 10 до 6-го ПБМК для проточной цитометрии и смешайте 5 х 10 к 6-м НБМК с 10 х 10 до 6-го 100 гамма-облученных 221-мИЛ-21 клеток в специальной 6-луночной пластине. Добавьте 30 миллилитров среды R-10, дополненной человеческим интерлейкином-2 и человеческим интерлейкином-15, к той же 6-луночной пластине и инкубируйте пластину при 37 градусах Цельсия с 5% углекислым газом, заменяя среду каждые 3-4 дня.Во время инкубации регистрируйте общий естественный киллер периферической крови, или PBNK, жизнеспособность числа клеток и выполняйте проточную цитометрию каждые 3-4 дня, чтобы рассчитать скорость расширения NK-клеток. Добавьте 1,8 x 10 к 6-й ячейке 293T в 11 миллилитрах среды D-10 на обработанную 100-миллиметровую пластину и инкубируйте ячейки 293T при 37 градусах Цельсия с 5% углекислого газа. В трубке объемом 1,70 миллилитра смешайте 470 микролитров восстановленной сывороточной среды с 30 микролитрами трансфекционного реагента.В отдельной трубке объемом 1,70 миллилитра добавьте 2,5 микрограмма плазмиды pRDF, 3,75 микрограмма плазмиды Pegpam3 и 2,5 микрограмма конструкции CAR в векторе SFG в восстановленную сывороточную среду, чтобы получить конечный объем 500 микролитров. Смешайте содержимое трубки с 1,70 миллилитровой трубкой, приготовленной ранее по каплям. После 15 минут инкубации при комнатной температуре добавьте 1 миллилитр смеси из трубки на пластину ячейки 293T по каплям и поместите пластину при 37 градусах Цельсия с 5% углекислого газа в течение 48-72 часов.Разбавить белок ретронектина PBS до конечной концентрации от 50 до 100 мкг на миллилитр. Добавьте 500 микролитров разбавленного ретронектина в каждую лунку необработанной 24-луночной пластины. Затем запечатайте пластину с помощью парапленки и инкубируйте пластину при 4 градусах Цельсия в течение ночи.На следующий день центрифугируйте ретронектиновую пластину при 2, 103G в течение 30 минут при 4 градусах Цельсия и выбросьте супернатант. После перекрытия каждой лунки 24-луночной пластины 1 миллилитра среды R-10 инкубируют пластину при 37 градусах Цельсия с 5% углекислым газом в течение 1 часа. Фильтруйте ранее трансфектированные клетки 293T с помощью фильтра 0,45 микрона для сбора супернатанта ретровируса.Aliquot 2 миллилитра фильтрованного ретровирусного супернатанта в каждую лунку 24-луночной ретронектиновой пластины. Центрифугируйте 24-луночную ретронектиновую пластину при 2, 103G в течение 2 часов в предварительно нагретую центрифугу при 32 градусах Цельсия. Пока пластины центрифугируются, соберите расширенные ячейки PBNK с 0-го дня и подсчитайте клетки с помощью Trypan Blue.Разбавляют расширенные ПБНК-клетки средой R-10, дополненной интерлейкином-2 и интерлейкином-15, до концентрации от 2,5 х 10 до 5-й - 5 х 10 до 5-й клетки на миллилитр. После центрифугирования 24-луночной ретронектиновой пластины частично аспирируют супернатант ретровируса из каждой скважины. Затем добавьте 2 миллилитра разбавленных расширенных ПБНК-клеток к каждой лунке.Центрифугируйте пластину при 600G в течение 10 минут при 32 градусах Цельсия, прежде чем инкубировать пластину при 37 градусах Цельсия с 5% углекислым газом в течение 48-72 часов. Переместите ячейки из 24-луночной пластины в 50-миллилитровую центрифужную трубку, чтобы центрифугировать трубку при 400G в течение 5 минут. После повторного использования гранулы с 1 миллилитром среды R-10 переводят повторно суспендированные клетки на специальную 6-луночную пластину, содержащую 30 миллилитров среды R-10, дополненную интерлейкином-2 и интерлейкином-15.Инкубируйте специальную 6-луночную пластину при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа с освежающей средой и рассчитывайте скорость расширения NK-клеток каждые 3-4 дня. Было показано, что ячейки PBNK, расширенные на 221-mIL-21, расширяются почти в 5 x 10 до 4-х раз. А чистота NK-клеток поддерживалась на уровне около 85% на протяжении всего 21-дневного расширения.До расширения надежность системы расширения 221-mIL-21 исследовали путем окрашивания PBMCs для анти-CD56 и анти-CD3, что показало чистоту клеток 7,09% для NK-клеток и высокий процент Т-клеток. На 4-й день НБМК и кокультуры 221-mIL-21 чистота НК была проверена перед трансдукцией CAR-NK. Клетки CAR-NK, окрашенные для анти-CD56, анти-CD3 и анти-человека-IgG, показали высокую популяцию NK-клеток на 7-й день и наблюдалась высокая эффективность трансдукции CAR примерно 70%.На 18-й день экспрессия CAR в различных подмножествах была проверена с помощью проточной цитометрии. После расширения NK-клеток клетки могут использоваться для функциональных анализов in vitro или для экспериментов in vivo. Исследователь может использовать этот протокол для расширения NK и CAR-NK для пациентов с функциональным дефицитом NK, а также для других видов, таких как собаки.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Natural Killer (NK) and CAR-NK Cell Expansion Method using Membrane Bound-IL-21-Modified B Cell Line

A Detailed Protocol for Characterizing the Murine C1498 Cell Line and its Associated Leukemia Mouse Model

Подробный протокол Характеризуя клеточной линии мышиной C1498 и его модель Associated Лейкоз Mouse

The intravenous injection of C1498 cells into syngeneic or congenic mice has been performed since 1941. These injections result in the development of ...

Study of Viral Vectors in a Three-dimensional Liver Model Repopulated with the Human Hepatocellular Carcinoma Cell Line HepG2

Изучение вирусных векторов в Трехмерные модели печени заселен с клеточной линии человеческого гепатоцеллюлярной карциномой HepG2

This protocol describes the generation of a three-dimensional (3D) ex vivo liver model and its application to the study and development of viral vector ...

Characterization of Cell Membrane Extensions and Studying Their Roles in Cancer Cell Adhesion Dynamics

Характеристика расширений клеточной мембраны и изучения их роли в динамике адгезии клеток рака

The cell membrane&#39;s extension repertoire modulates various malignant behaviors of cancer cells, including their adhesive and migratory potentials. The ...

Phospho Flow Cytometry with Fluorescent Cell Barcoding for Single Cell Signaling Analysis and Biomarker Discovery

Фосфоресцентный проточной цитометрии с люминесцентные клеток штриховое кодирование для сигнализации биомаркер обнаружение и анализ отдельной ячейки

Aberrant cell signaling plays a central role in cancer development and progression. Most novel targeted therapies are indeed directed at proteins and ...

A Syngeneic Mouse B-Cell Lymphoma Model for Pre-Clinical Evaluation of CD19 CAR T Cells

Мышь сингенных B-клеточной лимфомы модель для предварительно клинической оценки CD19 автомобилей Т-клеток

The astonishing clinical success of CD19 chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapy has led to the approval of two second generation chimeric antigen ...

Evaluation of Biomarkers in Glioma by Immunohistochemistry on Paraffin-Embedded 3D Glioma Neurosphere Cultures

Оценка биомаркеров в глиомы, иммуногистохимия на парафин врезанных 3D глиомы нейросферы культур

Analysis of protein expression in glioma is relevant for several aspects in the study of its pathology. Numerous proteins have been described as ...

Assessing Cell Viability and Death in 3D Spheroid Cultures of Cancer Cells

Оценка жизнеспособности и смерти клеток в 3D сфероидных культурах раковых клеток

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. ...

Comparing Metastatic Clear Cell Renal Cell Carcinoma Model Established in Mouse Kidney and on Chicken Chorioallantoic Membrane

Сравнение метастатической ясной клеточной почечной карциномы модели, созданной в мышиной почки и на куриные хориоаллантоический Membrane

Metastatic clear cell renal cell carcinoma (ccRCC) is the most common subtype of kidney cancer. Localized ccRCC has a favorable surgical outcome. However, ...

Rat Mammary Epithelial Cell Transplantation into the Interscapular White Fat Pad

Крыса молочной эпителиальной трансплантации клеток в межлопатулярный белый жир Pad

As early as the 1970s, researchers have successfully transplanted mammary epithelial cells into the interscapular white fat pad of rats. Grafting mammary ...