Name: dna tension probes to map the transient piconewton receptor forces by immune cells
Uploaded: 2021-03-20T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about DNA Tension Probes to Map the Transient Piconewton Receptor Forces by Immune Cells at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי מענקי NIH R01GM131099, NIH R01GM124472 ו- NSF CAREER 1350829. אנו מודים למתקן טטרמר NIH עבור ליגנדות pMHC. מחקר זה נתמך, בחלקו, על ידי Emory Comprehensive Glycomics Core.

העכברים הטרנסגניים OT-1 שוכנים במתקן המחלקה למשאבי בעלי חיים באוניברסיטת אמורי. כל הניסויים אושרו ובוצעו תחת פרוטוקול הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC).
1. הכנת אוליגונוקלאוטיד
<ol><li>להמיס את הדנ"א של גדיל הליגנד במים (התנגדות של 18.2 MΩ, בשימוש לאורך כל הפרוטוקול). מע?...

<ol>
	<li>Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+activation+through+immunological+synapses+and+kinapses.">T-cell activation through immunological synapses and kinapses.</a> Immunological Reviews. 221 (1), 77-89 (2008).</li><li>Spillane, K. M., Tolar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+cell+antigen+extraction+is+regulated+by+physical+properties+of+antigen-presenting+cells.">B cell antigen extraction is regulated by physical properties of antigen-presenting cells.</a> Journal of Cell Biology. 216 (1), 217-230 (2017).</li><li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanosensing+drives+acuity+of+&#945;&#946;+T-cell+recognition.">Mechanosensing drives acuity of &#945;&#946; T-cell recognition.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (39), 8204-8213 (2017).</li><li>Hong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+TCR+mechanotransduction+signaling+loop+induces+negative+selection+in+the+thymus.">A TCR mechanotransduction signaling loop induces negative selection in the thymus.</a> Nature Immunology. 19 (12), 1379-1390 (2018).</li><li>Basu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxic+T+cells+use+mechanical+force+to+potentiate+target+cell+killing.">Cytotoxic T cells use mechanical force to potentiate target cell killing.</a> Cell. 165 (1), 100-110 (2016).</li><li>Bashour, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD28+and+CD3+have+complementary+roles+in+T-cell+traction+forces.">CD28 and CD3 have complementary roles in T-cell traction forces.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (6), 2241-2246 (2014).</li><li>Ma, V. P. Y., Salaita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+nanotechnology+as+an+emerging+tool+to+study+mechanotransduction+in+living+systems.">DNA nanotechnology as an emerging tool to study mechanotransduction in living systems.</a> Small. 15 (26), 1900961 (2019).</li><li>Liu, Y., Yehl, K., Narui, Y., Salaita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tension+sensing+nanoparticles+for+mechano-imaging+at+the+living/nonliving+interface.">Tension sensing nanoparticles for mechano-imaging at the living/nonliving interface.</a> Journal of the American Chemical Society. 135 (14), 5320-5323 (2013).</li><li>Glazier, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+mechanotechnology+reveals+that+integrin+receptors+apply+pN+forces+in+podosomes+on+fluid+substrates.">DNA mechanotechnology reveals that integrin receptors apply pN forces in podosomes on fluid substrates.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-13 (2019).</li><li>Galior, K., Liu, Y., Yehl, K., Vivek, S., Salaita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Titin-based+nanoparticle+tension+sensors+map+high-magnitude+integrin+forces+within+focal+adhesions.">Titin-based nanoparticle tension sensors map high-magnitude integrin forces within focal adhesions.</a> Nano Letters. 16 (1), 341-348 (2016).</li><li>Zhang, Y., Ge, C., Zhu, C., Salaita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-based+digital+tension+probes+reveal+integrin+forces+during+early+cell+adhesion.">DNA-based digital tension probes reveal integrin forces during early cell adhesion.</a> Nature Communications. 5, 5167 (2014).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-based+nanoparticle+tension+sensors+reveal+that+T-cell+receptors+transmit+defined+pN+forces+to+their+antigens+for+enhanced+fidelity.">DNA-based nanoparticle tension sensors reveal that T-cell receptors transmit defined pN forces to their antigens for enhanced fidelity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (20), 5610-5615 (2016).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+integrins+exhibit+anisotropic+mechanosensing+and+harness+piconewton+forces+to+mediate+platelet+aggregation.">Platelet integrins exhibit anisotropic mechanosensing and harness piconewton forces to mediate platelet aggregation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (2), 325-330 (2018).</li><li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+kinetics+of+two-dimensional+TCR+and+pMHC+interactions+determine+T-cell+responsiveness.">The kinetics of two-dimensional TCR and pMHC interactions determine T-cell responsiveness.</a> Nature. 464 (7290), 932-936 (2010).</li><li>Ma, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+probes+that+store+mechanical+information+reveal+transient+piconewton+forces+applied+by+T+cells.">DNA probes that store mechanical information reveal transient piconewton forces applied by T cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (34), 16949-16954 (2019).</li><li>Hui, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+costimulatory+receptor+CD28+is+a+primary+target+for+PD-1-mediated+inhibition.">T cell costimulatory receptor CD28 is a primary target for PD-1-mediated inhibition.</a> Science. 355 (6332), 1428-1433 (2017).</li><li>Whitley, K. D., Comstock, M. J., Chemla, Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elasticity+of+the+transition+state+for+oligonucleotide+hybridization.">Elasticity of the transition state for oligonucleotide hybridization.</a> Nucleic Acids Research. 45 (2), 547-555 (2016).</li><li>Brockman, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+super-resolved+PAINT+imaging+of+piconewton+cellular+traction+forces.">Live-cell super-resolved PAINT imaging of piconewton cellular traction forces.</a> Nature Methods. 17 (10), 1018-1024 (2020).</li></ol>

בעזרת ההליכים המפורטים המובאים כאן, ניתן להכין מצעי בדיקת מתח של DNA כדי למפות ולכמת את מתח הקולטן המיוצר על ידי תאי מערכת החיסון. כאשר תאים מצופים על מצע בדיקת המתח של סיכת השיער של הדנ"א, הם נוחתים, מתחברים ומתפשטים כאשר הקולטנים חשים את הליגנדות הן מבחינה כימית והן מבחינה מכנית, האחרונה שב?...

תאי מערכת החיסון מתגוננים מפני פתוגנים ותאים סרטניים על ידי זחילה וסריקה מתמדת של פני השטח של תאי המטרה לאיתור אנטיגנים, תוך שהם חוצבים את פני השטח שלהם 1,2. זיהוי אנטיגן מתחיל עם קשירה בין קולטן תאי T (TCR) לבין קומפלקס היסטותאימות פפטידי-מרכזי MHC (pMHC) המתבטא על פני השטח של תאי המטרה. מכיוון שזיהוי TCR-pMHC מתרחש בצומת בין שני תאים ניידים, הוא נחשד זה מכבר כבעל כוחות מכניים. יתר על כן, זה הוביל למודל mechanosensor של הפעלת TCR, אשר מציע כי כוחות TCR לתרום לתפקוד שלה 3,4. כדי להבין מתי, היכן וכיצד כוחות מכניים תורמים לתפקוד תאי T, הכרחי לפתח כלים להמחשת הכוחות המולקולריים המועברים על ידי תאי T. באופן מסורתי, שיטות כגון מיקרוסקופ כוח משיכה (TFM) ומערכי מיקרו-עמודים משמשים לחקר כוחות תאיים 5,6. עם זאת, רגישות הכוח של TFM ומערכי מיקרו-עמודים היא בקנה מידה של ננוניוטון (nN) ולכן לעתים קרובות אינה מספיקה כדי לחקור את כוחות הפיקוניוטון המולקולרי (pN) המועברים על ידי קולטני התא7. כדי לשפר את הכוח ואת הרזולוציה המרחבית לגילוי, המעבדה שלנו הייתה חלוצה בפיתוח של בדיקות מתח מולקולרי, אשר סונתזו בתחילה באמצעות פולימרים פוליאתילן גליקול (PEG)7. גשושיות מתח מולקולרי מורכבות מ"קפיץ" מולקולרי ניתן להארכה (PEG, חלבון, DNA) שמשני צדדיו פלואורופור ומרווה ומעוגנות על משטח. כוחות המופעלים על קצה הגשושית מובילים להתרחבותה, מפרידים בין הפלואורופור למרווה, וכך יוצרים אות פלואורסצנטי חזק (איור 1A)8,9,10.
במהלך העשור האחרון פיתחנו ספרייה של סוגים שונים של גשושיות מתח מולקולרי עם יסודות קפיציים העשויים מחומצות גרעין11, חלבונים10 ופולימרים8. מבין אלה, בדיקות המתח מבוססות ה- DNA מספקות את יחס האות לרעש הגבוה ביותר ואת רגישות הכוח הגדולה ביותר, אשר מכווננת בקלות מכמה pN עד ~ 20 pN11. השתמשנו בבדיקות מתח דנ"א בזמן אמת כדי לחקור את הכוחות המולקולריים הנוצרים על-ידי סוגי תאים רבים ומגוונים, כולל פיברובלסטים, תאים סרטניים, טסיות דם ותאי מערכת החיסון11,12,13. כתב יד זה יתאר פרוטוקולים לסנתז ולהרכיב גשושיות מתח DNA על משטח כדי למפות כוחות קולטן מולקולרי ברזולוציית כוח pN באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי קונבנציונלי. בעוד שההליך הנוכחי כולל שינויים כימיים בחומצת הגרעין כדי להציג את כתב הפלואורסצנט (איור 1B), חשוב לציין שרבים משלבי השינוי והטיהור יכולים להיות במיקור חוץ לחברות סינתזת דנ"א מותאמות אישית. לכן, טכנולוגיית בדיקות מתח הדנ"א היא קלה, ונגישה לקהילות רחבות יותר של ביולוגיה של התא ומכנוביולוגיה.
בקצרה, כדי להרכיב חיישני מתח דנ"א, סיכת ראש של דנ"א עוברת הכלאה לגדיל ליגנד פלואורסצנטי על זרוע אחת וגדיל עוגן מרווה על הזרוע השנייה, ואז משותקת על מצע זכוכית (איור 1C, מתח בזמן אמת). בהיעדר כוח מכני, סיכת הראש סגורה, וכך הפלואורסצנטיות מרווה. עם זאת, כאשר הכוח המכני המופעל גדול מה-F1/2 (הכוח בשיווי משקל שמוביל להסתברות של 50% להתגלות), סיכת הראש נמסה מכנית, ונוצר אות פלואורסצנטי.
בהתבסס על חיישן מתח דנ"א בזמן אמת, אנו גם מתארים פרוטוקולים למיפוי כוחות מצטברים, דבר שימושי במיוחד לחקר אינטראקציות בין קולטנים על תאי מערכת החיסון לבין הליגנד הטבעי שלהם. הסיבה לכך היא שקולטנים חיסוניים מציגים לעתים קרובות קשרים קצרי מועד 3,14. הכוחות המצטברים מצולמים באמצעות גדיל "נעילה" שנקשר באופן מועדף לסיכות ראש פתוחות של דנ"א ומאפשר אחסון של אותות פלואורסצנטיים הקשורים לאירועי משיכה מכניים (איור 1C, מתח נעול). גדיל הנעילה נועד לקשור אתר קשירה מסתורי שנחשף עם התכה מכנית של סיכת הראש ולנעול את סיכת השיער במצב פתוח על ידי חסימת קיפול מחדש של סיכת השיער, ובכך לאחסן את אות המתח, וליצור מפת מתח מצטברת. יתר על כן, גדיל הנעילה מתוכנן עם אחיזת אצבע בעלת שמונה נוקלאוטידים, המאפשרת תגובת תזוזה של גדיל בתיווך הבוהן עם המשלים המלא שלו, גדיל ה"נעילה". עם הוספת גדיל הנעילה, גדיל הנעילה הכבול מוסר ממבנה סיכת השיער, מוחק את אות המתח המאוחסן ומאפס את סיכת הראש בחזרה למצב בזמן אמת.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62348/62348fig01.jpg"> איור 1: סכמה של גשושיות המתח המולקולרי החדישות. (A) תכנון כללי של גשושית מתח מולקולרית בזמן אמת, (B) גדילים למבנה גשושית מתח מבוססת DNA, ו-(C) גשושיות מתח מהונדסות-מבוססות DNA והמעבר שלהן בין מצב בזמן אמת למצב נעול. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62348/62348fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
הפרוטוקול העיקרי מורכב מארבעה חלקים עיקריים - הכנת אוליגונוקלאוטידים, הכנת פני שטח, הדמיה וניתוח נתונים. פרוטוקול זה הודגם בהצלחה על ידי המעבדה שלנו ואחרים בתאי T נאיביים ומופעלים OT-1 CD8+, תאי OT-II CD4+, כמו גם היברידיות, וניתן ליישם אותו כדי לחקור קולטנים שונים של תאי מערכת החיסון, כולל קולטן תאי T, קולטן מוות תאי מתוכנת (PD1) וכוחות אנטיגן 1 הקשורים לתפקוד לימפוציטים (LFA-1). תאי T נאיביים OT-1 CD8+ משמשים כקו תאים לדוגמה במאמר זה.

<table fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#160;3-hydroxypicolinic acid (3-HPA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>56197</td>
			<td>maldi-TOF-MS matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;mPEG-SC</td>
			<td>Biochempeg</td>
			<td>MF001023-2K</td>
			<td>surface prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(3-Aminopropyl)triethoxysilane</td>
			<td>Acros</td>
			<td>AC430941000</td>
			<td>surface prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Red blood cell lysis buffer</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>00-4333-57</td>
			<td>buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8.8 nm gold nanoparticles, tannic acid</td>
			<td>Nanocomposix</td>
			<td>customized order</td>
			<td>surface prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atto647N NHS ester</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>18373-1MG-F</td>
			<td>fluorophore, oligo prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attofluor Cell Chamber, for microscopy</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A7816</td>
			<td>imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Syringes only with Luer-Lok</td>
			<td>BD bioscience</td>
			<td>309657</td>
			<td>cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>biotinylated anti-mouse CD3e</td>
			<td>ebioscience</td>
			<td>13-0031-82</td>
			<td>antibody/ligand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated pMHC ovalbumin (SIINFEKL)</td>
			<td>NIH Tetramer Core Facility at Emory University</td>
			<td>NA</td>
			<td>antibody/ligand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>735078001</td>
			<td>block non-specific interactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainers</td>
			<td>Biologix</td>
			<td>15-1100</td>
			<td>cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip Mini-Rack, teflon</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C14784</td>
			<td>surface prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3B NHS ester</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>PA63101</td>
			<td>fluorophore, oligo prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CM</td>
			<td>buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>459836</td>
			<td>surface prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s balanced salts (HBSS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H8264</td>
			<td>buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hydrogen peroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H1009</td>
			<td>surface prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LA-PEG-SC</td>
			<td>Biochempeg</td>
			<td>HE039023-3.4K</td>
			<td>surface prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Midi MACS (LS) startup kit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-301</td>
			<td>cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse CD8+ T cell isolation kit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-104-075</td>
			<td>cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanosep MF centrifugal devices</td>
			<td>Pall laboratory</td>
			<td>ODM02C35</td>
			<td>oligo prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>No. 2 round glass coverslips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48382-085</td>
			<td>surface prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTA-SAM</td>
			<td>Dojindo Molecular Technologies</td>
			<td>N475-10</td>
			<td>surface prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P2 gel</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1504118</td>
			<td>oligo prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sufuric acid</td>
			<td>EMD Millipore Corporation</td>
			<td>SX1244-6</td>
			<td>surface prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-NHS acetate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>26777</td>
			<td>surface prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent AdvanceBio Oligonucleotide C18 column, 4.6 x 150 mm, 2.7 &#956;m</td>
			<td>653950-702</td>
			<td></td>
			<td>oligonucleotide preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barnstead Nanopure water purifying system</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td>water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFI Apo 100&#215; NA 1.49 objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy5 cube</td>
			<td>CHROMA</td>
			<td></td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>evolve electron multiplying charge coupled device (EMCCD)</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td></td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-performance liquid chromatography</td>
			<td>Agilent 1100</td>
			<td></td>
			<td>oligonucleotide preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intensilight epifluorescence source</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometer (MALDI-TOF-MS)</td>
			<td>Voyager STR</td>
			<td></td>
			<td>oligonucleotide preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td>oligonucleotide preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ti inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Perfect Focus System</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>quad band TIRF 405/488/561/647 cube</td>
			<td>CHROMA</td>
			<td></td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RICM cube</td>
			<td>CHROMA</td>
			<td></td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TIRF launcher with 488 nm (50 mW), 561 nm (50 mW), and 640 nm</td>
			<td>Coherent</td>
			<td></td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRITC cube</td>
			<td>CHROMA</td>
			<td></td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligo name</td>
			<td>5&#39; modification / 3&#39; modification</td>
			<td>sequence (5&#39; to 3&#39;)</td>
			<td>Use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15mer amine locking strand</td>
			<td>5&#39; modification: no modification 
			3&#39; modification: /3AmMO/</td>
			<td>AAA AAA CAT TTA TAC CCT ACC TA</td>
			<td>locking real-time tension signal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15mer Atto647N locking strand</td>
			<td>5&#39; modification: Atto647N 
			3&#39; modification: /3AmMO/</td>
			<td>AAA AAA CAT TTA TAC CCT ACC TA</td>
			<td>locking real-time tension signal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15mer non-fluoresccent locking strand</td>
			<td>5&#39; modification: no modification 
			3&#39; modification: no modification</td>
			<td>A AAA AAC ATT TAT AC</td>
			<td>locking real-time tension signal for quantitative analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4.7 pN hairpin strand</td>
			<td>5&#39; modification: no modification 
			3&#39; modification: no modification</td>
			<td>GTGAAATACCGCACAGATGCGT 
 TTGTATAAATGTTTTTTTCATTTAT 
 ACTTTAAGAGCGCCACGTAGCC 
CAGC</td>
			<td>hairpin probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>amine ligand strand</td>
			<td>5&#39; modification: /5AmMC6/ 
			3&#39; modification: /3Bio/</td>
			<td>CGCATCTGTGCG GTA TTT CAC TTT</td>
			<td>hairpin probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BHQ2 anchor strand</td>
			<td>5&#39; modification: /5ThiolMC6-D/ 
			3&#39; modification: /3BHQ_2/</td>
			<td>TTTGCTGGGCTACGTGGCGCTCTT</td>
			<td>&#160;&#160;&#160;hairpin probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3B ligand strand</td>
			<td>5&#39; modification: Cy3B 
			3&#39; modification: /3Bio/</td>
			<td>CGCATCTGTGCG GTA TTT CAC TTT</td>
			<td>hairpin probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>unlocking strand</td>
			<td>5&#39; modification: no modification 
			3&#39; modification: no modification</td>
			<td>TAG GTA GGG TAT AAA TGT TTT TTT C</td>
			<td>unlocking accumulated tension signal</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dna tension probes to map the transient piconewton receptor forces by immune cells

כוחות מכניים המועברים בצומת שבין שני תאים שכנים ובצומת שבין התאים לבין המטריצה החוץ תאית הם קריטיים לוויסות תהליכים רבים, החל מהתפתחות ועד אימונולוגיה. לכן, פיתוח הכלים לחקר כוחות אלה בקנה מידה מולקולרי הוא קריטי. הקבוצה שלנו פיתחה חבילה של חיישני מתח מולקולרי כדי לכמת ולדמיין את הכוחות הנוצרים על ידי תאים ומועברים לליגנדות ספציפיות. הקבוצה הרגישה ביותר של חיישני מתח מולקולרי מורכבת מסיכות שיער של חומצת גרעין. חיישנים אלה משתמשים בזוגות פלואורופור-מרווה כדי לדווח על הארכה מכנית ופתיחה של סיכות שיער DNA תחת כוח. אחד האתגרים עם חיישני מתח של סיכות שיער DNA הוא שהם הפיכים עם קיפול מהיר של סיכת שיער עם סיום המתח ולכן קשה לתעד כוחות חולפים. במאמר זה נתאר את הפרוטוקולים להכנת חיישני מתח דנ"א שניתן "לנעול" ולמנוע קיפול מחדש כדי לאפשר "אחסון" של מידע מכני. זה מאפשר הקלטה של כוחות פיקוניוטון חולפים מאוד, אשר ניתן לאחר מכן "למחוק" על ידי תוספת של חומצות גרעין משלימות להסיר את המנעול. יכולת זו לעבור בין מיפוי מתח בזמן אמת לבין אחסון מידע מכני חושפת כוחות חלשים, קצרי מועד ופחות שופעים, המשמשים בדרך כלל תאי T כחלק מתפקודי מערכת החיסון שלהם.

כאן אנו מציגים תמונות מייצגות של בקרת איכות פני השטח (איור 4). משטח באיכות גבוהה צריך להיות בעל רקע נקי בערוץ RICM (איור 4B), ועוצמת פלואורסצנטיות אחידה בערוץ Cy3B (איור 4C). עם אותו ציוד הדמיה ותנאי רכישת דימות פלואורסצנטיים זהים, עוצמת פלואורסצנטיו...

Watch this Scientific Journal Video about DNA Tension Probes to Map the Transient Piconewton Receptor Forces by Immune Cells at JoVE.com

DNA Tension Probes to Map the Transient Piconewton Receptor Forces by Immune Cells

מאמר זה מתאר פרוטוקול מפורט לשימוש בבדיקות מתח מבוססות דנ"א כדי לדמות את כוחות הקולטן המופעלים על ידי תאי מערכת החיסון. גישה זו יכולה למפות כוחות קולטן >4.7pN בזמן אמת ויכולה לשלב כוחות לאורך זמן.

בדיקות מתח DNA כדי למפות את כוחות קולטן פיקוניוטון חולפים על ידי תאים חיסוניים

Mechanical forces transmitted at the junction between two neighboring cells and at the junction between cells and the extracellular matrix are critical ...

פרוטוקול זה מציע שיטה למיפוי הכוחות המולקולריים הנוצרים על ידי תאים ובמיוחד תאים חיסוניים. הפרוטוקול הוא קריטי למעבדות המעוניינות לחקור מכנוטרנסדוקציה במכנוביולוגיה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא קלה במיוחד ומאפשרת להשתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי קונבנציונלי כדי לכמת העברת כוח בתאים אימורטליים וראשוניים.כדי להתחיל, הניחו כיסויים בקוטר 25 מ"מ על מתלה פוליטטרה-פלואוראתילן בכוס של 50 מיליליטר ושטפו את הכיסויים שלוש פעמים על ידי טבילתם במים. מערבבים כמויות שוות של אתנול ומים ומוסיפים 40 מיליליטר של תמיסה זו לכוס המכילה את המתלה ואת הכיסויים. לאחר מכן, אטמו את הכד באמצעות סרט פרפילם.נקו את הכיסויים על ידי סוניקציה של הכד למשך 15 דקות בחומר ניקוי על-קולי והשליכו את הנוזל לאחר סוניקציה. לאחר מכן, שטפו את הכד המכיל את המתלה ומכסים אותו במים לפחות שש פעמים כדי להסיר את שאריות הממס האורגני. כדי להכין תמיסת פיראנה טרייה, להוסיף 30 מיליליטר של חומצה גופרתית לכוס 50 מיליליטר ולהוסיף לאט 10 מיליליטר של מי חמצן.מערבבים בעדינות את תמיסת הפיראנה בעזרת קצה פיפטה מזכוכית. כדי להתחיל בחריטה, העבירו את המדף המחזיק את הכיסויים לכוס המכילה תמיסת פיראנה ודגרו במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר כדי לנקות ולבצע הידרוקסילאט של החלקות הכיסוי. לאחר מכן, העבירו את המדף באמצעות פינצטה מפלדה או פוליטטרה-פלואוראתילן לכוס נקייה של 50 מיליליטר ושטפו במים שש פעמים.על מנת להסיר מים לחלוטין, לטבול את המתלה המחזיק את הכיסויים בכוס 50 מיליליטר עם 40 מיליליטר אתנול. לאחר מכן, השליכו את האתנול. לאחר מכן, לטבול את המדף 40 מיליליטר של אתנול המכיל 3% aminopropyltriethoxysilane במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר כדי להתחיל את התגובה עם קבוצת hydroxyl על הכיסויים.שוטפים את פני השטח של הכיסויים שש פעמים על ידי טבילתם ב -40 מיליליטר אתנול ומייבשים אותם בתנור ב 80 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. כסו את החלק התחתון הפנימי של צלחת הפטרי בסרט פרפילם כדי למנוע מהכיסויים להחליק לתוך צלחת הפטרי. לאחר מכן הניחו את הכיסויים המכוסים באמין עם הצד כדי לתפקד עם בדיקות מתח DNA הפונות כלפי מעלה.כסו את הכיסויים ב-20 מעלות צלזיוס לשימוש עתידי. כדי לשנות את קבוצות האמין על הכיסויים, הוסיפו חומצה ליפואית PEG NHS ו- mPEG NHS ודגרו על צלחת הפטרי בטמפרטורת החדר למשך שעה. בתום הדגירה שוטפים את פני השטח שלוש פעמים במים.לאחר מכן, להוסיף 100 מיקרוליטר של 0.1 סודיום ביקרבונט מולארי המכיל מיליגרם אחד למיליליטר של Sulfo-NHS-אצטט לקבוצה של כיסויי סנדוויץ' לדגור במשך 30 דקות עבור פסיבציה להתרחש. הוסיפו 0.5 מיליליטר של ננו-חלקיקי זהב לכל כיסוי ודגרו במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הדגירה, יש לשטוף את הכיסויים במים שלוש פעמים.לאחר הוספת גדיל Black Hole Quencher 2 לבדיקת מתח הדנ"א המחושלת ביחס של עשרה לאחד, הוסיפו 100 מיקרוליטר של התערובת לכל שני כיסויים כדי להכין את הכריך. הניחו בזהירות כדור רקמת מעבדה רטוב בצלחת הפטרי הרחק מהכיסויים ואטמו את הצלחת בסרט פרפילם כדי למנוע מהתמיסה להתייבש. לאחר מכן, מכסים את המנה בנייר כסף ודגרים עליה בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה.למחרת, הרכיבו את תא ההדמיה, תוך הקפדה על מניעת סדקים במשטח תוך הידוק החדר. לאחר מכן, הוסף 0.5 עד מיליליטר אחד של תמיסת המלח המאוזנת של האנק לתא ההדמיה. השתמש בערוץ Cy3B עם מטרה של 100X כדי ללכוד אותות פלואורסצנטיים של תאים המצופים על בדיקות המתח של סיכות השיער של הדנ"א כאשר הם מתחילים להתפשט.לאחר הכנת מלאי גדיל נעילה לא פלואורסצנטי של 100 מיקרו-מולארי, בנקודת הזמן הרצויה, הוסף אותו לתאים בריכוז סופי של מיקרומולר אחד בתא ההדמיה כדי לאחסן את אות המתח ולערבב אותו עם התאים על ידי פיפטציה. לאחר כ-10 דקות של נעילה, רכשו סרטים בהילוך מהיר או תמונות של נקודות קצה באפיפלואורסנציה הן למיפוי מתח איכותי והן לניתוח כמותי. משטח מוצלח היה בצבע ורוד חיוור.האיכות הגבוהה של פני השטח הודגמה עם רקע נקי ומיקרוסקופ ניגודיות הפרעות השתקפות או ערוץ RICM ועוצמת פלואורסצנטיות אחידה בערוץ Cy3B. תמונות בהילוך מהיר של נעילת מתח הצביעו על כך שגם אותות המתח TCR anti-CD3 epsilon וגם TCR-peptide-MHC הוגברו בגלל נעילת סיכות שיער והצטברות אותות. גדיל הנעילה תיעד אירועי משיכה מכניים קצרי מועד של פפטיד TCR MHCN4 החל מאפס דקות, מה שאפשר ניתוח כמותי וחשף את הדפוס המובהק של כוח MHC פפטיד TCR שדמה לדפוס בולזאיי של סינפסות חיסוניות.בכל שלב, הכנת מצע הבדיקה שלך דורשת תשומת לב לפרטים וטיפול זהיר בחומרים. טכנולוגיה זו מאפשרת הדמיה של כוחות מולקולריים חולפים המתרחשים על פני התא כאשר הוא מתקשר עם הסביבה, במיוחד בתאי החיסון בחיפוש אחר אנטיגנים.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Attaching Biological Probes to Silica Optical Biosensors Using Silane Coupling Agents

הוספת בדיקות ביולוגיות Biosensors סיליקה אופטי באמצעות סוכני צימוד silane

In order to interface with biological environments, biosensor platforms, such as the popular Biacore system (based on the Surface Plasmon Resonance (SPR) ...

Measurement of Tension Release During Laser Induced Axon Lesion to Evaluate Axonal Adhesion to the Substrate at Piconewton and Millisecond Resolution

מדידה לשחרר מתח בנגע לייזר מושרה אקסון להעריך הידבקות axonal למצע בpiconewton והאלפית השני רזולוציה

The formation of functional connections in a developing neuronal network is influenced by extrinsic cues. The neurite growth of developing neurons is ...

Insertion of Flexible Neural Probes Using Rigid Stiffeners Attached with Biodissolvable Adhesive

החדרת גמישה עצביות בדיקות באמצעות אלמנטים קשיחות קשיחים מצורפים עם Biodissolvable דבק

Microelectrode  arrays for neural interface devices that are made of biocompatible thin-film  polymer are expected to have extended functional lifetime ...

Generation of Shear Adhesion Map Using SynVivo Synthetic Microvascular Networks

דור של שאר הידבקות מפה באמצעות רשתות כלי הדם סינטטיים SynVivo

Cell/particle adhesion assays are critical to understanding the biochemical interactions involved in disease pathophysiology and have important ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

רזולוציה גבוהה ניתוח Spatiotemporal של קולטן Dynamics ידי המולקולה בודדת מיקרוסקופ פלואורסצנטי

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

Studying the Stoichiometry of Epidermal Growth Factor Receptor in Intact Cells using Correlative Microscopy

לומד את ההרכב של עוריות Growth Factor Receptor בתאים השלמים באמצעות מתאם מיקרוסקופית

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative fluorescence ...

An Experimental Protocol for Assessing the Performance of New Ultrasound Probes Based on CMUT Technology in Application to Brain Imaging

טיפול נסיוני הערכת הביצועים של הגששים סאונד חדש מבוסס על טכנולוגיית CMUT ביישום כדי הדמיה מוחית

The possibility to perform an early and repeatable assessment of imaging performance is fundamental in the design and development process of new ...

Probing the Roles of Physical Forces in Early Chick Embryonic Morphogenesis

בודק את התפקידים של הכוחות הפיזיקליים במערכת מורפוגנזה עובריים מוקדם של הבחורה

Embryonic development is traditionally studied from the perspective of biomolecular genetics, but the fundamental importance of mechanics in morphogenesis ...

Imaging Integrin Tension and Cellular Force at Submicron Resolution with an Integrative Tension Sensor

הדמיה אינטגרין מתח וכוח הסלולר ברזולוציה כחיוניים עם חיישן המתח אינטגרטיבית

Molecular tension transmitted by integrin-ligand bonds is the fundamental mechanical signal in the integrin pathway that plays significant roles in many ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

מדידה פוטנציאלית לפעולה אופטית חד-תאית בקרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע מושרים על ידי תאי גזע אנושיים

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...