Name: dna tension probes to map the transient piconewton receptor forces by immune cells
Uploaded: 2021-03-20T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about DNA Tension Probes to Map the Transient Piconewton Receptor Forces by Immune Cells at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door NIH Grants R01GM131099, NIH R01GM124472 en NSF CAREER 1350829. We danken de NIH Tetramer Facility voor pMHC-liganden. Deze studie werd gedeeltelijk ondersteund door de Emory Comprehensive Glycomics Core.

De OT-1 transgene muizen zijn gehuisvest in de Division of Animal Resources Facility aan de Emory University. Alle experimenten werden goedgekeurd en uitgevoerd onder het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) protocol.
1. Oligonucleotidepreparaat
<ol><li>Los het DNA van de ligandstreng op in water (weerstand van 18,2 MΩ, gebruikt in het hele protocol). Vortex en draai de oplossing af met een tafelcentrifuge. Stem het watervolume zo af dat de uiteindelijke concentratie 1 mM is....

<ol>
	<li>Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+activation+through+immunological+synapses+and+kinapses.">T-cell activation through immunological synapses and kinapses.</a> Immunological Reviews. 221 (1), 77-89 (2008).</li><li>Spillane, K. M., Tolar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+cell+antigen+extraction+is+regulated+by+physical+properties+of+antigen-presenting+cells.">B cell antigen extraction is regulated by physical properties of antigen-presenting cells.</a> Journal of Cell Biology. 216 (1), 217-230 (2017).</li><li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanosensing+drives+acuity+of+&#945;&#946;+T-cell+recognition.">Mechanosensing drives acuity of &#945;&#946; T-cell recognition.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (39), 8204-8213 (2017).</li><li>Hong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+TCR+mechanotransduction+signaling+loop+induces+negative+selection+in+the+thymus.">A TCR mechanotransduction signaling loop induces negative selection in the thymus.</a> Nature Immunology. 19 (12), 1379-1390 (2018).</li><li>Basu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxic+T+cells+use+mechanical+force+to+potentiate+target+cell+killing.">Cytotoxic T cells use mechanical force to potentiate target cell killing.</a> Cell. 165 (1), 100-110 (2016).</li><li>Bashour, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD28+and+CD3+have+complementary+roles+in+T-cell+traction+forces.">CD28 and CD3 have complementary roles in T-cell traction forces.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (6), 2241-2246 (2014).</li><li>Ma, V. P. Y., Salaita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+nanotechnology+as+an+emerging+tool+to+study+mechanotransduction+in+living+systems.">DNA nanotechnology as an emerging tool to study mechanotransduction in living systems.</a> Small. 15 (26), 1900961 (2019).</li><li>Liu, Y., Yehl, K., Narui, Y., Salaita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tension+sensing+nanoparticles+for+mechano-imaging+at+the+living/nonliving+interface.">Tension sensing nanoparticles for mechano-imaging at the living/nonliving interface.</a> Journal of the American Chemical Society. 135 (14), 5320-5323 (2013).</li><li>Glazier, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+mechanotechnology+reveals+that+integrin+receptors+apply+pN+forces+in+podosomes+on+fluid+substrates.">DNA mechanotechnology reveals that integrin receptors apply pN forces in podosomes on fluid substrates.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-13 (2019).</li><li>Galior, K., Liu, Y., Yehl, K., Vivek, S., Salaita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Titin-based+nanoparticle+tension+sensors+map+high-magnitude+integrin+forces+within+focal+adhesions.">Titin-based nanoparticle tension sensors map high-magnitude integrin forces within focal adhesions.</a> Nano Letters. 16 (1), 341-348 (2016).</li><li>Zhang, Y., Ge, C., Zhu, C., Salaita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-based+digital+tension+probes+reveal+integrin+forces+during+early+cell+adhesion.">DNA-based digital tension probes reveal integrin forces during early cell adhesion.</a> Nature Communications. 5, 5167 (2014).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-based+nanoparticle+tension+sensors+reveal+that+T-cell+receptors+transmit+defined+pN+forces+to+their+antigens+for+enhanced+fidelity.">DNA-based nanoparticle tension sensors reveal that T-cell receptors transmit defined pN forces to their antigens for enhanced fidelity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (20), 5610-5615 (2016).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+integrins+exhibit+anisotropic+mechanosensing+and+harness+piconewton+forces+to+mediate+platelet+aggregation.">Platelet integrins exhibit anisotropic mechanosensing and harness piconewton forces to mediate platelet aggregation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (2), 325-330 (2018).</li><li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+kinetics+of+two-dimensional+TCR+and+pMHC+interactions+determine+T-cell+responsiveness.">The kinetics of two-dimensional TCR and pMHC interactions determine T-cell responsiveness.</a> Nature. 464 (7290), 932-936 (2010).</li><li>Ma, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+probes+that+store+mechanical+information+reveal+transient+piconewton+forces+applied+by+T+cells.">DNA probes that store mechanical information reveal transient piconewton forces applied by T cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (34), 16949-16954 (2019).</li><li>Hui, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+costimulatory+receptor+CD28+is+a+primary+target+for+PD-1-mediated+inhibition.">T cell costimulatory receptor CD28 is a primary target for PD-1-mediated inhibition.</a> Science. 355 (6332), 1428-1433 (2017).</li><li>Whitley, K. D., Comstock, M. J., Chemla, Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elasticity+of+the+transition+state+for+oligonucleotide+hybridization.">Elasticity of the transition state for oligonucleotide hybridization.</a> Nucleic Acids Research. 45 (2), 547-555 (2016).</li><li>Brockman, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+super-resolved+PAINT+imaging+of+piconewton+cellular+traction+forces.">Live-cell super-resolved PAINT imaging of piconewton cellular traction forces.</a> Nature Methods. 17 (10), 1018-1024 (2020).</li></ol>

Met de gedetailleerde procedures die hier worden gegeven, kan men DNA-haarspeldspanningsondesubstraten voorbereiden om de receptorspanning geproduceerd door immuuncellen in kaart te brengen en te kwantificeren. Wanneer cellen op het substraat van de DNA-haarspeldspanningsonde worden geplaatst, landen, hechten en verspreiden ze zich terwijl de receptoren de liganden zowel chemisch als mechanisch waarnemen, waarvan de laatste wordt gedetecteerd door onze sondes. In sommige gevallen kunnen cellen zich echter niet verspreide...

Immuuncellen verdedigen zich tegen ziekteverwekkers en kankercellen door voortdurend de oppervlakken van doelcellen te kruipen en te scannen op antigenen, waarbij hun oppervlak 1,2 wordt gestudeerd. Antigeenherkenning wordt geïnitieerd na binding tussen de T-celreceptor (TCR) en het peptide-major histocompatibiliteitscomplex MHC (pMHC) -complex dat tot expressie komt op het oppervlak van doelcellen. Omdat TCR-pMHC-herkenning plaatsvindt op de kruising tussen twee mobiele cellen, wordt al lang vermoed dat het mechanische krachten ervaart. Bovendien leidde dit tot het mechanosensormodel van TCR-activering, dat suggereert dat TCR-krachten bijdragen aan zijn functie 3,4. Om te begrijpen wanneer, waar en hoe mechanische krachten bijdragen aan de T-celfunctie, is het noodzakelijk om hulpmiddelen te ontwikkelen om de moleculaire krachten die door T-cellen worden overgedragen te visualiseren. Traditioneel worden methoden zoals tractiekrachtmicroscopie (TFM) en micropillar arrays gebruikt om cellulaire krachten 5,6 te onderzoeken. De krachtgevoeligheid van TFM en micropilaire arrays bevindt zich echter op de nanonewton (nN) schaal en is dus vaak onvoldoende om de moleculaire piconewton (pN) krachten te bestuderen die door celreceptorenworden overgedragen 7. Om de kracht en ruimtelijke resolutie voor detectie te verbeteren, pionierde ons laboratorium met de ontwikkeling van moleculaire spanningsondes, die aanvankelijk werden gesynthetiseerd met behulp van polyethyleenglycol (PEG) polymeren7. Moleculaire spanningsondes bestaan uit een uitschuifbare moleculaire "veer" (PEG, eiwit, DNA) geflankeerd door een fluorofoor en quencher en zijn verankerd op een oppervlak. Krachten die op het eindpunt van de sonde worden uitgeoefend, leiden tot de uitbreiding ervan, waardoor de fluorofoor en de quencher worden gescheiden en zo een sterk fluorescentiesignaal wordt gegenereerd (figuur 1A)8,9,10.
In het afgelopen decennium hebben we een bibliotheek ontwikkeld van verschillende klassen van moleculaire spanningsondes met veerelementen gemaakt van nucleïnezuren11, eiwitten10 en polymeren8. Onder deze bieden de op DNA gebaseerde spanningssondes de hoogste signaal-ruisverhouding en de grootste krachtgevoeligheid, die gemakkelijk kan worden afgestemd van een paar pN tot ~ 20 pN11. We hebben deze real-time DNA-spanningsondes gebruikt om de moleculaire krachten te bestuderen die worden gegenereerd door vele verschillende celtypen, waaronder fibroblasten, kankercellen, bloedplaatjes en immuuncellen11,12,13. Dit manuscript zal protocollen beschrijven voor het synthetiseren en assembleren van DNA-spanningsondes op een oppervlak om moleculaire receptorkrachten in kaart te brengen met pN-krachtresolutie met behulp van een conventionele fluorescentiemicroscoop. Hoewel de huidige procedure chemische modificaties aan het nucleïnezuur omvat om de fluorescerende reporter te introduceren (figuur 1B), is het belangrijk op te merken dat veel van de modificatie- en zuiveringsstappen kunnen worden uitbesteed aan aangepaste DNA-synthesebedrijven. Daarom is de technologie van DNA-spanningsondes gemakkelijk en toegankelijk voor de bredere celbiologie en mechanobiologiegemeenschappen.
Kortom, om DNA-spanningssensoren samen te stellen, wordt een DNA-haarspeld gehybridiseerd tot een fluorescerende ligandstreng op de ene arm en een quencher-ankerstreng op de andere arm en vervolgens geïmmobiliseerd op een glazen substraat (figuur 1C, real-time spanning). Bij afwezigheid van mechanische kracht wordt de haarspeld gesloten en wordt dus de fluorescentie geblust. Wanneer de uitgeoefende mechanische kracht echter groter is dan de F1/2 (de kracht bij evenwicht die leidt tot een kans van 50% om zich te ontvouwen), smelt de haarspeld mechanisch en wordt een fluorescerend signaal gegenereerd.
Voortbouwend op de real-time DNA-spanningssensor beschrijven we ook protocollen om geaccumuleerde krachten in kaart te brengen, wat vooral nuttig is voor het bestuderen van interacties tussen receptoren op immuuncellen en hun natuurlijke ligand. Dit komt omdat immuunreceptoren vaak kortstondige bindingen vertonen 3,14. Geaccumuleerde krachten worden in beeld gebracht met behulp van een "vergrendelingsstreng" die bij voorkeur bindt aan open DNA-haarspelden en de opslag van fluorescentiesignalen mogelijk maakt die verband houden met mechanische trekgebeurtenissen (figuur 1C, vergrendelde spanning). De vergrendelingsstreng is ontworpen om een cryptische bindingsplaats te binden die wordt blootgesteld aan mechanisch geïnduceerd smelten van de haarspeld en de haarspeld in de open toestand te vergrendelen door het opnieuw vouwen van de haarspeld te blokkeren, waardoor het spanningssignaal wordt opgeslagen en een geaccumuleerde spanningskaart wordt gegenereerd. Bovendien is de vergrendelingsstreng ontworpen met een acht-nucleotide teengreep, die een teengreep-gemedieerde strengverplaatsingsreactie mogelijk maakt met zijn volledige complement, de "ontgrendelende" streng. Met de toevoeging van de ontgrendelingsstreng wordt de gebonden vergrendelingsstreng van de haarspeldconstructie gestript, waardoor het opgeslagen spanningssignaal wordt gewist en de haarspeld wordt teruggezet naar de real-time status.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62348/62348fig01.jpg"> Figuur 1: Schema van de state-of-art moleculaire spanningsondes . (A) Algemeen ontwerp van real-time moleculaire spanningsonde, (B) Strengen voor de DNA-gebaseerde spanningsondeconstructie, en (C) gemanipuleerde DNA-gebaseerde spanningsondes en hun schakelen tussen real-time toestand en vergrendelde toestand. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62348/62348fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Het hoofdprotocol bestaat uit vier hoofdsecties - oligonucleotidepreparaat, oppervlaktevoorbereiding, beeldvorming en gegevensanalyse. Dit protocol is met succes aangetoond door ons laboratorium en anderen in naïeve en geactiveerde OT-1 CD8 + T-cellen, OT-II CD4 + -cellen, evenals hybridomen, en kan worden toegepast om verschillende immuuncelreceptoren te ondervragen, waaronder T-celreceptor, geprogrammeerde celdoodreceptor (PD1) en lymfocytfunctie-geassocieerde antigeen 1 (LFA-1) krachten. OT-1 CD8+ naïeve T-cellen worden in dit artikel als voorbeeldcellijn gebruikt.

<table fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#160;3-hydroxypicolinic acid (3-HPA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>56197</td>
			<td>maldi-TOF-MS matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;mPEG-SC</td>
			<td>Biochempeg</td>
			<td>MF001023-2K</td>
			<td>surface prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(3-Aminopropyl)triethoxysilane</td>
			<td>Acros</td>
			<td>AC430941000</td>
			<td>surface prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Red blood cell lysis buffer</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>00-4333-57</td>
			<td>buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8.8 nm gold nanoparticles, tannic acid</td>
			<td>Nanocomposix</td>
			<td>customized order</td>
			<td>surface prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atto647N NHS ester</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>18373-1MG-F</td>
			<td>fluorophore, oligo prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attofluor Cell Chamber, for microscopy</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A7816</td>
			<td>imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Syringes only with Luer-Lok</td>
			<td>BD bioscience</td>
			<td>309657</td>
			<td>cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>biotinylated anti-mouse CD3e</td>
			<td>ebioscience</td>
			<td>13-0031-82</td>
			<td>antibody/ligand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated pMHC ovalbumin (SIINFEKL)</td>
			<td>NIH Tetramer Core Facility at Emory University</td>
			<td>NA</td>
			<td>antibody/ligand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>735078001</td>
			<td>block non-specific interactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainers</td>
			<td>Biologix</td>
			<td>15-1100</td>
			<td>cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip Mini-Rack, teflon</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C14784</td>
			<td>surface prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3B NHS ester</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>PA63101</td>
			<td>fluorophore, oligo prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CM</td>
			<td>buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>459836</td>
			<td>surface prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s balanced salts (HBSS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H8264</td>
			<td>buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hydrogen peroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H1009</td>
			<td>surface prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LA-PEG-SC</td>
			<td>Biochempeg</td>
			<td>HE039023-3.4K</td>
			<td>surface prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Midi MACS (LS) startup kit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-301</td>
			<td>cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse CD8+ T cell isolation kit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-104-075</td>
			<td>cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanosep MF centrifugal devices</td>
			<td>Pall laboratory</td>
			<td>ODM02C35</td>
			<td>oligo prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>No. 2 round glass coverslips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48382-085</td>
			<td>surface prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTA-SAM</td>
			<td>Dojindo Molecular Technologies</td>
			<td>N475-10</td>
			<td>surface prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P2 gel</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1504118</td>
			<td>oligo prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sufuric acid</td>
			<td>EMD Millipore Corporation</td>
			<td>SX1244-6</td>
			<td>surface prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-NHS acetate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>26777</td>
			<td>surface prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent AdvanceBio Oligonucleotide C18 column, 4.6 x 150 mm, 2.7 &#956;m</td>
			<td>653950-702</td>
			<td></td>
			<td>oligonucleotide preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barnstead Nanopure water purifying system</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td>water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFI Apo 100&#215; NA 1.49 objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy5 cube</td>
			<td>CHROMA</td>
			<td></td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>evolve electron multiplying charge coupled device (EMCCD)</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td></td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-performance liquid chromatography</td>
			<td>Agilent 1100</td>
			<td></td>
			<td>oligonucleotide preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intensilight epifluorescence source</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometer (MALDI-TOF-MS)</td>
			<td>Voyager STR</td>
			<td></td>
			<td>oligonucleotide preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td>oligonucleotide preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ti inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Perfect Focus System</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>quad band TIRF 405/488/561/647 cube</td>
			<td>CHROMA</td>
			<td></td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RICM cube</td>
			<td>CHROMA</td>
			<td></td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TIRF launcher with 488 nm (50 mW), 561 nm (50 mW), and 640 nm</td>
			<td>Coherent</td>
			<td></td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRITC cube</td>
			<td>CHROMA</td>
			<td></td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligo name</td>
			<td>5&#39; modification / 3&#39; modification</td>
			<td>sequence (5&#39; to 3&#39;)</td>
			<td>Use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15mer amine locking strand</td>
			<td>5&#39; modification: no modification 
			3&#39; modification: /3AmMO/</td>
			<td>AAA AAA CAT TTA TAC CCT ACC TA</td>
			<td>locking real-time tension signal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15mer Atto647N locking strand</td>
			<td>5&#39; modification: Atto647N 
			3&#39; modification: /3AmMO/</td>
			<td>AAA AAA CAT TTA TAC CCT ACC TA</td>
			<td>locking real-time tension signal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15mer non-fluoresccent locking strand</td>
			<td>5&#39; modification: no modification 
			3&#39; modification: no modification</td>
			<td>A AAA AAC ATT TAT AC</td>
			<td>locking real-time tension signal for quantitative analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4.7 pN hairpin strand</td>
			<td>5&#39; modification: no modification 
			3&#39; modification: no modification</td>
			<td>GTGAAATACCGCACAGATGCGT 
 TTGTATAAATGTTTTTTTCATTTAT 
 ACTTTAAGAGCGCCACGTAGCC 
CAGC</td>
			<td>hairpin probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>amine ligand strand</td>
			<td>5&#39; modification: /5AmMC6/ 
			3&#39; modification: /3Bio/</td>
			<td>CGCATCTGTGCG GTA TTT CAC TTT</td>
			<td>hairpin probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BHQ2 anchor strand</td>
			<td>5&#39; modification: /5ThiolMC6-D/ 
			3&#39; modification: /3BHQ_2/</td>
			<td>TTTGCTGGGCTACGTGGCGCTCTT</td>
			<td>&#160;&#160;&#160;hairpin probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3B ligand strand</td>
			<td>5&#39; modification: Cy3B 
			3&#39; modification: /3Bio/</td>
			<td>CGCATCTGTGCG GTA TTT CAC TTT</td>
			<td>hairpin probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>unlocking strand</td>
			<td>5&#39; modification: no modification 
			3&#39; modification: no modification</td>
			<td>TAG GTA GGG TAT AAA TGT TTT TTT C</td>
			<td>unlocking accumulated tension signal</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dna tension probes to map the transient piconewton receptor forces by immune cells

Mechanische krachten die worden overgedragen op de kruising tussen twee naburige cellen en op de kruising tussen cellen en de extracellulaire matrix zijn van cruciaal belang voor het reguleren van vele processen, variërend van ontwikkeling tot immunologie. Daarom is het ontwikkelen van de tools om deze krachten op moleculaire schaal te bestuderen van cruciaal belang. Onze groep ontwikkelde een reeks moleculaire spanningssensoren om de krachten te kwantificeren en te visualiseren die door cellen worden gegenereerd en naar specifieke liganden worden verzonden. De meest gevoelige klasse van moleculaire spanningssensoren bestaat uit nucleïnezuur stam-loop haarspelden. Deze sensoren gebruiken fluorofoor-quencher-paren om te rapporteren over de mechanische uitbreiding en ontvouwing van DNA-haarspelden onder kracht. Een uitdaging met DNA-haarspeldspanningssensoren is dat ze omkeerbaar zijn met snelle haarspeldhervouwing bij beëindiging van de spanning en dus zijn voorbijgaande krachten moeilijk te registreren. In dit artikel beschrijven we de protocollen voor het voorbereiden van DNA-spanningssensoren die kunnen worden "vergrendeld" en voorkomen dat ze opnieuw worden gevouwen om "opslag" van mechanische informatie mogelijk te maken. Dit maakt het mogelijk om zeer voorbijgaande piconewtonkrachten te registreren, die vervolgens kunnen worden "gewist" door de toevoeging van complementaire nucleïnezuren die het slot verwijderen. Dit vermogen om te schakelen tussen real-time spanningskartering en mechanische informatieopslag onthult zwakke, kortstondige en minder overvloedige krachten, die vaak worden gebruikt door T-cellen als onderdeel van hun immuunfuncties.

Hier tonen we representatieve beelden van oppervlaktekwaliteitscontrole (figuur 4). Een oppervlak van hoge kwaliteit moet een schone achtergrond hebben in het RICM-kanaal (figuur 4B) en een uniforme fluorescentie-intensiteit in het Cy3B-kanaal (figuur 4C). Met dezelfde beeldvormingsapparatuur en identieke fluorescentiebeeldvormingsverwervingsomstandigheden moet de achtergrondfluorescentie-intensiteit elke keer consistent en reproduc...

Watch this Scientific Journal Video about DNA Tension Probes to Map the Transient Piconewton Receptor Forces by Immune Cells at JoVE.com

DNA Tension Probes to Map the Transient Piconewton Receptor Forces by Immune Cells

Dit artikel beschrijft een gedetailleerd protocol voor het gebruik van DNA-gebaseerde spanningsondes om de receptorkrachten in beeld te brengen die door immuuncellen worden toegepast. Deze aanpak kan receptorkrachten >4,7pN in realtime in kaart brengen en krachten in de loop van de tijd integreren.

DNA-spanningsondes om de voorbijgaande piconewtonreceptorkrachten door immuuncellen in kaart te brengen

Mechanical forces transmitted at the junction between two neighboring cells and at the junction between cells and the extracellular matrix are critical ...

Dit protocol biedt een methode om de moleculaire krachten die door cellen en met name immuuncellen worden gegenereerd in kaart te brengen. Het protocol is van cruciaal belang voor laboratoria die geïnteresseerd zijn in het bestuderen van mechanotransductie in mechanobiologie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het supereenvoudig is en het mogelijk maakt om conventionele fluorescentiemicroscopie te gebruiken om de krachtoverdracht in onsterfelijke en primaire cellen te kwantificeren.Plaats om te beginnen 25 millimeter coverslips op een polytetrafluorethyleen rek in een bekerglas van 50 milliliter en spoel de coverslips drie keer af door ze onder te dompelen in water. Meng gelijke hoeveelheden ethanol en water en voeg 40 milliliter van deze oplossing toe aan het bekerglas met het rek en de afdekplaten. Sluit vervolgens het bekerglas af met parafilmtape.Reinig de coverslips door het bekerglas gedurende 15 minuten in een ultrasone reiniger te soniceren en gooi de vloeistof na ultrasoonapparaat weg. Spoel vervolgens het bekerglas met het rek en dek het af met water ten minste zes keer om het resterende organische oplosmiddel te verwijderen. Om een verse piranha-oplossing te bereiden, voegt u 30 milliliter zwavelzuur toe aan een bekerglas van 50 milliliter en voegt u langzaam 10 milliliter waterstofperoxide toe.Meng de piranha-oplossing voorzichtig met behulp van het uiteinde van een glazen pipet. Om het etsen te initiëren, brengt u het rek met de afdekstroken over naar het bekerglas met piranha-oplossing en incubeert u gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur om de dekplaten te reinigen en te hydroxyleren. Breng vervolgens het rek met een stalen of polytetrafluorethyleenpincet over in een schoon bekerglas van 50 milliliter en spoel het zes keer af met water.Om water volledig te verwijderen, dompelt u het rek met de afdekplaten onder in een bekerglas van 50 milliliter met 40 milliliter ethanol. Gooi vervolgens de ethanol weg. Dompel het rek vervolgens gedurende een uur bij kamertemperatuur onder in 40 milliliter ethanol met 3% aminopropyltriethoxysilaan om de reactie met de hydroxylgroep op de dekstroken op gang te brengen.Spoel het oppervlak van de afdekstroken zes keer door ze onder te dompelen in 40 milliliter ethanol en droog ze gedurende 20 minuten in een oven op 80 graden Celsius. Bedek de binnenbodem van de petrischaal met een parafilmtape om te voorkomen dat de afdekstroken in de petrischaal glijden. Plaats vervolgens de met amine bedekte coverslips met de te functionaliseren zijkant met DNA-spanningsondes naar boven gericht.Bedek de coverslips op 20 graden Celsius voor toekomstig gebruik. Om de aminegroepen op de coverslips te wijzigen, voegt u liponzuur PEG NHS en mPEG NHS toe en incubeert u de petrischaal gedurende een uur bij kamertemperatuur. Spoel het oppervlak aan het einde van de incubatie drie keer af met water.Voeg daarna 100 microliter 0,1 molair natriumbicarbonaat met één milligram per milliliter sulfo-NHS-acetaat toe aan een set sandwichafdekkingen en incubeer gedurende 30 minuten voor passivering. Voeg 0,5 milliliter gouden nanodeeltjes toe aan elke coverslip en incuber gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Spoel na de incubatie de afdekstroken drie keer af met water.Na het toevoegen van Black Hole Quencher 2-streng aan de gegloeide DNA-spanningsonde in een verhouding van tien tot één, voegt u 100 microliter van het mengsel per twee coverslips toe om de sandwich te maken. Plaats voorzichtig een natte labtissuebal in de petrischaal uit de buurt van de afdekstroken en sluit de schaal af met parafilmtape om te voorkomen dat de oplossing uitdroogt. Bedek daarna de schaal met een folie en incubeer het een nacht bij vier graden Celsius.Monteer de volgende dag de beeldvormingskamer en zorg ervoor dat het oppervlak scheurt tijdens het aanspannen van de kamer. Voeg vervolgens 0,5 tot één milliliter Hank's Balanced Salt Solution toe aan de beeldvormingskamer. Gebruik het Cy3B-kanaal met een 100X-objectief om fluorescerende signalen van cellen op de DNA-haarspeldspanningsondes vast te leggen wanneer ze zich beginnen te verspreiden.Na het bereiden van 100 microMolar niet-fluorescerende vergrendelingsstrengen, voegt u deze op het gewenste tijdstip toe aan de cellen in een eindconcentratie van één microMolar in de beeldvormingskamer om het spanningssignaal op te slaan en te mengen met de cellen door pipetteren. Na ongeveer 10 minuten vergrendelen, verkrijgt u time-lapse-films of eindpuntbeelden in epifluorescentie voor zowel kwalitatieve spanningskartering als kwantitatieve analyse. Een succesvol oppervlak had een lichtroze kleur.De hoge kwaliteit van het oppervlak werd aangetoond met een schone achtergrond en de reflectie-interferentiecontrastmicroscopie of RICM-kanaal en uniforme fluorescentie-intensiteit in het Cy3B-kanaal. Time-lapse-beelden van spanningsvergrendeling gaven aan dat zowel TCR-anti-CD3-epsilon- als TCR-peptide-MHC-spanningssignalen werden versterkt vanwege haarspeldvergrendeling en signaalaccumulatie. De vergrendelingsstreng registreerde kortstondige mechanische trekgebeurtenissen van TCR-peptide MHCN4 vanaf nul minuten, wat kwantitatieve analyse vergemakkelijkte en het duidelijke patroon van de TCR-peptide MHC-kracht onthulde dat leek op het bullseye-patroon van immuunsynapsen.Elke stap, uw intentie sonde substraatvoorbereiding vereist aandacht voor detail en zorgvuldige behandeling van de materialen. Deze technologie maakt visualisatie mogelijk van voorbijgaande moleculaire krachten die optreden aan het celoppervlak wanneer het interageert met de omgeving, vooral in de immuuncellen op zoek naar antigenen.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Attaching Biological Probes to Silica Optical Biosensors Using Silane Coupling Agents

Bevestiging van biologische Probes aan Silica optische biosensoren gebruik van silaan agenten

In order to interface with biological environments, biosensor platforms, such as the popular Biacore system (based on the Surface Plasmon Resonance (SPR) ...

Measurement of Tension Release During Laser Induced Axon Lesion to Evaluate Axonal Adhesion to the Substrate at Piconewton and Millisecond Resolution

Meting van spanningspennen Tijdens Laser Induced Axon Letsel aan Axonale Hechting Evalueer aan de ondergrond bij piconewton en Milliseconde Resolutie

The formation of functional connections in a developing neuronal network is influenced by extrinsic cues. The neurite growth of developing neurons is ...

Insertion of Flexible Neural Probes Using Rigid Stiffeners Attached with Biodissolvable Adhesive

Het inbrengen van flexibele Neural Probes starre Verstevigers Bevestigd met Biodissolvable Adhesive

Microelectrode  arrays for neural interface devices that are made of biocompatible thin-film  polymer are expected to have extended functional lifetime ...

Generation of Shear Adhesion Map Using SynVivo Synthetic Microvascular Networks

Generatie afschuifhechting Kaart behulp SynVivo Synthetische Microvascular Networks

Cell/particle adhesion assays are critical to understanding the biochemical interactions involved in disease pathophysiology and have important ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Hoge-resolutie Spatiotemporal Analyse van Receptor Dynamics door Single-molecule fluorescentie microscopie

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

Studying the Stoichiometry of Epidermal Growth Factor Receptor in Intact Cells using Correlative Microscopy

Het bestuderen van de stoichiometrie van de epidermale groeifactor receptor in intacte cellen met Correlatieve Microscopy

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative fluorescence ...

An Experimental Protocol for Assessing the Performance of New Ultrasound Probes Based on CMUT Technology in Application to Brain Imaging

Een experimenteel Protocol voor de beoordeling van de prestaties van de nieuwe Ultrasound sondes gebaseerd op CMUT technologie in toepassing op Brain Imaging

The possibility to perform an early and repeatable assessment of imaging performance is fundamental in the design and development process of new ...

Probing the Roles of Physical Forces in Early Chick Embryonic Morphogenesis

De rol van fysieke krachten in vroege Chick embryonale morfogenese sonderen

Embryonic development is traditionally studied from the perspective of biomolecular genetics, but the fundamental importance of mechanics in morphogenesis ...

Imaging Integrin Tension and Cellular Force at Submicron Resolution with an Integrative Tension Sensor

Imaging integrine spanning en cellulaire kracht bij Submicron resolutie met de Sensor van een integratieve spanning

Molecular tension transmitted by integrin-ligand bonds is the fundamental mechanical signal in the integrin pathway that plays significant roles in many ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Eencellige optische actiepotentiaalmeting in door de mens geïnduceerde pluripotente van stamcellen afgeleide cardiomyocyten

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...