Name: dna tension probes to map the transient piconewton receptor forces by immune cells
Uploaded: 2021-03-20T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about DNA Tension Probes to Map the Transient Piconewton Receptor Forces by Immune Cells at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af NIH Grants R01GM131099, NIH R01GM124472 og NSF CAREER 1350829. Vi takker NIH Tetramer Facility for pMHC ligander. Denne undersøgelse blev delvist støttet af Emory Comprehensive Glycomics Core.

OT-1 transgene mus er anbragt på Division of Animal Resources Facility ved Emory University. Alle forsøgene blev godkendt og udført under Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) protokol.
1. Fremstilling af oligonukleotid
<ol><li>Opløs ligandstreng-DNA'et i vand (18,2 MΩ resistivitet, anvendt gennem hele protokollen). Vortex og drej opløsningen ned med en bordpladecentrifuge. Indstil vandmængden, så den endelige koncentration er 1 mM. Koncentrationen valideres ved hjælp ...

<ol>
	<li>Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+activation+through+immunological+synapses+and+kinapses.">T-cell activation through immunological synapses and kinapses.</a> Immunological Reviews. 221 (1), 77-89 (2008).</li><li>Spillane, K. M., Tolar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+cell+antigen+extraction+is+regulated+by+physical+properties+of+antigen-presenting+cells.">B cell antigen extraction is regulated by physical properties of antigen-presenting cells.</a> Journal of Cell Biology. 216 (1), 217-230 (2017).</li><li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanosensing+drives+acuity+of+&#945;&#946;+T-cell+recognition.">Mechanosensing drives acuity of &#945;&#946; T-cell recognition.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (39), 8204-8213 (2017).</li><li>Hong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+TCR+mechanotransduction+signaling+loop+induces+negative+selection+in+the+thymus.">A TCR mechanotransduction signaling loop induces negative selection in the thymus.</a> Nature Immunology. 19 (12), 1379-1390 (2018).</li><li>Basu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxic+T+cells+use+mechanical+force+to+potentiate+target+cell+killing.">Cytotoxic T cells use mechanical force to potentiate target cell killing.</a> Cell. 165 (1), 100-110 (2016).</li><li>Bashour, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD28+and+CD3+have+complementary+roles+in+T-cell+traction+forces.">CD28 and CD3 have complementary roles in T-cell traction forces.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (6), 2241-2246 (2014).</li><li>Ma, V. P. Y., Salaita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+nanotechnology+as+an+emerging+tool+to+study+mechanotransduction+in+living+systems.">DNA nanotechnology as an emerging tool to study mechanotransduction in living systems.</a> Small. 15 (26), 1900961 (2019).</li><li>Liu, Y., Yehl, K., Narui, Y., Salaita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tension+sensing+nanoparticles+for+mechano-imaging+at+the+living/nonliving+interface.">Tension sensing nanoparticles for mechano-imaging at the living/nonliving interface.</a> Journal of the American Chemical Society. 135 (14), 5320-5323 (2013).</li><li>Glazier, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+mechanotechnology+reveals+that+integrin+receptors+apply+pN+forces+in+podosomes+on+fluid+substrates.">DNA mechanotechnology reveals that integrin receptors apply pN forces in podosomes on fluid substrates.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-13 (2019).</li><li>Galior, K., Liu, Y., Yehl, K., Vivek, S., Salaita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Titin-based+nanoparticle+tension+sensors+map+high-magnitude+integrin+forces+within+focal+adhesions.">Titin-based nanoparticle tension sensors map high-magnitude integrin forces within focal adhesions.</a> Nano Letters. 16 (1), 341-348 (2016).</li><li>Zhang, Y., Ge, C., Zhu, C., Salaita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-based+digital+tension+probes+reveal+integrin+forces+during+early+cell+adhesion.">DNA-based digital tension probes reveal integrin forces during early cell adhesion.</a> Nature Communications. 5, 5167 (2014).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-based+nanoparticle+tension+sensors+reveal+that+T-cell+receptors+transmit+defined+pN+forces+to+their+antigens+for+enhanced+fidelity.">DNA-based nanoparticle tension sensors reveal that T-cell receptors transmit defined pN forces to their antigens for enhanced fidelity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (20), 5610-5615 (2016).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+integrins+exhibit+anisotropic+mechanosensing+and+harness+piconewton+forces+to+mediate+platelet+aggregation.">Platelet integrins exhibit anisotropic mechanosensing and harness piconewton forces to mediate platelet aggregation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (2), 325-330 (2018).</li><li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+kinetics+of+two-dimensional+TCR+and+pMHC+interactions+determine+T-cell+responsiveness.">The kinetics of two-dimensional TCR and pMHC interactions determine T-cell responsiveness.</a> Nature. 464 (7290), 932-936 (2010).</li><li>Ma, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+probes+that+store+mechanical+information+reveal+transient+piconewton+forces+applied+by+T+cells.">DNA probes that store mechanical information reveal transient piconewton forces applied by T cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (34), 16949-16954 (2019).</li><li>Hui, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+costimulatory+receptor+CD28+is+a+primary+target+for+PD-1-mediated+inhibition.">T cell costimulatory receptor CD28 is a primary target for PD-1-mediated inhibition.</a> Science. 355 (6332), 1428-1433 (2017).</li><li>Whitley, K. D., Comstock, M. J., Chemla, Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elasticity+of+the+transition+state+for+oligonucleotide+hybridization.">Elasticity of the transition state for oligonucleotide hybridization.</a> Nucleic Acids Research. 45 (2), 547-555 (2016).</li><li>Brockman, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+super-resolved+PAINT+imaging+of+piconewton+cellular+traction+forces.">Live-cell super-resolved PAINT imaging of piconewton cellular traction forces.</a> Nature Methods. 17 (10), 1018-1024 (2020).</li></ol>

Med de detaljerede procedurer, der er angivet her, kan man forberede DNA-hårnålespændingssondesubstrater til at kortlægge og kvantificere receptorspændingen produceret af immunceller. Når celler belægges på DNA-hårnålespændingssondesubstratet, lander, fastgøres og spredes, når receptorerne registrerer liganderne både kemisk og mekanisk, hvoraf sidstnævnte detekteres af vores sonder. I nogle tilfælde kan celler dog ikke sprede sig (Figur 7A) eller undlader at frembringe spænd...

Immunceller forsvarer sig mod patogener og kræftceller ved kontinuerligt at kravle og scanne overfladerne af målceller for antigener og studse deres overflade 1,2. Antigengenkendelse initieres ved binding mellem T-cellereceptoren (TCR) og peptid-major histokompatibilitetskomplekset MHC (pMHC) kompleks udtrykt på overfladen af målceller. Fordi TCR-pMHC-genkendelse sker ved krydset mellem to mobile celler, har det længe været mistænkt for at opleve mekaniske kræfter. Desuden førte dette til mekanosensormodellen for TCR-aktivering, hvilket tyder på, at TCR-kræfter bidrager til dens funktion 3,4. For at forstå, hvornår, hvor og hvordan mekaniske kræfter bidrager til T-cellefunktionen, er det bydende nødvendigt at udvikle værktøjer til at visualisere de molekylære kræfter, der transmitteres af T-celler. Traditionelt bruges metoder som traction force mikroskopi (TFM) og micropillar arrays til at undersøge cellulære kræfter 5,6. Imidlertid er kraftfølsomheden af TFM og mikrosøjle arrays på nanonewton (nN) skalaen og er derfor ofte utilstrækkelig til at studere de molekylære piconewton (pN) kræfter, der transmitteres af cellereceptorer7. For at forbedre kraften og den rumlige opløsning til detektion var vores laboratorium banebrydende for udviklingen af molekylære spændingsprober, som oprindeligt blev syntetiseret ved hjælp af polyethylenglycol (PEG) polymerer7. Molekylspændingssonder består af en udvidelig molekylær "fjeder" (PEG, protein, DNA) flankeret af en fluorofor og slukker og er forankret på en overflade. Kræfter, der påføres sondens endestation, fører til dens forlængelse, adskiller fluoroforen og slukkeren og genererer således et stærkt fluorescenssignal (figur 1A)8,9,10.
I løbet af det sidste årti har vi udviklet et bibliotek af forskellige klasser af molekylære spændingsprober med fjederelementer fremstillet af nukleinsyrer11, proteiner10 og polymerer8. Blandt disse giver de DNA-baserede spændingssonder det højeste signal / støjforhold og den største kraftfølsomhed, som let indstilles fra nogle få pN op til ~ 20 pN11. Vi har brugt disse DNA-spændingssonder i realtid til at studere de molekylære kræfter, der genereres af mange forskellige celletyper, herunder fibroblaster, kræftceller, blodplader og immunceller11,12,13. Dette manuskript vil beskrive protokoller til syntetisering og samling af DNA-spændingssonder på en overflade for at kortlægge molekylære receptorkræfter med pN-kraftopløsning ved hjælp af et konventionelt fluorescensmikroskop. Mens den nuværende procedure inkluderer kemiske modifikationer af nukleinsyren for at introducere den fluorescerende reporter (figur 1B), er det vigtigt at bemærke, at mange af modifikations- og oprensningstrinnene kan outsources til brugerdefinerede DNA-syntesevirksomheder. Derfor er DNA-spændingssondeteknologi let og tilgængelig for de bredere cellebiologi- og mekanobiologiske samfund.
Kort sagt, for at samle DNA-spændingssensorer, hybridiseres en DNA-hårnål til en fluorescerende ligandstreng på den ene arm og en slukningsankerstreng på den anden arm og immobiliseres derefter på et glassubstrat (figur 1C, realtidsspænding). I mangel af mekanisk kraft lukkes hårnålen, og fluorescensen slukkes således. Men når den påførte mekaniske kraft er større end F1/2 (kraften ved ligevægt, der fører til en 50% sandsynlighed for udfoldelse), smelter hårnålen mekanisk, og der genereres et fluorescerende signal.
Med udgangspunkt i DNA-spændingssensoren i realtid beskriver vi også protokoller til kortlægning af akkumulerede kræfter, hvilket er særligt nyttigt til at studere interaktioner mellem receptorer på immunceller og deres naturlige ligand. Dette skyldes, at immunreceptorer ofte viser kortvarige bindinger 3,14. Akkumulerede kræfter afbildes ved hjælp af en "låsende" streng, der fortrinsvis binder til åbne DNA-hårnåle og muliggør lagring af fluorescenssignaler forbundet med mekaniske trækhændelser (figur 1C, låst spænding). Låsestrengen er designet til at binde et kryptisk bindingssted, der eksponeres ved mekanisk induceret smeltning af hårnålen og låse hårnålen i åben tilstand ved at blokere hårnålens foldning igen, således at spændingssignalet lagres og genererer et akkumuleret spændingskort. Desuden er låsestrengen designet med et otte-nukleotid-tåhold, som muliggør en tåholdsmedieret strengforskydningsreaktion med sit fulde komplement, "oplåsningsstrengen". Med tilføjelsen af oplåsningsstrengen fjernes den bundne låsestreng fra hårnålekonstruktionen, hvilket sletter det lagrede spændingssignal og nulstiller hårnålen tilbage til realtidstilstanden.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62348/62348fig01.jpg"> Figur 1: Skema for de nyeste molekylære spændingssonder. (A) Generelt design af molekylær spændingssonde i realtid, (B) strenge til den DNA-baserede spændingssondekonstruktion og (C) konstruerede DNA-baserede spændingssonder og deres skift mellem realtidstilstand og låst tilstand. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62348/62348fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
Hovedprotokollen består af fire hovedafsnit - oligonukleotidpræparation, overfladebehandling, billeddannelse og dataanalyse. Denne protokol er med succes blevet demonstreret af vores laboratorium og andre i naive og aktiverede OT-1 CD8 + T-celler, OT-II CD4 + celler samt hybridomer og kan anvendes til at forhøre forskellige immuncellereceptorer, herunder T-cellereceptor, programmeret celledødsreceptor (PD1) og lymfocytfunktionsassocieret antigen 1 (LFA-1) kræfter. OT-1 CD8+ naive T-celler bruges som eksempel på cellelinje i dette papir.

<table fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#160;3-hydroxypicolinic acid (3-HPA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>56197</td>
			<td>maldi-TOF-MS matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;mPEG-SC</td>
			<td>Biochempeg</td>
			<td>MF001023-2K</td>
			<td>surface prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(3-Aminopropyl)triethoxysilane</td>
			<td>Acros</td>
			<td>AC430941000</td>
			<td>surface prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Red blood cell lysis buffer</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>00-4333-57</td>
			<td>buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8.8 nm gold nanoparticles, tannic acid</td>
			<td>Nanocomposix</td>
			<td>customized order</td>
			<td>surface prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atto647N NHS ester</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>18373-1MG-F</td>
			<td>fluorophore, oligo prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attofluor Cell Chamber, for microscopy</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A7816</td>
			<td>imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Syringes only with Luer-Lok</td>
			<td>BD bioscience</td>
			<td>309657</td>
			<td>cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>biotinylated anti-mouse CD3e</td>
			<td>ebioscience</td>
			<td>13-0031-82</td>
			<td>antibody/ligand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated pMHC ovalbumin (SIINFEKL)</td>
			<td>NIH Tetramer Core Facility at Emory University</td>
			<td>NA</td>
			<td>antibody/ligand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>735078001</td>
			<td>block non-specific interactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainers</td>
			<td>Biologix</td>
			<td>15-1100</td>
			<td>cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip Mini-Rack, teflon</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C14784</td>
			<td>surface prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3B NHS ester</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>PA63101</td>
			<td>fluorophore, oligo prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CM</td>
			<td>buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>459836</td>
			<td>surface prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s balanced salts (HBSS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H8264</td>
			<td>buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hydrogen peroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H1009</td>
			<td>surface prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LA-PEG-SC</td>
			<td>Biochempeg</td>
			<td>HE039023-3.4K</td>
			<td>surface prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Midi MACS (LS) startup kit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-301</td>
			<td>cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse CD8+ T cell isolation kit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-104-075</td>
			<td>cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanosep MF centrifugal devices</td>
			<td>Pall laboratory</td>
			<td>ODM02C35</td>
			<td>oligo prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>No. 2 round glass coverslips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48382-085</td>
			<td>surface prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTA-SAM</td>
			<td>Dojindo Molecular Technologies</td>
			<td>N475-10</td>
			<td>surface prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P2 gel</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1504118</td>
			<td>oligo prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sufuric acid</td>
			<td>EMD Millipore Corporation</td>
			<td>SX1244-6</td>
			<td>surface prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-NHS acetate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>26777</td>
			<td>surface prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent AdvanceBio Oligonucleotide C18 column, 4.6 x 150 mm, 2.7 &#956;m</td>
			<td>653950-702</td>
			<td></td>
			<td>oligonucleotide preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barnstead Nanopure water purifying system</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td>water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFI Apo 100&#215; NA 1.49 objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy5 cube</td>
			<td>CHROMA</td>
			<td></td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>evolve electron multiplying charge coupled device (EMCCD)</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td></td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-performance liquid chromatography</td>
			<td>Agilent 1100</td>
			<td></td>
			<td>oligonucleotide preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intensilight epifluorescence source</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometer (MALDI-TOF-MS)</td>
			<td>Voyager STR</td>
			<td></td>
			<td>oligonucleotide preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td>oligonucleotide preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ti inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Perfect Focus System</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>quad band TIRF 405/488/561/647 cube</td>
			<td>CHROMA</td>
			<td></td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RICM cube</td>
			<td>CHROMA</td>
			<td></td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TIRF launcher with 488 nm (50 mW), 561 nm (50 mW), and 640 nm</td>
			<td>Coherent</td>
			<td></td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRITC cube</td>
			<td>CHROMA</td>
			<td></td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligo name</td>
			<td>5&#39; modification / 3&#39; modification</td>
			<td>sequence (5&#39; to 3&#39;)</td>
			<td>Use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15mer amine locking strand</td>
			<td>5&#39; modification: no modification 
			3&#39; modification: /3AmMO/</td>
			<td>AAA AAA CAT TTA TAC CCT ACC TA</td>
			<td>locking real-time tension signal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15mer Atto647N locking strand</td>
			<td>5&#39; modification: Atto647N 
			3&#39; modification: /3AmMO/</td>
			<td>AAA AAA CAT TTA TAC CCT ACC TA</td>
			<td>locking real-time tension signal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15mer non-fluoresccent locking strand</td>
			<td>5&#39; modification: no modification 
			3&#39; modification: no modification</td>
			<td>A AAA AAC ATT TAT AC</td>
			<td>locking real-time tension signal for quantitative analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4.7 pN hairpin strand</td>
			<td>5&#39; modification: no modification 
			3&#39; modification: no modification</td>
			<td>GTGAAATACCGCACAGATGCGT 
 TTGTATAAATGTTTTTTTCATTTAT 
 ACTTTAAGAGCGCCACGTAGCC 
CAGC</td>
			<td>hairpin probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>amine ligand strand</td>
			<td>5&#39; modification: /5AmMC6/ 
			3&#39; modification: /3Bio/</td>
			<td>CGCATCTGTGCG GTA TTT CAC TTT</td>
			<td>hairpin probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BHQ2 anchor strand</td>
			<td>5&#39; modification: /5ThiolMC6-D/ 
			3&#39; modification: /3BHQ_2/</td>
			<td>TTTGCTGGGCTACGTGGCGCTCTT</td>
			<td>&#160;&#160;&#160;hairpin probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3B ligand strand</td>
			<td>5&#39; modification: Cy3B 
			3&#39; modification: /3Bio/</td>
			<td>CGCATCTGTGCG GTA TTT CAC TTT</td>
			<td>hairpin probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>unlocking strand</td>
			<td>5&#39; modification: no modification 
			3&#39; modification: no modification</td>
			<td>TAG GTA GGG TAT AAA TGT TTT TTT C</td>
			<td>unlocking accumulated tension signal</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dna tension probes to map the transient piconewton receptor forces by immune cells

Mekaniske kræfter, der overføres ved krydset mellem to naboceller og ved krydset mellem celler og den ekstracellulære matrix, er kritiske for regulering af mange processer lige fra udvikling til immunologi. Derfor er det afgørende at udvikle værktøjerne til at studere disse kræfter på molekylær skala. Vores gruppe udviklede en række molekylære spændingssensorer til at kvantificere og visualisere de kræfter, der genereres af celler og overføres til specifikke ligander. Den mest følsomme klasse af molekylære spændingssensorer består af nukleinsyrestamme-loop hårnåle. Disse sensorer bruger fluorofor-quencherpar til at rapportere om den mekaniske forlængelse og udfoldning af DNA-hårnåle under kraft. En udfordring med DNA-hårnålespændingssensorer er, at de er reversible med hurtig hårnål, der foldes sammen igen efter afslutning af spændingen, og derfor er forbigående kræfter vanskelige at registrere. I denne artikel beskriver vi protokollerne til forberedelse af DNA-spændingssensorer, der kan "låses" og forhindres i at folde sammen igen for at muliggøre "lagring" af mekanisk information. Dette muliggør registrering af stærkt forbigående piconewtonkræfter, som efterfølgende kan "slettes" ved tilsætning af komplementære nukleinsyrer, der fjerner låsen. Denne evne til at skifte mellem spændingskortlægning i realtid og mekanisk informationslagring afslører svage, kortvarige og mindre rigelige kræfter, der almindeligvis anvendes af T-celler som en del af deres immunfunktioner.

Her viser vi repræsentative overfladekvalitetskontrolbilleder (figur 4). En overflade af høj kvalitet skal have en ren baggrund i RICM-kanalen (figur 4B) og ensartet fluorescensintensitet i Cy3B-kanalen (figur 4C). Med det samme billeddannelsesudstyr og identiske betingelser for erhvervelse af fluorescensbilleddannelse bør baggrundsfluorescensintensiteten være konsistent og reproducerbar hver gang, når der udføres forsøg med ...

Watch this Scientific Journal Video about DNA Tension Probes to Map the Transient Piconewton Receptor Forces by Immune Cells at JoVE.com

DNA Tension Probes to Map the Transient Piconewton Receptor Forces by Immune Cells

Dette papir beskriver en detaljeret protokol til brug af DNA-baserede spændingsprober til at afbilde receptorkræfterne anvendt af immunceller. Denne tilgang kan kortlægge receptorkræfter >4,7 pN i realtid og kan integrere kræfter over tid.

DNA-spændingssonder til at kortlægge immuncellernes forbigående piconewtonreceptorkræfter

Mechanical forces transmitted at the junction between two neighboring cells and at the junction between cells and the extracellular matrix are critical ...

Denne protokol tilbyder en metode til at kortlægge de molekylære kræfter, der genereres af celler og især immunceller. Protokollen er afgørende for laboratorier, der er interesserede i at studere mekanotransduktion i mekanobiologi. Den største fordel ved denne teknik er, at den er super nem og giver mulighed for at bruge konventionel fluorescensmikroskopi til at kvantificere kraftoverførsel i udødeliggjorte og primære celler.Til at begynde med skal du placere 25 millimeter dæksler på et polytetrafluorethylenstativ i et 50 ml bægerglas og skylle dækslerne tre gange ved at nedsænke dem i vand. Bland lige store mængder ethanol og vand, og tilsæt 40 ml af denne opløsning til bægerglasset, der indeholder stativet og dækslerne. Derefter forsegles bægerglasset ved hjælp af parafilmtape.Rens dækslerne ved at sonikere bægerglasset i 15 minutter i en ultralydsrenser og kassér væsken efter sonikering. Derefter skylles bægerglasset med risten og dækslerne med vand mindst seks gange for at fjerne eventuelt resterende organisk opløsningsmiddel. For at forberede en frisk piranhaopløsning tilsættes 30 ml svovlsyre til et 50 ml bægerglas og tilsættes langsomt 10 ml hydrogenperoxid.Bland forsigtigt piranhaopløsningen ved hjælp af enden af en glaspipette. For at starte ætsningen overføres stativet med dæksedlerne til bægerglasset, der indeholder piranhaopløsning, og inkuberes i 30 minutter ved stuetemperatur for at rense og hydroxylere dæksedlerne. Overfør derefter stativet ved hjælp af stål- eller polytetrafluorethylenpincet til et rent 50 ml bægerglas og skyl med vand seks gange.For at fjerne vand helt, nedsænk stativet, der holder dækslerne, i et 50 ml bægerglas med 40 ml ethanol. Kassér derefter ethanolen. Derefter nedsænkes stativet i 40 ml ethanol indeholdende 3% aminopropyltriethoxysilan i en time ved stuetemperatur for at initiere reaktionen med hydroxylgruppen på dækslerne.Skyl overfladen af dækslerne seks gange ved at nedsænke dem i 40 ml ethanol og tør dem i en ovn ved 80 grader Celsius i 20 minutter. Dæk den indvendige bund af petriskålen med et parafilmbånd for at forhindre, at dækslerne glider ind i petriskålen. Placer derefter de amindækkede dæksedler med den side, der skal funktionaliseres med DNA-spændingssonder opad.Dæk dæksedlerne ved 20 grader Celsius til fremtidig brug. For at ændre amingrupperne på dæksedlerne tilsættes liponsyre PEG NHS og mPEG NHS og inkuberes petriskålen ved stuetemperatur i en time. Ved afslutningen af inkubationen skylles overfladen tre gange med vand.Derefter tilsættes 100 mikroliter 0,1 molært natriumbicarbonat indeholdende et milligram pr. Milliliter sulfo-NHS-acetat til et sæt sandwichdæksler og inkuberes i 30 minutter for passivering at forekomme. Tilsæt 0,5 ml guldnanopartikler til hvert dæksel og inkuber i 30 minutter ved stuetemperatur. Efter inkubation skylles dækslerne med vand tre gange.Efter tilsætning af Black Hole Quencher 2-streng til den udglødede DNA-spændingssonde i et forhold på ti til en, tilsættes 100 mikroliter af blandingen pr. To dæksedler for at lave sandwichen. Anbring forsigtigt en våd laboratorievævskugle i petriskålen væk fra dæksedlerne og forsegl skålen med parafilmtape for at forhindre, at opløsningen tørrer. Derefter dækkes skålen med en folie og inkuberes ved fire grader Celsius natten over.Den næste dag skal du samle billeddannelseskammeret og sørge for at forhindre overfladerevner, mens du strammer kammeret. Derefter tilsættes 0,5 til en milliliter Hanks afbalancerede saltopløsning til billeddannelseskammeret. Brug Cy3B-kanalen med et 100X-mål til at fange fluorescerende signaler fra celler, der er belagt på DNA-hårnålespændingssonderne, når de begynder at sprede sig.Efter klargøring af 100 mikroMolær ikke-fluorescerende låsestrengsbestand tilsættes den på det ønskede tidspunkt til cellerne i en slutkoncentration på en mikroMolar i billeddannelseskammeret for at lagre spændingssignalet og blandes med cellerne ved pipettering. Efter ca. 10 minutters låsning skal du anskaffe time-lapse-film eller slutpunktsbilleder i epifluorescens til både kvalitativ spændingskortlægning og kvantitativ analyse. En vellykket overflade havde en lyserød farve.Overfladens høje kvalitet blev demonstreret med en ren baggrund og refleksionsinterferenskontrastmikroskopi eller RICM-kanal og ensartet fluorescensintensitet i Cy3B-kanalen. Time-lapse-billeder af spændingslåsning indikerede, at både TCR anti-CD3 epsilon og TCR-peptid-MHC spændingssignaler blev forstærket på grund af hårnålelåsning og signalakkumulering. Låsestrengen registrerede kortvarige mekaniske trækhændelser af TCR-peptid MHCN4, der startede ved nul minutter, hvilket lettede kvantitativ analyse og afslørede det særskilte mønster af TCR-peptidet MHC-kraft, der lignede bullseye-mønsteret af immunsynapser.Hvert trin, din hensigt sonde substrat forberedelse kræver opmærksomhed på detaljer og omhyggelig håndtering af materialerne. Denne teknologi muliggør visualisering af forbigående molekylære kræfter, der opstår på celleoverfladen, når den interagerer med miljøet, især i immuncellerne på jagt efter antigener.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Attaching Biological Probes to Silica Optical Biosensors Using Silane Coupling Agents

Fastgørelse Biologiske Prober til silica Optiske biosensorer Anvendelse silankoblingsmidler

In order to interface with biological environments, biosensor platforms, such as the popular Biacore system (based on the Surface Plasmon Resonance (SPR) ...

Mass Cytometry: Protocol for Daily Tuning and Running Cell Samples on a CyTOF Mass Cytometer

Mass Cytometry: Protokol for Daily Tuning og Running celleprøver på en CyTOF Mass Cytometer

In recent years, the rapid analysis of single cells has commonly been performed using flow cytometry and fluorescently-labeled antibodies. However, the ...

Measurement of Tension Release During Laser Induced Axon Lesion to Evaluate Axonal Adhesion to the Substrate at Piconewton and Millisecond Resolution

Måling af Tension frigivelse i løbet Laser Induced Axon Læsion at evaluere axonale vedhæftning til underlaget ved Piconewton og millisekund

The formation of functional connections in a developing neuronal network is influenced by extrinsic cues. The neurite growth of developing neurons is ...

Insertion of Flexible Neural Probes Using Rigid Stiffeners Attached with Biodissolvable Adhesive

Indsættelse af Fleksibel Neural Probes Brug Stive Afstivninger Attached med Biodissolvable Adhesive

Microelectrode  arrays for neural interface devices that are made of biocompatible thin-film  polymer are expected to have extended functional lifetime ...

Generation of Shear Adhesion Map Using SynVivo Synthetic Microvascular Networks

Generering af Shear Vedhæftning kort Brug SynVivo Syntetisk Mikrovaskulære Networks

Cell/particle adhesion assays are critical to understanding the biochemical interactions involved in disease pathophysiology and have important ...

Studying the Stoichiometry of Epidermal Growth Factor Receptor in Intact Cells using Correlative Microscopy

Undersøgelse af støkiometrien af ​​epidermal vækstfaktor receptor i intakte celler ved hjælp af korrelative Microscopy

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative fluorescence ...

An Experimental Protocol for Assessing the Performance of New Ultrasound Probes Based on CMUT Technology in Application to Brain Imaging

En eksperimentel protokol til vurdering af nye ultralyd sonder baseret på CMUT teknologi i anvendelse til Brain Imaging ydeevne

The possibility to perform an early and repeatable assessment of imaging performance is fundamental in the design and development process of new ...

Probing the Roles of Physical Forces in Early Chick Embryonic Morphogenesis

Sondering roller af fysiske kræfter i tidlige Chick embryonale morfogenese

Embryonic development is traditionally studied from the perspective of biomolecular genetics, but the fundamental importance of mechanics in morphogenesis ...

Imaging Integrin Tension and Cellular Force at Submicron Resolution with an Integrative Tension Sensor

Imaging Integrin spændinger og cellulære kraft på Submicron opløsning med en integrativ spænding Sensor

Molecular tension transmitted by integrin-ligand bonds is the fundamental mechanical signal in the integrin pathway that plays significant roles in many ...