Name: dna tension probes to map the transient piconewton receptor forces by immune cells
Uploaded: 2021-03-20T15:00:00
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Diese Arbeit wurde durch die NIH Grants R01GM131099, NIH R01GM124472 und NSF CAREER 1350829 unterstützt. Wir danken der NIH Tetramer Facility für pMHC-Liganden. Diese Studie wurde zum Teil durch den Emory Comprehensive Glycomics Core unterstützt.

Die transgenen OT-1-Mäuse sind in der Division of Animal Resources Facility der Emory University untergebracht. Alle Experimente wurden nach dem Protokoll des Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigt und durchgeführt.
1. Herstellung von Oligonukleotiden
<ol><li>Lösen Sie die DNA des Ligandenstrangs in Wasser auf (18,2 MΩ Widerstand, der im gesamten Protokoll verwendet wird). Vortexieren und schleudern Sie die Lösung mit einer Tischzentrifuge herunter. Stellen Sie da...

<ol>
	<li>Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+activation+through+immunological+synapses+and+kinapses.">T-cell activation through immunological synapses and kinapses.</a> Immunological Reviews. 221 (1), 77-89 (2008).</li><li>Spillane, K. M., Tolar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+cell+antigen+extraction+is+regulated+by+physical+properties+of+antigen-presenting+cells.">B cell antigen extraction is regulated by physical properties of antigen-presenting cells.</a> Journal of Cell Biology. 216 (1), 217-230 (2017).</li><li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanosensing+drives+acuity+of+&#945;&#946;+T-cell+recognition.">Mechanosensing drives acuity of &#945;&#946; T-cell recognition.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (39), 8204-8213 (2017).</li><li>Hong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+TCR+mechanotransduction+signaling+loop+induces+negative+selection+in+the+thymus.">A TCR mechanotransduction signaling loop induces negative selection in the thymus.</a> Nature Immunology. 19 (12), 1379-1390 (2018).</li><li>Basu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxic+T+cells+use+mechanical+force+to+potentiate+target+cell+killing.">Cytotoxic T cells use mechanical force to potentiate target cell killing.</a> Cell. 165 (1), 100-110 (2016).</li><li>Bashour, K. 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Y., Salaita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+nanotechnology+as+an+emerging+tool+to+study+mechanotransduction+in+living+systems.">DNA nanotechnology as an emerging tool to study mechanotransduction in living systems.</a> Small. 15 (26), 1900961 (2019).</li><li>Liu, Y., Yehl, K., Narui, Y., Salaita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tension+sensing+nanoparticles+for+mechano-imaging+at+the+living/nonliving+interface.">Tension sensing nanoparticles for mechano-imaging at the living/nonliving interface.</a> Journal of the American Chemical Society. 135 (14), 5320-5323 (2013).</li><li>Glazier, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+mechanotechnology+reveals+that+integrin+receptors+apply+pN+forces+in+podosomes+on+fluid+substrates.">DNA mechanotechnology reveals that integrin receptors apply pN forces in podosomes on fluid substrates.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-13 (2019).</li><li>Galior, K., Liu, Y., Yehl, K., Vivek, S., Salaita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Titin-based+nanoparticle+tension+sensors+map+high-magnitude+integrin+forces+within+focal+adhesions.">Titin-based nanoparticle tension sensors map high-magnitude integrin forces within focal adhesions.</a> Nano Letters. 16 (1), 341-348 (2016).</li><li>Zhang, Y., Ge, C., Zhu, C., Salaita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-based+digital+tension+probes+reveal+integrin+forces+during+early+cell+adhesion.">DNA-based digital tension probes reveal integrin forces during early cell adhesion.</a> Nature Communications. 5, 5167 (2014).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-based+nanoparticle+tension+sensors+reveal+that+T-cell+receptors+transmit+defined+pN+forces+to+their+antigens+for+enhanced+fidelity.">DNA-based nanoparticle tension sensors reveal that T-cell receptors transmit defined pN forces to their antigens for enhanced fidelity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (20), 5610-5615 (2016).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+integrins+exhibit+anisotropic+mechanosensing+and+harness+piconewton+forces+to+mediate+platelet+aggregation.">Platelet integrins exhibit anisotropic mechanosensing and harness piconewton forces to mediate platelet aggregation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (2), 325-330 (2018).</li><li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+kinetics+of+two-dimensional+TCR+and+pMHC+interactions+determine+T-cell+responsiveness.">The kinetics of two-dimensional TCR and pMHC interactions determine T-cell responsiveness.</a> Nature. 464 (7290), 932-936 (2010).</li><li>Ma, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+probes+that+store+mechanical+information+reveal+transient+piconewton+forces+applied+by+T+cells.">DNA probes that store mechanical information reveal transient piconewton forces applied by T cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (34), 16949-16954 (2019).</li><li>Hui, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+costimulatory+receptor+CD28+is+a+primary+target+for+PD-1-mediated+inhibition.">T cell costimulatory receptor CD28 is a primary target for PD-1-mediated inhibition.</a> Science. 355 (6332), 1428-1433 (2017).</li><li>Whitley, K. D., Comstock, M. J., Chemla, Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elasticity+of+the+transition+state+for+oligonucleotide+hybridization.">Elasticity of the transition state for oligonucleotide hybridization.</a> Nucleic Acids Research. 45 (2), 547-555 (2016).</li><li>Brockman, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+super-resolved+PAINT+imaging+of+piconewton+cellular+traction+forces.">Live-cell super-resolved PAINT imaging of piconewton cellular traction forces.</a> Nature Methods. 17 (10), 1018-1024 (2020).</li></ol>

Mit den hier vorgestellten detaillierten Verfahren kann man DNA-Haarnadel-Spannungssondensubstrate herstellen, um die von Immunzellen produzierte Rezeptorspannung zu kartieren und zu quantifizieren. Wenn Zellen auf das Substrat der DNA-Haarnadel-Spannungssonde plattiert werden, landen, heften sie sich an und breiten sich aus, während die Rezeptoren die Liganden sowohl chemisch als auch mechanisch wahrnehmen, wobei letzteres von unseren Sonden erkannt wird. In einigen Fällen kann es jedoch vorkommen, dass sich die Zelle...

Immunzellen wehren sich gegen Krankheitserreger und Krebszellen, indem sie kontinuierlich die Oberflächen von Zielzellen nach Antigenen durchsuchen und deren Oberfläche abtasten 1,2. Die Antigenerkennung wird durch die Bindung zwischen dem T-Zell-Rezeptor (TCR) und dem Peptid-Major-Histokompatibilitätskomplex MHC (pMHC) eingeleitet, der auf der Oberfläche der Zielzellen exprimiert wird. Da die TCR-pMHC-Erkennung an der Verbindungsstelle zwischen zwei beweglichen Zellen erfolgt, steht sie seit langem im Verdacht, mechanische Kräfte zu erfahren. Darüber hinaus führte dies zum Mechanosensormodell der TCR-Aktivierung, das darauf hindeutet, dass TCR-Kräfte zu seiner Funktion beitragen 3,4. Um zu verstehen, wann, wo und wie mechanische Kräfte zur Funktion von T-Zellen beitragen, ist es unerlässlich, Werkzeuge zu entwickeln, um die von T-Zellen übertragenen molekularen Kräfte sichtbar zu machen. Traditionell werden Methoden wie Zugkraftmikroskopie (TFM) und Mikrosäulen-Arrays verwendet, um zelluläre Kräfte zu untersuchen 5,6. Die Kraftempfindlichkeit von TFM- und Mikrosäulen-Arrays liegt jedoch im Nanonewton (nN)-Bereich und reicht daher oft nicht aus, um die molekularen Piconewton (pN)-Kräfte zu untersuchen, die von Zellrezeptoren übertragenwerden 7. Um die Kraft und die räumliche Auflösung für die Detektion zu verbessern, leistete unser Labor Pionierarbeit bei der Entwicklung von molekularen Spannungssonden, die ursprünglich mit Polyethylenglykol (PEG)-Polymeren synthetisiert wurden7. Molekulare Spannungssonden bestehen aus einer ausziehbaren molekularen "Feder" (PEG, Protein, DNA), die von einem Fluorophor und Quencher flankiert wird und auf einer Oberfläche verankert ist. Kräfte, die auf den Endpunkt der Sonde ausgeübt werden, führen zu ihrer Verlängerung, trennen Fluorophor und Quencher und erzeugen so ein starkes Fluoreszenzsignal (Abbildung 1A)8,9,10.
In den letzten zehn Jahren haben wir eine Bibliothek verschiedener Klassen von molekularen Zugsonden mit Federelementen aus Nukleinsäuren11, Proteinen10 und Polymeren8 entwickelt. Unter diesen bieten die DNA-basierten Zugsonden das höchste Signal-Rausch-Verhältnis und die größte Kraftempfindlichkeit, die leicht von wenigen pN bis zu ~20 pN11 eingestellt werden kann. Wir haben diese Echtzeit-DNA-Spannungssonden verwendet, um die molekularen Kräfte zu untersuchen, die von vielen verschiedenen Zelltypen erzeugt werden, darunter Fibroblasten, Krebszellen, Blutplättchen und Immunzellen11,12,13. In diesem Manuskript werden Protokolle zur Synthese und Montage von DNA-Zugsonden auf einer Oberfläche beschrieben, um molekulare Rezeptorkräfte mit pN-Kraftauflösung unter Verwendung eines konventionellen Fluoreszenzmikroskops abzubilden. Während das derzeitige Verfahren chemische Modifikationen der Nukleinsäure umfasst, um den fluoreszierenden Reporter einzuführen (Abbildung 1B), ist es wichtig zu beachten, dass viele der Modifikations- und Aufreinigungsschritte an kundenspezifische DNA-Syntheseunternehmen ausgelagert werden können. Daher ist die Technologie der DNA-Spannungssonden einfach und für die breitere Gemeinschaft der Zellbiologie und Mechanobiologie zugänglich.
Kurz gesagt, um DNA-Spannungssensoren zusammenzubauen, wird eine DNA-Haarnadel mit einem fluoreszierenden Ligandenstrang auf einem Arm und einem Quencher-Ankerstrang auf dem anderen Arm hybridisiert und dann auf einem Glassubstrat immobilisiert (Abbildung 1C, Echtzeitspannung). In Abwesenheit einer mechanischen Kraft wird die Haarnadel geschlossen und somit die Fluoreszenz gelöscht. Wenn jedoch die ausgeübte mechanische Kraft größer als F1/2 ist (die Kraft im Gleichgewicht, die zu einer 50%igen Wahrscheinlichkeit der Entfaltung führt), schmilzt die Haarnadel mechanisch und es wird ein fluoreszierendes Signal erzeugt.
Aufbauend auf dem Echtzeit-DNA-Spannungssensor beschreiben wir auch Protokolle zur Kartierung akkumulierter Kräfte, was besonders nützlich ist, um Interaktionen zwischen Rezeptoren auf Immunzellen und ihrem natürlichen Liganden zu untersuchen. Dies liegt daran, dass Immunrezeptoren oft kurzlebige Bindungen aufweisen 3,14. Die akkumulierten Kräfte werden mit einem "verriegelnden" Strang abgebildet, der bevorzugt an offene DNA-Haarnadeln bindet und die Speicherung von Fluoreszenzsignalen ermöglicht, die mit mechanischen Zugereignissen verbunden sind (Abbildung 1C, verriegelte Spannung). Der Verriegelungsstrang ist so konzipiert, dass er eine kryptische Bindungsstelle bindet, die beim mechanisch induzierten Schmelzen der Haarnadel freigelegt wird, und die Haarnadel im offenen Zustand sperrt, indem er die Rückfaltung der Haarnadel blockiert, wodurch das Spannungssignal gespeichert und eine akkumulierte Spannungskarte erzeugt wird. Darüber hinaus ist der Locking-Strang mit einem Acht-Nukleotid-Zehengriff ausgelegt, der eine Zehengriff-vermittelte Strangverdrängungsreaktion mit seinem vollständigen Komplement, dem "entsperrenden" Strang, ermöglicht. Durch das Hinzufügen des Entriegelungsstrangs wird der gebundene Verriegelungsstrang vom Hairpin-Konstrukt abgestreift, wodurch das gespeicherte Spannungssignal gelöscht und der Hairpin wieder in den Echtzeitzustand zurückgesetzt wird.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62348/62348fig01.jpg"> Abbildung 1: Schema der hochmodernen molekularen Spannungssonden. (A) Allgemeines Design einer Echtzeit-Molekularspannungssonde, (B) Stränge für das DNA-basierte Spannungssondenkonstrukt und (C) DNA-basierte Spannungssonden und deren Umschalten zwischen Echtzeitzustand und verriegeltem Zustand. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62348/62348fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
Das Hauptprotokoll besteht aus vier Hauptabschnitten - Oligonukleotidpräparation, Oberflächenpräparation, Bildgebung und Datenanalyse. Dieses Protokoll wurde von unserem Labor und anderen erfolgreich in naiven und aktivierten OT-1 CD8+ T-Zellen, OT-II CD4+ Zellen sowie Hybridomen demonstriert und kann angewendet werden, um verschiedene Immunzellrezeptoren zu untersuchen, einschließlich des T-Zell-Rezeptors, des programmierten Zelltodrezeptors (PD1) und der Lymphozytenfunktions-assoziierten Antigen-1-Kräfte (LFA-1). OT-1 CD8+ naive T-Zellen werden in dieser Arbeit als Beispielzelllinie verwendet.

<table fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#160;3-hydroxypicolinic acid (3-HPA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>56197</td>
			<td>maldi-TOF-MS matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;mPEG-SC</td>
			<td>Biochempeg</td>
			<td>MF001023-2K</td>
			<td>surface prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(3-Aminopropyl)triethoxysilane</td>
			<td>Acros</td>
			<td>AC430941000</td>
			<td>surface prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Red blood cell lysis buffer</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>00-4333-57</td>
			<td>buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8.8 nm gold nanoparticles, tannic acid</td>
			<td>Nanocomposix</td>
			<td>customized order</td>
			<td>surface prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atto647N NHS ester</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>18373-1MG-F</td>
			<td>fluorophore, oligo prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attofluor Cell Chamber, for microscopy</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A7816</td>
			<td>imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Syringes only with Luer-Lok</td>
			<td>BD bioscience</td>
			<td>309657</td>
			<td>cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>biotinylated anti-mouse CD3e</td>
			<td>ebioscience</td>
			<td>13-0031-82</td>
			<td>antibody/ligand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated pMHC ovalbumin (SIINFEKL)</td>
			<td>NIH Tetramer Core Facility at Emory University</td>
			<td>NA</td>
			<td>antibody/ligand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>735078001</td>
			<td>block non-specific interactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainers</td>
			<td>Biologix</td>
			<td>15-1100</td>
			<td>cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip Mini-Rack, teflon</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C14784</td>
			<td>surface prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3B NHS ester</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>PA63101</td>
			<td>fluorophore, oligo prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CM</td>
			<td>buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>459836</td>
			<td>surface prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s balanced salts (HBSS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H8264</td>
			<td>buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hydrogen peroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H1009</td>
			<td>surface prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LA-PEG-SC</td>
			<td>Biochempeg</td>
			<td>HE039023-3.4K</td>
			<td>surface prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Midi MACS (LS) startup kit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-301</td>
			<td>cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse CD8+ T cell isolation kit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-104-075</td>
			<td>cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanosep MF centrifugal devices</td>
			<td>Pall laboratory</td>
			<td>ODM02C35</td>
			<td>oligo prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>No. 2 round glass coverslips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48382-085</td>
			<td>surface prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTA-SAM</td>
			<td>Dojindo Molecular Technologies</td>
			<td>N475-10</td>
			<td>surface prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P2 gel</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1504118</td>
			<td>oligo prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sufuric acid</td>
			<td>EMD Millipore Corporation</td>
			<td>SX1244-6</td>
			<td>surface prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-NHS acetate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>26777</td>
			<td>surface prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent AdvanceBio Oligonucleotide C18 column, 4.6 x 150 mm, 2.7 &#956;m</td>
			<td>653950-702</td>
			<td></td>
			<td>oligonucleotide preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barnstead Nanopure water purifying system</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td>water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFI Apo 100&#215; NA 1.49 objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy5 cube</td>
			<td>CHROMA</td>
			<td></td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>evolve electron multiplying charge coupled device (EMCCD)</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td></td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-performance liquid chromatography</td>
			<td>Agilent 1100</td>
			<td></td>
			<td>oligonucleotide preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intensilight epifluorescence source</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometer (MALDI-TOF-MS)</td>
			<td>Voyager STR</td>
			<td></td>
			<td>oligonucleotide preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td>oligonucleotide preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ti inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Perfect Focus System</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>quad band TIRF 405/488/561/647 cube</td>
			<td>CHROMA</td>
			<td></td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RICM cube</td>
			<td>CHROMA</td>
			<td></td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TIRF launcher with 488 nm (50 mW), 561 nm (50 mW), and 640 nm</td>
			<td>Coherent</td>
			<td></td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRITC cube</td>
			<td>CHROMA</td>
			<td></td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligo name</td>
			<td>5&#39; modification / 3&#39; modification</td>
			<td>sequence (5&#39; to 3&#39;)</td>
			<td>Use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15mer amine locking strand</td>
			<td>5&#39; modification: no modification 
			3&#39; modification: /3AmMO/</td>
			<td>AAA AAA CAT TTA TAC CCT ACC TA</td>
			<td>locking real-time tension signal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15mer Atto647N locking strand</td>
			<td>5&#39; modification: Atto647N 
			3&#39; modification: /3AmMO/</td>
			<td>AAA AAA CAT TTA TAC CCT ACC TA</td>
			<td>locking real-time tension signal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15mer non-fluoresccent locking strand</td>
			<td>5&#39; modification: no modification 
			3&#39; modification: no modification</td>
			<td>A AAA AAC ATT TAT AC</td>
			<td>locking real-time tension signal for quantitative analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4.7 pN hairpin strand</td>
			<td>5&#39; modification: no modification 
			3&#39; modification: no modification</td>
			<td>GTGAAATACCGCACAGATGCGT 
 TTGTATAAATGTTTTTTTCATTTAT 
 ACTTTAAGAGCGCCACGTAGCC 
CAGC</td>
			<td>hairpin probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>amine ligand strand</td>
			<td>5&#39; modification: /5AmMC6/ 
			3&#39; modification: /3Bio/</td>
			<td>CGCATCTGTGCG GTA TTT CAC TTT</td>
			<td>hairpin probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BHQ2 anchor strand</td>
			<td>5&#39; modification: /5ThiolMC6-D/ 
			3&#39; modification: /3BHQ_2/</td>
			<td>TTTGCTGGGCTACGTGGCGCTCTT</td>
			<td>&#160;&#160;&#160;hairpin probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3B ligand strand</td>
			<td>5&#39; modification: Cy3B 
			3&#39; modification: /3Bio/</td>
			<td>CGCATCTGTGCG GTA TTT CAC TTT</td>
			<td>hairpin probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>unlocking strand</td>
			<td>5&#39; modification: no modification 
			3&#39; modification: no modification</td>
			<td>TAG GTA GGG TAT AAA TGT TTT TTT C</td>
			<td>unlocking accumulated tension signal</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dna tension probes to map the transient piconewton receptor forces by immune cells

Mechanische Kräfte, die an der Verbindungsstelle zwischen zwei benachbarten Zellen und an der Verbindungsstelle zwischen Zellen und der extrazellulären Matrix übertragen werden, sind entscheidend für die Regulierung vieler Prozesse, die von der Entwicklung bis zur Immunologie reichen. Daher ist es von entscheidender Bedeutung, die Werkzeuge zu entwickeln, um diese Kräfte auf molekularer Ebene zu untersuchen. Unsere Gruppe entwickelte eine Reihe von molekularen Spannungssensoren, um die von Zellen erzeugten und auf bestimmte Liganden übertragenen Kräfte zu quantifizieren und zu visualisieren. Die empfindlichste Klasse von molekularen Spannungssensoren besteht aus Nukleinsäure-Stammschleifen-Haarnadeln. Diese Sensoren verwenden Fluorophor-Quencher-Paare, um die mechanische Dehnung und Entfaltung von DNA-Haarnadeln unter Krafteinwirkung zu melden. Eine Herausforderung bei DNA-Hairpin-Spannungssensoren besteht darin, dass sie reversibel sind, wobei die Hairpin-Spannung beim Beenden der Spannung schnell zurückgefaltet werden kann und somit transiente Kräfte schwer zu erfassen sind. In diesem Artikel beschreiben wir die Protokolle zur Herstellung von DNA-Spannungssensoren, die "verriegelt" und am erneuten Falten gehindert werden können, um das "Speichern" mechanischer Informationen zu ermöglichen. Dies ermöglicht die Aufzeichnung von hochtransienten Piconewton-Kräften, die anschließend durch die Zugabe komplementärer Nukleinsäuren, die die Sperre entfernen, "gelöscht" werden können. Diese Fähigkeit, zwischen Echtzeit-Spannungsmapping und mechanischer Informationsspeicherung umzuschalten, offenbart schwache, kurzlebige und weniger reichlich vorhandene Kräfte, die von T-Zellen üblicherweise als Teil ihrer Immunfunktionen eingesetzt werden.

Hier zeigen wir repräsentative Bilder zur Kontrolle der Oberflächenqualität (Abbildung 4). Eine hochwertige Oberfläche sollte einen sauberen Hintergrund im RICM-Kanal (Abbildung 4B) und eine gleichmäßige Fluoreszenzintensität im Cy3B-Kanal (Abbildung 4C) aufweisen. Bei gleichen bildgebenden Geräten und identischen Aufnahmebedingungen für die Fluoreszenzbildgebung sollte die Hintergrundfluoreszenzintensität bei der Durchfü...

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DNA Tension Probes to Map the Transient Piconewton Receptor Forces by Immune Cells

In dieser Arbeit wird ein detailliertes Protokoll für die Verwendung von DNA-basierten Spannungssonden beschrieben, um die von Immunzellen ausgeübten Rezeptorkräfte abzubilden. Dieser Ansatz kann Rezeptorkräfte >4,7 pN in Echtzeit abbilden und Kräfte über die Zeit integrieren.

DNA-Spannungssonden zur Kartierung der transienten Piconewton-Rezeptor-Kräfte durch Immunzellen

Mechanical forces transmitted at the junction between two neighboring cells and at the junction between cells and the extracellular matrix are critical ...

Dieses Protokoll bietet eine Methode, um die molekularen Kräfte abzubilden, die von Zellen und insbesondere von Immunzellen erzeugt werden. Das Protokoll ist von entscheidender Bedeutung für Labore, die an der Untersuchung der Mechanotransduktion in der Mechanobiologie interessiert sind. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie sehr einfach ist und es ermöglicht, die konventionelle Fluoreszenzmikroskopie zu verwenden, um die Kraftübertragung in immortalisierten und primären Zellen zu quantifizieren.Legen Sie zunächst 25-Millimeter-Deckgläser in ein Polytetrafluorethylen-Gestell in einem 50-Milliliter-Becherglas und spülen Sie die Deckgläser dreimal ab, indem Sie sie in Wasser tauchen. Mischen Sie Ethanol und Wasser zu gleichen Teilen und geben Sie 40 Milliliter dieser Lösung in das Becherglas mit dem Gestell und den Deckgläsern. Verschließen Sie dann das Becherglas mit Parafilmband.Reinigen Sie die Deckgläser, indem Sie das Becherglas 15 Minuten lang in einem Ultraschallreiniger beschallen und die Flüssigkeit nach der Beschallung entsorgen. Spülen Sie dann das Becherglas mit dem Rost und den Deckgläsern mindestens sechsmal mit Wasser aus, um verbleibende organische Lösungsmittel zu entfernen. Um eine frische Piranha-Lösung zuzubereiten, geben Sie 30 Milliliter Schwefelsäure in ein 50-Milliliter-Becherglas und fügen Sie langsam 10 Milliliter Wasserstoffperoxid hinzu.Mischen Sie die Piranha-Lösung vorsichtig mit dem Ende einer Glaspipette. Um mit dem Ätzen zu beginnen, geben Sie das Gestell mit den Deckgläsern in das Becherglas mit der Piranha-Lösung und inkubieren Sie es 30 Minuten lang bei Raumtemperatur, um die Deckgläser zu reinigen und zu hydroxylieren. Übertragen Sie dann das Gestell mit einer Pinzette aus Stahl oder Polytetrafluorethylen in ein sauberes 50-Milliliter-Becherglas und spülen Sie es sechsmal mit Wasser ab.Um das Wasser vollständig zu entfernen, tauchen Sie das Gestell mit den Deckgläsern in ein 50-Milliliter-Becherglas mit 40 Milliliter Ethanol. Entsorgen Sie dann das Ethanol. Tauchen Sie das Gestell anschließend eine Stunde lang bei Raumtemperatur in 40 Milliliter Ethanol mit 3 % Aminopropyltriethoxysilan, um die Reaktion mit der Hydroxylgruppe auf den Deckgläsern einzuleiten.Spülen Sie die Oberfläche der Deckgläser sechsmal ab, indem Sie sie in 40 Milliliter Ethanol tauchen, und trocknen Sie sie 20 Minuten lang in einem Ofen bei 80 Grad Celsius. Decken Sie den inneren Boden der Petrischale mit einem Parafilmband ab, um zu verhindern, dass die Deckgläser in die Petrischale rutschen. Legen Sie dann die aminbedeckten Deckgläser mit der zu funktionalisierenden Seite mit DNA-Zugsonden nach oben.Decken Sie die Deckgläser für die spätere Verwendung bei 20 Grad Celsius ab. Um die Amingruppen auf den Deckgläsern zu modifizieren, fügen Sie Liponsäure PEG NHS und mPEG NHS hinzu und inkubieren Sie die Petrischale eine Stunde lang bei Raumtemperatur. Spülen Sie die Oberfläche am Ende der Inkubation dreimal mit Wasser ab.Danach werden 100 Mikroliter 0,1 molaren Natriumbicarbonat, das ein Milligramm pro Milliliter Sulfo-NHS-Acetat enthält, in einen Satz Sandwichdeckgläser gegeben und 30 Minuten lang inkubiert, damit die Passivierung stattfinden kann. Geben Sie 0,5 Milliliter Goldnanopartikel in jedes Deckglas und inkubieren Sie es 30 Minuten lang bei Raumtemperatur. Spülen Sie die Deckgläser nach der Inkubation dreimal mit Wasser ab.Nachdem Sie Black Hole Quencher 2-Strang im Verhältnis zehn zu eins in die getemperte DNA-Zugsonde gegeben haben, fügen Sie 100 Mikroliter der Mischung pro zwei Deckgläser hinzu, um das Sandwich herzustellen. Legen Sie vorsichtig eine nasse Labortaschentuchkugel in die Petrischale, weg von den Deckgläsern, und verschließen Sie die Schale mit Parafilmklebeband, um ein Austrocknen der Lösung zu verhindern. Danach die Schüssel mit einer Folie abdecken und über Nacht bei vier Grad Celsius inkubieren.Montieren Sie am nächsten Tag die Bildgebungskammer und achten Sie darauf, dass beim Festziehen der Kammer keine Oberflächenrisse entstehen. Geben Sie dann 0,5 bis einen Milliliter Hank's Balanced Salt Solution in die Bildgebungskammer. Verwenden Sie den Cy3B-Kanal mit einem 100-fachen Objektiv, um Fluoreszenzsignale von Zellen zu erfassen, die auf die DNA-Haarnadel-Spannungssonden aufgetragen werden, wenn sie sich auszubreiten beginnen.Nach der Herstellung von 100 nicht fluoreszierenden microMolaren Locking-Strang-Material wird es zum gewünschten Zeitpunkt in einer Endkonzentration von einem microMolar in der Bildgebungskammer zu den Zellen gegeben, um das Spannungssignal zu speichern, und es durch Pipettieren mit den Zellen mischen. Nach etwa 10 Minuten Sperre können Sie Zeitrafferfilme oder Endpunktbilder in Epifluoreszenz sowohl für die qualitative Spannungskartierung als auch für die quantitative Analyse aufnehmen. Eine gelungene Oberfläche hatte eine blassrosa Farbe.Die hohe Qualität der Oberfläche wurde mit einem sauberen Untergrund und der Reflexionsinterferenzkontrastmikroskopie bzw. dem RICM-Kanal und einer gleichmäßigen Fluoreszenzintensität im Cy3B-Kanal demonstriert. Zeitrafferbilder der Spannungsverriegelung zeigten, dass sowohl TCR-Anti-CD3-Epsilon- als auch TCR-Peptid-MHC-Spannungssignale aufgrund von Hairpin-Locking und Signalakkumulation verstärkt wurden. Der Verriegelungsstrang zeichnete kurzlebige mechanische Zugereignisse des TCR-Peptids MHCN4 ab null Minuten auf, was die quantitative Analyse erleichterte und das eindeutige Muster der TCR-Peptid-MHC-Kraft aufdeckte, das dem Bullseye-Muster von Immunsynapsen ähnelte.Jeder Schritt bei der Vorbereitung des Substrats erfordert Liebe zum Detail und einen sorgfältigen Umgang mit den Materialien. Diese Technologie ermöglicht die Visualisierung von transienten molekularen Kräften, die an der Zelloberfläche auftreten, wenn sie mit der Umgebung interagiert, insbesondere in den Immunzellen auf der Suche nach Antigene.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Attaching Biological Probes to Silica Optical Biosensors Using Silane Coupling Agents

Anbringen biologischen Sonden zur Silica Optische Biosensoren Mit Silane Coupling Agents

In order to interface with biological environments, biosensor platforms, such as the popular Biacore system (based on the Surface Plasmon Resonance (SPR) ...

Forschung

Biotechnik

Measurement of Tension Release During Laser Induced Axon Lesion to Evaluate Axonal Adhesion to the Substrate at Piconewton and Millisecond Resolution

Messung der Spannungsstifte Während Laser Induced Axon Läsion Axonal Haftung auf dem Substrat und auswerten zu Pikonewton Millisekundenauflösung

The formation of functional connections in a developing neuronal network is influenced by extrinsic cues. The neurite growth of developing neurons is ...

Insertion of Flexible Neural Probes Using Rigid Stiffeners Attached with Biodissolvable Adhesive

Einfügen von Flexible Neural Sonden mit starren Versteifungen Biodissolvable mit Klebstoff befestigt

Microelectrode  arrays for neural interface devices that are made of biocompatible thin-film  polymer are expected to have extended functional lifetime ...

Generation of Shear Adhesion Map Using SynVivo Synthetic Microvascular Networks

Erzeugung von Scherhaft Karte Mit SynVivo Synthetische mikrovaskuläre Networks

Cell/particle adhesion assays are critical to understanding the biochemical interactions involved in disease pathophysiology and have important ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Hochauflösende Räumlich-zeitliche Analyse der Rezeptordynamik von Einzelmolekül-Fluoreszenzmikroskopie

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

Studying the Stoichiometry of Epidermal Growth Factor Receptor in Intact Cells using Correlative Microscopy

Studieren der Stöchiometrie der Epidermal Growth Factor Receptor in intakten Zellen mit korrelative Mikroskopie

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative fluorescence ...

An Experimental Protocol for Assessing the Performance of New Ultrasound Probes Based on CMUT Technology in Application to Brain Imaging

Ein experimentelles Protokoll zur Bewertung der Leistung des neuen Ultraschallsonden basierend auf CMUT Technologie in Anwendung auf die Bildgebung des Gehirns

The possibility to perform an early and repeatable assessment of imaging performance is fundamental in the design and development process of new ...

Probing the Roles of Physical Forces in Early Chick Embryonic Morphogenesis

Die Rollen der physikalischen Kräfte in frühen Küken embryonalen Morphogenese sondieren

Embryonic development is traditionally studied from the perspective of biomolecular genetics, but the fundamental importance of mechanics in morphogenesis ...

Imaging Integrin Tension and Cellular Force at Submicron Resolution with an Integrative Tension Sensor

Imaging-Integrin Spannung und zelluläre Kraft mit Submicron-Auflösung mit einem integrativen Spannung Sensor

Molecular tension transmitted by integrin-ligand bonds is the fundamental mechanical signal in the integrin pathway that plays significant roles in many ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Einzelzellige optische Aktionspotentialmessung in human induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...