Name: dna tension probes to map the transient piconewton receptor forces by immune cells
Uploaded: 2021-03-20T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about DNA Tension Probes to Map the Transient Piconewton Receptor Forces by Immune Cells at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av NIH Grants R01GM131099, NIH R01GM124472 og NSF CAREER 1350829. Vi takker NIH Tetramer Facility for pMHC-ligander. Denne studien ble delvis støttet av Emory Comprehensive Glycomics Core.

OT-1 transgene mus er plassert på Division of Animal Resources Facility ved Emory University. Alle forsøkene ble godkjent og utført under protokollen Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
1. Oligonukleotid forberedelse
<ol><li>Løs opp ligandstrengens DNA i vann (18,2 MΩ resistivitet, brukt gjennom hele protokollen). Vortex og spinn ned løsningen med en bordplate sentrifuge. Still inn vannvolumet slik at den endelige konsentrasjonen er 1 mM. Valider konsentrasjonen ved å...

<ol>
	<li>Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+activation+through+immunological+synapses+and+kinapses.">T-cell activation through immunological synapses and kinapses.</a> Immunological Reviews. 221 (1), 77-89 (2008).</li><li>Spillane, K. M., Tolar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+cell+antigen+extraction+is+regulated+by+physical+properties+of+antigen-presenting+cells.">B cell antigen extraction is regulated by physical properties of antigen-presenting cells.</a> Journal of Cell Biology. 216 (1), 217-230 (2017).</li><li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanosensing+drives+acuity+of+&#945;&#946;+T-cell+recognition.">Mechanosensing drives acuity of &#945;&#946; T-cell recognition.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (39), 8204-8213 (2017).</li><li>Hong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+TCR+mechanotransduction+signaling+loop+induces+negative+selection+in+the+thymus.">A TCR mechanotransduction signaling loop induces negative selection in the thymus.</a> Nature Immunology. 19 (12), 1379-1390 (2018).</li><li>Basu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxic+T+cells+use+mechanical+force+to+potentiate+target+cell+killing.">Cytotoxic T cells use mechanical force to potentiate target cell killing.</a> Cell. 165 (1), 100-110 (2016).</li><li>Bashour, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD28+and+CD3+have+complementary+roles+in+T-cell+traction+forces.">CD28 and CD3 have complementary roles in T-cell traction forces.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (6), 2241-2246 (2014).</li><li>Ma, V. P. Y., Salaita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+nanotechnology+as+an+emerging+tool+to+study+mechanotransduction+in+living+systems.">DNA nanotechnology as an emerging tool to study mechanotransduction in living systems.</a> Small. 15 (26), 1900961 (2019).</li><li>Liu, Y., Yehl, K., Narui, Y., Salaita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tension+sensing+nanoparticles+for+mechano-imaging+at+the+living/nonliving+interface.">Tension sensing nanoparticles for mechano-imaging at the living/nonliving interface.</a> Journal of the American Chemical Society. 135 (14), 5320-5323 (2013).</li><li>Glazier, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+mechanotechnology+reveals+that+integrin+receptors+apply+pN+forces+in+podosomes+on+fluid+substrates.">DNA mechanotechnology reveals that integrin receptors apply pN forces in podosomes on fluid substrates.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-13 (2019).</li><li>Galior, K., Liu, Y., Yehl, K., Vivek, S., Salaita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Titin-based+nanoparticle+tension+sensors+map+high-magnitude+integrin+forces+within+focal+adhesions.">Titin-based nanoparticle tension sensors map high-magnitude integrin forces within focal adhesions.</a> Nano Letters. 16 (1), 341-348 (2016).</li><li>Zhang, Y., Ge, C., Zhu, C., Salaita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-based+digital+tension+probes+reveal+integrin+forces+during+early+cell+adhesion.">DNA-based digital tension probes reveal integrin forces during early cell adhesion.</a> Nature Communications. 5, 5167 (2014).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-based+nanoparticle+tension+sensors+reveal+that+T-cell+receptors+transmit+defined+pN+forces+to+their+antigens+for+enhanced+fidelity.">DNA-based nanoparticle tension sensors reveal that T-cell receptors transmit defined pN forces to their antigens for enhanced fidelity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (20), 5610-5615 (2016).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+integrins+exhibit+anisotropic+mechanosensing+and+harness+piconewton+forces+to+mediate+platelet+aggregation.">Platelet integrins exhibit anisotropic mechanosensing and harness piconewton forces to mediate platelet aggregation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (2), 325-330 (2018).</li><li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+kinetics+of+two-dimensional+TCR+and+pMHC+interactions+determine+T-cell+responsiveness.">The kinetics of two-dimensional TCR and pMHC interactions determine T-cell responsiveness.</a> Nature. 464 (7290), 932-936 (2010).</li><li>Ma, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+probes+that+store+mechanical+information+reveal+transient+piconewton+forces+applied+by+T+cells.">DNA probes that store mechanical information reveal transient piconewton forces applied by T cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (34), 16949-16954 (2019).</li><li>Hui, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+costimulatory+receptor+CD28+is+a+primary+target+for+PD-1-mediated+inhibition.">T cell costimulatory receptor CD28 is a primary target for PD-1-mediated inhibition.</a> Science. 355 (6332), 1428-1433 (2017).</li><li>Whitley, K. D., Comstock, M. J., Chemla, Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elasticity+of+the+transition+state+for+oligonucleotide+hybridization.">Elasticity of the transition state for oligonucleotide hybridization.</a> Nucleic Acids Research. 45 (2), 547-555 (2016).</li><li>Brockman, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+super-resolved+PAINT+imaging+of+piconewton+cellular+traction+forces.">Live-cell super-resolved PAINT imaging of piconewton cellular traction forces.</a> Nature Methods. 17 (10), 1018-1024 (2020).</li></ol>

Med de detaljerte prosedyrene som er gitt her, kan man forberede DNA-hårnålsspenningssondesubstrater for å kartlegge og kvantifisere reseptorspenningen produsert av immunceller. Når celler blir belagt på DNA-hårnålsspenningssondesubstratet, lander, fester de seg og sprer seg når reseptorene sanser ligandene både kjemisk og mekanisk, hvorav sistnevnte oppdages av våre sonder. I noen tilfeller kan imidlertid celler mislykkes i å spre seg (Figur 7A) eller ikke produserer spenningssig...

Immunceller forsvarer seg mot patogener og kreftceller ved kontinuerlig å krype og skanne overflatene til målceller for antigener, og pigge overflaten 1,2. Antigengjenkjenning initieres ved binding mellom T-cellereseptoren (TCR) og peptid-major histokompatibilitetskomplekset MHC (pMHC) komplekset uttrykt på overflaten av målceller. Fordi TCR-pMHC-gjenkjenning skjer i krysset mellom to mobilceller, har det lenge vært mistanke om å oppleve mekaniske krefter. Videre førte dette til mekanosensormodellen for TCR-aktivering, noe som antyder at TCR-krefter bidrar til funksjonen 3,4. For å forstå når, hvor og hvordan mekaniske krefter bidrar til T-cellefunksjon, er det viktig å utvikle verktøy for å visualisere molekylære krefter som overføres av T-celler. Tradisjonelt brukes metoder som trekkraftmikroskopi (TFM) og mikropillararrays for å undersøke cellulære krefter 5,6. Imidlertid er kraftfølsomheten til TFM og mikropilarrayer på nanonewton (nN) -skalaen og er derfor ofte utilstrekkelig til å studere molekylære piconewton (pN) -krefter overført av cellereseptorer7. For å forbedre kraften og romlig oppløsning for deteksjon, var laboratoriet vårt banebrytende for utviklingen av molekylære spenningsprober, som opprinnelig ble syntetisert ved bruk av polyetylenglykol (PEG) polymerer7. Molekylære spenningsprober består av en utvidbar molekylær "fjær" (PEG, protein, DNA) flankert av en fluorofor og slukker og er forankret på en overflate. Krefter påført sondens endepunkt fører til dens forlengelse, separerer fluoroforen og slukkeren, og genererer dermed et sterkt fluorescenssignal (figur 1A) 8,9,10.
I løpet av det siste tiåret har vi utviklet et bibliotek med forskjellige klasser av molekylære spenningsprober med fjærelementer laget av nukleinsyrer11, proteiner10 og polymerer8. Blant disse gir de DNA-baserte spenningsprobene det høyeste signal-støyforholdet og den største kraftfølsomheten, som enkelt justeres fra noen få pN opp til ~20 pN11. Vi har brukt disse sanntids DNA-spenningsprobene til å studere molekylære krefter generert av mange forskjellige celletyper, inkludert fibroblaster, kreftceller, blodplater og immunceller11,12,13. Dette manuskriptet vil beskrive protokoller for å syntetisere og sette sammen DNA-spenningsprober på en overflate for å kartlegge molekylære reseptorkrefter med pN-kraftoppløsning ved hjelp av et konvensjonelt fluorescensmikroskop. Mens den nåværende prosedyren inkluderer kjemiske modifikasjoner av nukleinsyren for å introdusere fluorescerende reporter (figur 1B), er det viktig å merke seg at mange av modifikasjons- og rensetrinnene kan outsources til tilpassede DNA-syntesefirmaer. Derfor er DNA-spenningssondeteknologien lett og tilgjengelig for de bredere cellebiologi- og mekanobiologimiljøene.
Kort sagt, for å montere DNA-spenningssensorer, hybridiseres en DNA-hårnål til en fluorescerende ligandstreng på den ene armen og en slukkeankerstreng på den andre armen og immobiliseres deretter på et glasssubstrat (figur 1C, sanntidsspenning). I fravær av mekanisk kraft er hårnålen lukket, og dermed slokkes fluorescensen. Men når den påførte mekaniske kraften er større enn F1/2 (kraften ved likevekt som fører til en 50% sannsynlighet for å utfolde seg), smelter hårnålen mekanisk, og et fluorescerende signal genereres.
Ved å bygge på sanntids DNA-spenningssensor beskriver vi også protokoller for å kartlegge akkumulerte krefter, noe som er spesielt nyttig for å studere interaksjoner mellom reseptorer på immunceller og deres naturlige ligand. Dette skyldes at immunreseptorer ofte viser kortvarige bindinger 3,14. Akkumulerte krefter avbildes ved hjelp av en "låsende" streng som fortrinnsvis binder seg til åpne DNA-hårnåler og muliggjør lagring av fluorescenssignaler assosiert med mekaniske trekkhendelser (figur 1C, låst spenning). Låsestrengen er designet for å binde et kryptisk bindingssted som eksponeres ved mekanisk indusert smelting av hårnålen og låse hårnålen i åpen tilstand ved å blokkere hårnålsfolding, og dermed lagre spenningssignalet og generere et akkumulert spenningskart. Videre er låsestrengen designet med et åtte-nukleotidtåhold, som muliggjør en tåholdsmediert strengforskyvningsreaksjon med sitt fulle komplement, den "låsende" strengen. Med tillegg av opplåsingsstrengen fjernes den bundne låsestrengen av hårnålskonstruksjonen, sletter det lagrede spenningssignalet og tilbakestiller hårnålen tilbake til sanntidstilstanden.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62348/62348fig01.jpg"> Figur 1: Skjema for state-of-art molekylære spenningsprober. (A) Generell utforming av sanntids molekylær spenningssonde, (B) Tråder for DNA-basert spenningssondekonstruksjon, og (C) konstruerte DNA-baserte spenningsprober og deres veksling mellom sanntidstilstand og låst tilstand. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62348/62348fig01large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
Hovedprotokollen består av fire hovedseksjoner - oligonukleotidpreparasjon, overflatebehandling, avbildning og dataanalyse. Denne protokollen har blitt vellykket demonstrert av laboratoriet vårt og andre i naive og aktiverte OT-1 CD8 + T-celler, OT-II CD4 + -celler, samt hybridomer, og kan brukes til å forhøre forskjellige immuncellereseptorer, inkludert T-cellereseptor, programmert celledødsreseptor (PD1) og lymfocyttfunksjonsassosiert antigen 1 (LFA-1) krefter. OT-1 CD8+ naive T-celler brukes som eksempelcellelinje i denne artikkelen.

<table fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#160;3-hydroxypicolinic acid (3-HPA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>56197</td>
			<td>maldi-TOF-MS matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;mPEG-SC</td>
			<td>Biochempeg</td>
			<td>MF001023-2K</td>
			<td>surface prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(3-Aminopropyl)triethoxysilane</td>
			<td>Acros</td>
			<td>AC430941000</td>
			<td>surface prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Red blood cell lysis buffer</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>00-4333-57</td>
			<td>buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8.8 nm gold nanoparticles, tannic acid</td>
			<td>Nanocomposix</td>
			<td>customized order</td>
			<td>surface prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atto647N NHS ester</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>18373-1MG-F</td>
			<td>fluorophore, oligo prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attofluor Cell Chamber, for microscopy</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A7816</td>
			<td>imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Syringes only with Luer-Lok</td>
			<td>BD bioscience</td>
			<td>309657</td>
			<td>cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>biotinylated anti-mouse CD3e</td>
			<td>ebioscience</td>
			<td>13-0031-82</td>
			<td>antibody/ligand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated pMHC ovalbumin (SIINFEKL)</td>
			<td>NIH Tetramer Core Facility at Emory University</td>
			<td>NA</td>
			<td>antibody/ligand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>735078001</td>
			<td>block non-specific interactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainers</td>
			<td>Biologix</td>
			<td>15-1100</td>
			<td>cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip Mini-Rack, teflon</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C14784</td>
			<td>surface prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3B NHS ester</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>PA63101</td>
			<td>fluorophore, oligo prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CM</td>
			<td>buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>459836</td>
			<td>surface prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s balanced salts (HBSS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H8264</td>
			<td>buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hydrogen peroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H1009</td>
			<td>surface prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LA-PEG-SC</td>
			<td>Biochempeg</td>
			<td>HE039023-3.4K</td>
			<td>surface prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Midi MACS (LS) startup kit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-301</td>
			<td>cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse CD8+ T cell isolation kit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-104-075</td>
			<td>cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanosep MF centrifugal devices</td>
			<td>Pall laboratory</td>
			<td>ODM02C35</td>
			<td>oligo prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>No. 2 round glass coverslips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48382-085</td>
			<td>surface prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTA-SAM</td>
			<td>Dojindo Molecular Technologies</td>
			<td>N475-10</td>
			<td>surface prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P2 gel</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1504118</td>
			<td>oligo prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sufuric acid</td>
			<td>EMD Millipore Corporation</td>
			<td>SX1244-6</td>
			<td>surface prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-NHS acetate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>26777</td>
			<td>surface prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent AdvanceBio Oligonucleotide C18 column, 4.6 x 150 mm, 2.7 &#956;m</td>
			<td>653950-702</td>
			<td></td>
			<td>oligonucleotide preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barnstead Nanopure water purifying system</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td>water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFI Apo 100&#215; NA 1.49 objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy5 cube</td>
			<td>CHROMA</td>
			<td></td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>evolve electron multiplying charge coupled device (EMCCD)</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td></td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-performance liquid chromatography</td>
			<td>Agilent 1100</td>
			<td></td>
			<td>oligonucleotide preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intensilight epifluorescence source</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometer (MALDI-TOF-MS)</td>
			<td>Voyager STR</td>
			<td></td>
			<td>oligonucleotide preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td>oligonucleotide preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ti inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Perfect Focus System</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>quad band TIRF 405/488/561/647 cube</td>
			<td>CHROMA</td>
			<td></td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RICM cube</td>
			<td>CHROMA</td>
			<td></td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TIRF launcher with 488 nm (50 mW), 561 nm (50 mW), and 640 nm</td>
			<td>Coherent</td>
			<td></td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRITC cube</td>
			<td>CHROMA</td>
			<td></td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligo name</td>
			<td>5&#39; modification / 3&#39; modification</td>
			<td>sequence (5&#39; to 3&#39;)</td>
			<td>Use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15mer amine locking strand</td>
			<td>5&#39; modification: no modification 
			3&#39; modification: /3AmMO/</td>
			<td>AAA AAA CAT TTA TAC CCT ACC TA</td>
			<td>locking real-time tension signal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15mer Atto647N locking strand</td>
			<td>5&#39; modification: Atto647N 
			3&#39; modification: /3AmMO/</td>
			<td>AAA AAA CAT TTA TAC CCT ACC TA</td>
			<td>locking real-time tension signal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15mer non-fluoresccent locking strand</td>
			<td>5&#39; modification: no modification 
			3&#39; modification: no modification</td>
			<td>A AAA AAC ATT TAT AC</td>
			<td>locking real-time tension signal for quantitative analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4.7 pN hairpin strand</td>
			<td>5&#39; modification: no modification 
			3&#39; modification: no modification</td>
			<td>GTGAAATACCGCACAGATGCGT 
 TTGTATAAATGTTTTTTTCATTTAT 
 ACTTTAAGAGCGCCACGTAGCC 
CAGC</td>
			<td>hairpin probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>amine ligand strand</td>
			<td>5&#39; modification: /5AmMC6/ 
			3&#39; modification: /3Bio/</td>
			<td>CGCATCTGTGCG GTA TTT CAC TTT</td>
			<td>hairpin probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BHQ2 anchor strand</td>
			<td>5&#39; modification: /5ThiolMC6-D/ 
			3&#39; modification: /3BHQ_2/</td>
			<td>TTTGCTGGGCTACGTGGCGCTCTT</td>
			<td>&#160;&#160;&#160;hairpin probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3B ligand strand</td>
			<td>5&#39; modification: Cy3B 
			3&#39; modification: /3Bio/</td>
			<td>CGCATCTGTGCG GTA TTT CAC TTT</td>
			<td>hairpin probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>unlocking strand</td>
			<td>5&#39; modification: no modification 
			3&#39; modification: no modification</td>
			<td>TAG GTA GGG TAT AAA TGT TTT TTT C</td>
			<td>unlocking accumulated tension signal</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dna tension probes to map the transient piconewton receptor forces by immune cells

Mekaniske krefter overført ved krysset mellom to naboceller og ved krysset mellom celler og den ekstracellulære matrisen er kritiske for å regulere mange prosesser som spenner fra utvikling til immunologi. Derfor er det viktig å utvikle verktøyene for å studere disse kreftene på molekylær skala. Vår gruppe utviklet en pakke med molekylære spenningssensorer for å kvantifisere og visualisere kreftene som genereres av celler og overføres til bestemte ligander. Den mest følsomme klassen av molekylære spenningssensorer består av nukleinsyrestamsløyfehårnåler. Disse sensorene bruker fluorofor-slukkerpar for å rapportere om mekanisk forlengelse og utfoldelse av DNA-hårnåler under kraft. En utfordring med DNA-hårnålsspenningssensorer er at de er reversible med rask hårnålsfolding ved avslutning av spenningen, og dermed er forbigående krefter vanskelige å registrere. I denne artikkelen beskriver vi protokollene for å forberede DNA-spenningssensorer som kan "låses" og forhindres i å brettes på nytt for å muliggjøre "lagring" av mekanisk informasjon. Dette muliggjør opptak av svært forbigående piconewton-krefter, som deretter kan "slettes" ved tilsetning av komplementære nukleinsyrer som fjerner låsen. Denne evnen til å veksle mellom sanntids spenningskartlegging og mekanisk informasjonslagring avslører svake, kortvarige og mindre rikelig krefter, som ofte brukes av T-celler som en del av deres immunfunksjoner.

Her viser vi representative bilder av overflatekvalitetskontroll (figur 4). En overflate av høy kvalitet bør ha en ren bakgrunn i RICM-kanalen (figur 4B) og jevn fluorescensintensitet i Cy3B-kanalen (figur 4C). Med samme bildebehandlingsutstyr og identiske fluorescensavbildningsoppkjøpsbetingelser, bør bakgrunnsfluorescensintensiteten være konsistent og reproduserbar hver gang når man utfører eksperimenter med DNA-prober. Vi ...

Watch this Scientific Journal Video about DNA Tension Probes to Map the Transient Piconewton Receptor Forces by Immune Cells at JoVE.com

DNA Tension Probes to Map the Transient Piconewton Receptor Forces by Immune Cells

Dette papiret beskriver en detaljert protokoll for bruk av DNA-baserte spenningsprober for å avbilde reseptorkreftene som påføres av immunceller. Denne tilnærmingen kan kartlegge reseptorkrefter >4.7pN i sanntid og kan integrere krefter over tid.

DNA-spenningssonder for å kartlegge immuncellers forbigående piconeton-reseptorkrefter

Mechanical forces transmitted at the junction between two neighboring cells and at the junction between cells and the extracellular matrix are critical ...

Denne protokollen tilbyr en metode for å kartlegge molekylære krefter generert av celler og spesielt immunceller. Protokollen er kritisk for laboratorier som er interessert i å studere mekanotransduksjon i mekanobiologi. Den største fordelen med denne teknikken er at den er superenkel og lar en bruke konvensjonell fluorescensmikroskopi for å kvantifisere kraftoverføring i utødeliggjorte og primære celler.For å begynne, plasser 25 millimeter deksler på et polytetrafluoretylenstativ i et 50 milliliter beger og skyll dekslene tre ganger ved å senke dem i vann. Bland like store mengder etanol og vann og tilsett 40 ml av denne løsningen til begeret som inneholder stativet og dekslene. Forsegl deretter begeret med parafilmtape.Rengjør dekslene ved sonikere begeret i 15 minutter i en ultralydrenser og kast væsken etter sonikering. Skyll deretter begeret som inneholder stativet og dekkene med vann minst seks ganger for å fjerne gjenværende organisk løsningsmiddel. For å tilberede en frisk piranha-løsning, tilsett 30 ml svovelsyre til et 50 ml beger og tilsett sakte 10 ml hydrogenperoksid.Bland forsiktig piranha-løsningen med enden av en glasspipette. For å starte etsning, overfør stativet som holder dekslene til begeret som inneholder pirajaløsning og inkuber i 30 minutter ved romtemperatur for å rense og hydroksylere dekslene. Overfør deretter stativet med stål eller polytetrafluoretylenpinsett til et rent 50 milliliter beger og skyll med vann seks ganger.For å fjerne vann helt, senk stativet som holder dekslene i et 50 milliliter beger med 40 ml etanol. Kast deretter etanolen. Deretter senkes stativet i 40 ml etanol som inneholder 3% aminopropyltrietoksysilan i en time ved romtemperatur for å starte reaksjonen med hydroksylgruppen på dekslene.Skyll overflaten på dekslene seks ganger ved å senke dem i 40 ml etanol og tørk dem i en ovn ved 80 grader Celsius i 20 minutter. Dekk den indre bunnen av petriskålen med en parafilmtape for å forhindre at dekslene glir inn i petriskålen. Plasser deretter de amindekkede dekslene med siden som skal funksjonaliseres med DNA-spenningsprober vendt oppover.Dekk dekslene ved 20 grader Celsius for fremtidig bruk. For å modifisere amingruppene på dekslene, tilsett liposyre PEG NHS og mPEG NHS og inkuber petriskålen ved romtemperatur i en time. På slutten av inkubasjonen, skyll overflaten tre ganger med vann.Deretter tilsettes 100 mikroliter 0,1 molar natriumbikarbonat som inneholder ett milligram per milliliter sulfo-NHS-acetat til et sett med sandwichdeksler og inkuberes i 30 minutter for passivering å skje. Tilsett 0,5 milliliter gull nanopartikler til hvert deksel og inkuber i 30 minutter ved romtemperatur. Etter inkubering, skyll dekslene med vann tre ganger.Etter å ha tilsatt Black Hole Quencher 2-strengen til den glødde DNA-spenningssonden i forholdet ti til en, tilsett 100 mikroliter av blandingen per to deksler for å lage smørbrødet. Legg forsiktig en våt labvevkule i petriskålen vekk fra dekslene og forsegl fatet med parafilmtape for å forhindre at løsningen tørker. Deretter dekker du parabolen med en folie og ruger den på fire grader Celsius over natten.Neste dag, monter bildekammeret, pass på å forhindre overflatesprekker mens du strammer kammeret. Deretter tilsettes 0,5 til en milliliter Hanks balanserte saltløsning til bildekammeret. Bruk Cy3B-kanalen med et 100X-objektiv for å fange fluorescerende signaler fra celler som er belagt på DNA-hårnålsspenningsprobene når de begynner å spre seg.Etter å ha tilberedt 100 mikromolare ikke-fluorescerende låsetråder, tilsett det på ønsket tidspunkt til cellene ved en endelig konsentrasjon på en mikroMolar i avbildningskammeret for å lagre spenningssignalet og blande det med cellene ved pipettering. Etter ca. 10 minutters låsing, skaff deg time-lapse-filmer eller endepunktsbilder i epifluorescens for både kvalitativ spenningskartlegging og kvantitativ analyse. En vellykket overflate hadde en blekrosa farge.Den høye kvaliteten på overflaten ble demonstrert med en ren bakgrunn og refleksjonsinterferenskontrastmikroskopi eller RICM-kanal og jevn fluorescensintensitet i Cy3B-kanalen. Time-lapse-bilder av spenningslåsing indikerte at både TCR anti-CD3 epsilon og TCR-peptid-MHC spenningssignaler ble forsterket på grunn av hårnålslåsing og signalakkumulering. Låsestrengen registrerte kortvarige mekaniske trekkhendelser av TCR-peptid MHCN4 som startet på null minutter, noe som muliggjorde kvantitativ analyse og avslørte det distinkte mønsteret av TCR-peptid-MHC-kraften som lignet bullseye-mønsteret til immunsynapser.Hvert trinn, din intensjon sonde substrat forberedelse trenger oppmerksomhet på detaljer og forsiktig håndtering av materialene. Denne teknologien muliggjør visualisering av forbigående molekylære krefter som oppstår på celleoverflaten når den interagerer med miljøet, spesielt i immuncellene på jakt etter antigener.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Attaching Biological Probes to Silica Optical Biosensors Using Silane Coupling Agents

Feste Biologiske Sonder til Silica Optiske Biosensorer Bruke silane kopling agenter

In order to interface with biological environments, biosensor platforms, such as the popular Biacore system (based on the Surface Plasmon Resonance (SPR) ...

Measurement of Tension Release During Laser Induced Axon Lesion to Evaluate Axonal Adhesion to the Substrate at Piconewton and Millisecond Resolution

Måling av spenningen slipper Under Laser Induced Axon Lesion å evaluere aksonal feste til overflaten på Piconewton og Millisekund Oppløsning

The formation of functional connections in a developing neuronal network is influenced by extrinsic cues. The neurite growth of developing neurons is ...

Insertion of Flexible Neural Probes Using Rigid Stiffeners Attached with Biodissolvable Adhesive

Innsetting av Fleksibel Neural Sonder Bruke Stive Avstivere festet med Biodissolvable Lim

Microelectrode  arrays for neural interface devices that are made of biocompatible thin-film  polymer are expected to have extended functional lifetime ...

Generation of Shear Adhesion Map Using SynVivo Synthetic Microvascular Networks

Generering av skjæradhesjon Kart Bruke SynVivo Syntetisk mikrovaskulære Networks

Cell/particle adhesion assays are critical to understanding the biochemical interactions involved in disease pathophysiology and have important ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Høyoppløselig Spatiotemporal Analyse av Receptor Dynamics av ​​Single-molekyl fluorescens mikroskopi

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

Studying the Stoichiometry of Epidermal Growth Factor Receptor in Intact Cells using Correlative Microscopy

Studerer Støkiometrien av epidermal vekstfaktor reseptor i intakte celler bruker korrelative Mikros

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative fluorescence ...

An Experimental Protocol for Assessing the Performance of New Ultrasound Probes Based on CMUT Technology in Application to Brain Imaging

En eksperimentell protokoll for taksere arbeidsinnsatsen av nye ultralyd sonder basert på CMUT teknologi i programmet hjernen bildebehandling

The possibility to perform an early and repeatable assessment of imaging performance is fundamental in the design and development process of new ...

Probing the Roles of Physical Forces in Early Chick Embryonic Morphogenesis

Verifiserer rollene fysiske kreftene i tidlig Chick embryonale Morphogenesis

Embryonic development is traditionally studied from the perspective of biomolecular genetics, but the fundamental importance of mechanics in morphogenesis ...

Imaging Integrin Tension and Cellular Force at Submicron Resolution with an Integrative Tension Sensor

Imaging Integrin spenning og mobilnettet Force Submicron oppløsning med en integrerende spenning Sensor

Molecular tension transmitted by integrin-ligand bonds is the fundamental mechanical signal in the integrin pathway that plays significant roles in many ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Enkeltcellet optisk virkningspotensial måling i humane induserte pluripotente stamcelleavledede kardiomyocytter

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...