Name: dna tension probes to map the transient piconewton receptor forces by immune cells
Uploaded: 2021-03-20T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about DNA Tension Probes to Map the Transient Piconewton Receptor Forces by Immune Cells at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado pelos NIH Grants R01GM131099, NIH R01GM124472 e NSF CAREER 1350829. Agradecemos ao NIH Tetramer Facility pelos ligantes pMHC. Este estudo foi apoiado, em parte, pelo Emory Comprehensive Glycomics Core.

Os camundongos transgênicos OT-1 estão alojados na Divisão de Recursos Animais da Universidade de Emory. Todos os experimentos foram aprovados e realizados sob o protocolo da Comissão Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC).
1. Preparação de oligonucleotídeos
<ol><li>Dissolver o DNA da fita ligante em água (resistividade de 18,2 MΩ, utilizada durante todo o protocolo). Vórtice e gire a solução com uma centrífuga de mesa. Ajuste o volume de água de tal forma que a con...

<ol>
	<li>Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+activation+through+immunological+synapses+and+kinapses.">T-cell activation through immunological synapses and kinapses.</a> Immunological Reviews. 221 (1), 77-89 (2008).</li><li>Spillane, K. M., Tolar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+cell+antigen+extraction+is+regulated+by+physical+properties+of+antigen-presenting+cells.">B cell antigen extraction is regulated by physical properties of antigen-presenting cells.</a> Journal of Cell Biology. 216 (1), 217-230 (2017).</li><li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanosensing+drives+acuity+of+&#945;&#946;+T-cell+recognition.">Mechanosensing drives acuity of &#945;&#946; T-cell recognition.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (39), 8204-8213 (2017).</li><li>Hong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+TCR+mechanotransduction+signaling+loop+induces+negative+selection+in+the+thymus.">A TCR mechanotransduction signaling loop induces negative selection in the thymus.</a> Nature Immunology. 19 (12), 1379-1390 (2018).</li><li>Basu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxic+T+cells+use+mechanical+force+to+potentiate+target+cell+killing.">Cytotoxic T cells use mechanical force to potentiate target cell killing.</a> Cell. 165 (1), 100-110 (2016).</li><li>Bashour, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD28+and+CD3+have+complementary+roles+in+T-cell+traction+forces.">CD28 and CD3 have complementary roles in T-cell traction forces.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (6), 2241-2246 (2014).</li><li>Ma, V. P. Y., Salaita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+nanotechnology+as+an+emerging+tool+to+study+mechanotransduction+in+living+systems.">DNA nanotechnology as an emerging tool to study mechanotransduction in living systems.</a> Small. 15 (26), 1900961 (2019).</li><li>Liu, Y., Yehl, K., Narui, Y., Salaita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tension+sensing+nanoparticles+for+mechano-imaging+at+the+living/nonliving+interface.">Tension sensing nanoparticles for mechano-imaging at the living/nonliving interface.</a> Journal of the American Chemical Society. 135 (14), 5320-5323 (2013).</li><li>Glazier, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+mechanotechnology+reveals+that+integrin+receptors+apply+pN+forces+in+podosomes+on+fluid+substrates.">DNA mechanotechnology reveals that integrin receptors apply pN forces in podosomes on fluid substrates.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-13 (2019).</li><li>Galior, K., Liu, Y., Yehl, K., Vivek, S., Salaita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Titin-based+nanoparticle+tension+sensors+map+high-magnitude+integrin+forces+within+focal+adhesions.">Titin-based nanoparticle tension sensors map high-magnitude integrin forces within focal adhesions.</a> Nano Letters. 16 (1), 341-348 (2016).</li><li>Zhang, Y., Ge, C., Zhu, C., Salaita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-based+digital+tension+probes+reveal+integrin+forces+during+early+cell+adhesion.">DNA-based digital tension probes reveal integrin forces during early cell adhesion.</a> Nature Communications. 5, 5167 (2014).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-based+nanoparticle+tension+sensors+reveal+that+T-cell+receptors+transmit+defined+pN+forces+to+their+antigens+for+enhanced+fidelity.">DNA-based nanoparticle tension sensors reveal that T-cell receptors transmit defined pN forces to their antigens for enhanced fidelity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (20), 5610-5615 (2016).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+integrins+exhibit+anisotropic+mechanosensing+and+harness+piconewton+forces+to+mediate+platelet+aggregation.">Platelet integrins exhibit anisotropic mechanosensing and harness piconewton forces to mediate platelet aggregation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (2), 325-330 (2018).</li><li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+kinetics+of+two-dimensional+TCR+and+pMHC+interactions+determine+T-cell+responsiveness.">The kinetics of two-dimensional TCR and pMHC interactions determine T-cell responsiveness.</a> Nature. 464 (7290), 932-936 (2010).</li><li>Ma, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+probes+that+store+mechanical+information+reveal+transient+piconewton+forces+applied+by+T+cells.">DNA probes that store mechanical information reveal transient piconewton forces applied by T cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (34), 16949-16954 (2019).</li><li>Hui, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+costimulatory+receptor+CD28+is+a+primary+target+for+PD-1-mediated+inhibition.">T cell costimulatory receptor CD28 is a primary target for PD-1-mediated inhibition.</a> Science. 355 (6332), 1428-1433 (2017).</li><li>Whitley, K. D., Comstock, M. J., Chemla, Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elasticity+of+the+transition+state+for+oligonucleotide+hybridization.">Elasticity of the transition state for oligonucleotide hybridization.</a> Nucleic Acids Research. 45 (2), 547-555 (2016).</li><li>Brockman, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+super-resolved+PAINT+imaging+of+piconewton+cellular+traction+forces.">Live-cell super-resolved PAINT imaging of piconewton cellular traction forces.</a> Nature Methods. 17 (10), 1018-1024 (2020).</li></ol>

Com os procedimentos detalhados fornecidos aqui, pode-se preparar substratos de sonda de tensão de DNA hairpin para mapear e quantificar a tensão do receptor produzida pelas células imunes. Quando as células são plaqueadas no substrato da sonda de tensão do pino de DNA, elas pousam, se ligam e se espalham à medida que os receptores detectam os ligantes química e mecanicamente, o último dos quais é detectado por nossas sondas. No entanto, em alguns casos, as células podem não se espalhar (...

As células imunes defendem-se contra patógenos e células cancerígenas rastejando e varrendo continuamente as superfícies das células-alvo em busca de antígenos, fixando sua superfície 1,2. O reconhecimento do antígeno é iniciado após a ligação entre o receptor de células T (TCR) e o complexo MHC (pMHC) do complexo peptídeo-principal de histocompatibilidade expresso na superfície das células-alvo. Como o reconhecimento do TCR-pMHC ocorre na junção entre duas células móveis, há muito se suspeita que ele experimente forças mecânicas. Além disso, isso levou ao modelo mecanosensor de ativação do TCR, que sugere que as forças do TCR contribuem para sua função 3,4. Para entender quando, onde e como as forças mecânicas contribuem para o funcionamento das células T, é imperativo desenvolver ferramentas para visualizar as forças moleculares transmitidas pelas células T. Tradicionalmente, métodos como a microscopia de força de tração (MFT) e os arranjos de micropilares são utilizados para investigar as forças celulares 5,6. No entanto, a sensibilidade à força dos arranjos de MTF e micropilares está na escala de nanonewton (nN) e, portanto, muitas vezes é insuficiente para estudar as forças moleculares de piconewton (pN) transmitidas por receptores celulares7. Para melhorar a força e a resolução espacial para detecção, nosso laboratório foi pioneiro no desenvolvimento de sondas de tensão molecular, que foram inicialmente sintetizadas usando polímeros de polietilenoglicol (PEG)7. As sondas de tensão molecular são compostas por uma "mola" molecular extensível (PEG, proteína, DNA) flanqueada por um fluoróforo e quencher e estão ancoradas em uma superfície. Forças aplicadas ao término da sonda levam à sua extensão, separando o fluoróforo e o quencher, gerando um forte sinal de fluorescência (Figura 1A)8,9,10.
Na última década, desenvolvemos uma biblioteca de diferentes classes de sondas de tensão molecular com elementos de mola feitos de ácidos nucléicos11, proteínas10 e polímeros8. Dentre estas, as sondas de tensão baseadas em DNA fornecem a maior relação sinal/ruído e a maior sensibilidade à força, que é facilmente sintonizada de alguns pN até ~20 pN11. Usamos essas sondas de tensão de DNA em tempo real para estudar as forças moleculares geradas por diversos tipos celulares, incluindo fibroblastos, células cancerosas, plaquetas e células imunes11,12,13. Este manuscrito descreverá protocolos para sintetizar e montar sondas de tensão de DNA em uma superfície para mapear forças de receptores moleculares com resolução de força de pN usando um microscópio de fluorescência convencional. Embora o procedimento atual inclua modificações químicas no ácido nucleico para introduzir o repórter fluorescente (Figura 1B), é importante notar que muitas das etapas de modificação e purificação podem ser terceirizadas para empresas de síntese de DNA personalizadas. Portanto, a tecnologia de sondas de tensão de DNA é fácil e acessível para as comunidades mais amplas de biologia celular e mecanobiologia.
Resumidamente, para montar sensores de tensão de DNA, um hairpin de DNA é hibridizado a uma fita fluorescente ligante em um braço e uma fita de âncora quencher no outro braço e, em seguida, imobilizado em um substrato de vidro (Figura 1C, tensão em tempo real). Na ausência de força mecânica, o hairpin é fechado e, assim, a fluorescência é apagada. No entanto, quando a força mecânica aplicada é maior que o F1/2 (a força em equilíbrio que leva a uma probabilidade de 50% de desdobramento), o hairpin derrete mecanicamente e um sinal fluorescente é gerado.
Com base no sensor de tensão do DNA em tempo real, também descrevemos protocolos para mapear forças acumuladas, o que é particularmente útil para estudar interações entre receptores em células imunes e seu ligante natural. Isso ocorre porque os receptores imunes frequentemente apresentam ligações de curta duração 3,14. As forças acumuladas são imageadas usando uma fita de "travamento" que se liga preferencialmente aos pinos de cabelo de DNA abertos e permite o armazenamento de sinais de fluorescência associados a eventos de tração mecânica (Figura 1C, tensão bloqueada). O fio de bloqueio é projetado para ligar um local de ligação críptico que é exposto após o derretimento mecanicamente induzido do hairpin e travar o hairpin no estado aberto, bloqueando a redobração do hairpin, armazenando assim o sinal de tensão e gerando um mapa de tensão acumulado. Além disso, a fita de travamento é projetada com um suporte de oito nucleotídeos, que permite uma reação de deslocamento de fita mediada por dedos dos pés com seu complemento completo, a fita de "destravamento". Com a adição do fio de desbloqueio, o fio de travamento preso é retirado da construção do hairpin, apagando o sinal de tensão armazenado e redefinindo o hairpin de volta ao estado em tempo real.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62348/62348fig01.jpg"> Figura 1: Esquema das sondas de tensão molecular de última geração. (A) Projeto geral de sonda de tensão molecular em tempo real, (B) Fitas para a construção de sonda de tensão baseada em DNA e (C) Sondas de tensão baseadas em DNA projetadas e sua alternância entre o estado em tempo real e o estado bloqueado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62348/62348fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
O protocolo principal consiste em quatro seções principais - preparação de oligonucleotídeos, preparação de superfície, imagem e análise de dados. Este protocolo foi demonstrado com sucesso por nosso laboratório e outros em células T CD8+ OT-1 virgens e ativadas, células CD4+ OT-II, bem como hibridomas, e pode ser aplicado para interrogar diferentes receptores de células imunes, incluindo receptor de células T, receptor de morte celular programada (PD1) e forças do antígeno 1 associado à função linfocitária (LFA-1). Células T virgens de OT-1 CD8+ são usadas como um exemplo de linhagem celular neste artigo.

<table fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#160;3-hydroxypicolinic acid (3-HPA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>56197</td>
			<td>maldi-TOF-MS matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;mPEG-SC</td>
			<td>Biochempeg</td>
			<td>MF001023-2K</td>
			<td>surface prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(3-Aminopropyl)triethoxysilane</td>
			<td>Acros</td>
			<td>AC430941000</td>
			<td>surface prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Red blood cell lysis buffer</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>00-4333-57</td>
			<td>buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8.8 nm gold nanoparticles, tannic acid</td>
			<td>Nanocomposix</td>
			<td>customized order</td>
			<td>surface prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atto647N NHS ester</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>18373-1MG-F</td>
			<td>fluorophore, oligo prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attofluor Cell Chamber, for microscopy</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A7816</td>
			<td>imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Syringes only with Luer-Lok</td>
			<td>BD bioscience</td>
			<td>309657</td>
			<td>cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>biotinylated anti-mouse CD3e</td>
			<td>ebioscience</td>
			<td>13-0031-82</td>
			<td>antibody/ligand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated pMHC ovalbumin (SIINFEKL)</td>
			<td>NIH Tetramer Core Facility at Emory University</td>
			<td>NA</td>
			<td>antibody/ligand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>735078001</td>
			<td>block non-specific interactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainers</td>
			<td>Biologix</td>
			<td>15-1100</td>
			<td>cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip Mini-Rack, teflon</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C14784</td>
			<td>surface prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3B NHS ester</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>PA63101</td>
			<td>fluorophore, oligo prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CM</td>
			<td>buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>459836</td>
			<td>surface prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s balanced salts (HBSS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H8264</td>
			<td>buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hydrogen peroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H1009</td>
			<td>surface prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LA-PEG-SC</td>
			<td>Biochempeg</td>
			<td>HE039023-3.4K</td>
			<td>surface prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Midi MACS (LS) startup kit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-301</td>
			<td>cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse CD8+ T cell isolation kit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-104-075</td>
			<td>cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanosep MF centrifugal devices</td>
			<td>Pall laboratory</td>
			<td>ODM02C35</td>
			<td>oligo prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>No. 2 round glass coverslips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48382-085</td>
			<td>surface prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTA-SAM</td>
			<td>Dojindo Molecular Technologies</td>
			<td>N475-10</td>
			<td>surface prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P2 gel</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1504118</td>
			<td>oligo prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sufuric acid</td>
			<td>EMD Millipore Corporation</td>
			<td>SX1244-6</td>
			<td>surface prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-NHS acetate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>26777</td>
			<td>surface prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent AdvanceBio Oligonucleotide C18 column, 4.6 x 150 mm, 2.7 &#956;m</td>
			<td>653950-702</td>
			<td></td>
			<td>oligonucleotide preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barnstead Nanopure water purifying system</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td>water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFI Apo 100&#215; NA 1.49 objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy5 cube</td>
			<td>CHROMA</td>
			<td></td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>evolve electron multiplying charge coupled device (EMCCD)</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td></td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-performance liquid chromatography</td>
			<td>Agilent 1100</td>
			<td></td>
			<td>oligonucleotide preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intensilight epifluorescence source</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometer (MALDI-TOF-MS)</td>
			<td>Voyager STR</td>
			<td></td>
			<td>oligonucleotide preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td>oligonucleotide preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ti inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Perfect Focus System</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>quad band TIRF 405/488/561/647 cube</td>
			<td>CHROMA</td>
			<td></td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RICM cube</td>
			<td>CHROMA</td>
			<td></td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TIRF launcher with 488 nm (50 mW), 561 nm (50 mW), and 640 nm</td>
			<td>Coherent</td>
			<td></td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRITC cube</td>
			<td>CHROMA</td>
			<td></td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligo name</td>
			<td>5&#39; modification / 3&#39; modification</td>
			<td>sequence (5&#39; to 3&#39;)</td>
			<td>Use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15mer amine locking strand</td>
			<td>5&#39; modification: no modification 
			3&#39; modification: /3AmMO/</td>
			<td>AAA AAA CAT TTA TAC CCT ACC TA</td>
			<td>locking real-time tension signal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15mer Atto647N locking strand</td>
			<td>5&#39; modification: Atto647N 
			3&#39; modification: /3AmMO/</td>
			<td>AAA AAA CAT TTA TAC CCT ACC TA</td>
			<td>locking real-time tension signal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15mer non-fluoresccent locking strand</td>
			<td>5&#39; modification: no modification 
			3&#39; modification: no modification</td>
			<td>A AAA AAC ATT TAT AC</td>
			<td>locking real-time tension signal for quantitative analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4.7 pN hairpin strand</td>
			<td>5&#39; modification: no modification 
			3&#39; modification: no modification</td>
			<td>GTGAAATACCGCACAGATGCGT 
 TTGTATAAATGTTTTTTTCATTTAT 
 ACTTTAAGAGCGCCACGTAGCC 
CAGC</td>
			<td>hairpin probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>amine ligand strand</td>
			<td>5&#39; modification: /5AmMC6/ 
			3&#39; modification: /3Bio/</td>
			<td>CGCATCTGTGCG GTA TTT CAC TTT</td>
			<td>hairpin probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BHQ2 anchor strand</td>
			<td>5&#39; modification: /5ThiolMC6-D/ 
			3&#39; modification: /3BHQ_2/</td>
			<td>TTTGCTGGGCTACGTGGCGCTCTT</td>
			<td>&#160;&#160;&#160;hairpin probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3B ligand strand</td>
			<td>5&#39; modification: Cy3B 
			3&#39; modification: /3Bio/</td>
			<td>CGCATCTGTGCG GTA TTT CAC TTT</td>
			<td>hairpin probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>unlocking strand</td>
			<td>5&#39; modification: no modification 
			3&#39; modification: no modification</td>
			<td>TAG GTA GGG TAT AAA TGT TTT TTT C</td>
			<td>unlocking accumulated tension signal</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dna tension probes to map the transient piconewton receptor forces by immune cells

As forças mecânicas transmitidas na junção entre duas células vizinhas e na junção entre as células e a matriz extracelular são críticas para a regulação de muitos processos que vão desde o desenvolvimento até a imunologia. Portanto, desenvolver ferramentas para estudar essas forças em escala molecular é fundamental. Nosso grupo desenvolveu um conjunto de sensores de tensão molecular para quantificar e visualizar as forças geradas pelas células e transmitidas a ligantes específicos. A classe mais sensível de sensores de tensão molecular é composta por grampos de alça de haste de ácido nucleico. Esses sensores usam pares fluoróforo-quencher para relatar a extensão mecânica e o desdobramento de pinos de cabelo de DNA sob força. Um desafio com os sensores de tensão hairpin de DNA é que eles são reversíveis com redobramento rápido do hairpin após o término da tensão e, portanto, as forças transitórias são difíceis de registrar. Neste artigo, descrevemos os protocolos de preparação de sensores de tensão de DNA que podem ser "travados" e impedidos de redobrar para permitir o "armazenamento" de informações mecânicas. Isso permite o registro de forças de piconewton altamente transitórias, que podem ser posteriormente "apagadas" pela adição de ácidos nucleicos complementares que removem a fechadura. Essa capacidade de alternar entre o mapeamento de tensão em tempo real e o armazenamento de informações mecânicas revela forças fracas, de curta duração e menos abundantes, que são comumente empregadas pelas células T como parte de suas funções imunológicas.

Aqui mostramos imagens representativas de controle de qualidade de superfície (Figura 4). Uma superfície de alta qualidade deve ter um fundo limpo no canal RICM (Figura 4B) e intensidade de fluorescência uniforme no canal Cy3B (Figura 4C). Com o mesmo equipamento de imagem e condições idênticas de aquisição de imagens de fluorescência, a intensidade de fluorescência de fundo deve ser consistente e reprodutível sempre ao r...

Watch this Scientific Journal Video about DNA Tension Probes to Map the Transient Piconewton Receptor Forces by Immune Cells at JoVE.com

DNA Tension Probes to Map the Transient Piconewton Receptor Forces by Immune Cells

Este artigo descreve um protocolo detalhado para o uso de sondas de tensão baseadas em DNA para obter imagens das forças receptoras aplicadas por células imunes. Essa abordagem pode mapear forças receptoras >4.7pN em tempo real e pode integrar forças ao longo do tempo.

Sondas de Tensão de DNA para Mapear as Forças Transitórias do Receptor de Piconewton por Células Imunes

Mechanical forces transmitted at the junction between two neighboring cells and at the junction between cells and the extracellular matrix are critical ...

Este protocolo oferece um método para mapear as forças moleculares geradas pelas células e, particularmente, pelas células imunes. O protocolo é fundamental para laboratórios interessados em estudar mecanotransdução em mecanobiologia. A principal vantagem desta técnica é que é super fácil e permite usar microscopia de fluorescência convencional para quantificar a transmissão de força em células imortalizadas e primárias.Para começar, coloque as lamínulas de 25 milímetros em um rack de politetrafluoretileno em um copo de 50 mililitros e enxágue as lamínulas três vezes, submergindo-as em água. Misture volumes iguais de etanol e água e adicione 40 mililitros desta solução ao copo que contém a cremalheira e as lamínulas. Em seguida, sele o copo usando fita parafilm.Limpe as tampas sonicando o copo por 15 minutos em um limpador ultrassônico e descarte o líquido após a sonicação. Em seguida, enxágue o copo que contém a cremalheira e as lamínulas com água pelo menos seis vezes para remover qualquer solvente orgânico restante. Para preparar uma solução fresca de piranha, adicione 30 mililitros de ácido sulfúrico a um copo de 50 mililitros e adicione lentamente 10 mililitros de peróxido de hidrogênio.Misture suavemente a solução de piranha usando a extremidade de uma pipeta de vidro. Para iniciar o condicionamento, transfira o rack que contém as lamínulas para o copo contendo solução de piranha e incube por 30 minutos à temperatura ambiente para limpar e hidroxilar as lamínulas. Em seguida, transfira o rack usando pinças de aço ou politetrafluoretileno para um copo limpo de 50 mililitros e enxágue com água seis vezes.Para remover completamente a água, mergulhe o rack que prende as tampas em um copo de 50 mililitros com 40 mililitros de etanol. Em seguida, descarte o etanol. Em seguida, imergir o rack em 40 mililitros de etanol contendo 3% de aminopropiltrietoxisilano por uma hora à temperatura ambiente para iniciar a reação com o grupo hidroxila nas lamínulas.Enxágue a superfície das tampas seis vezes, submergindo-as em 40 mililitros de etanol e seque-as em forno a 80 graus Celsius por 20 minutos. Cubra o fundo interno da placa de Petri com uma fita parafilm para evitar que as tampas deslizem para dentro da placa de Petri. Em seguida, coloque as tampas cobertas de amina com o lado a ser funcionalizado com sondas de tensão de DNA voltadas para cima.Cubra as lamínulas a 20 graus Celsius para uso futuro. Para modificar os grupos de amina nas lamínulas, adicione ácido lipóico PEG NHS e mPEG NHS e incube a placa de Petri à temperatura ambiente por uma hora. Ao final da incubação, enxaguar a superfície três vezes com água.Depois disso, adicione 100 microlitros de bicarbonato de sódio 0,1 molar contendo um miligrama por mililitro de Sulfo-NHS-Acetato a um conjunto de lamínulas de sanduíche e incube por 30 minutos para que ocorra a passivação. Adicione 0,5 mililitros de nanopartículas de ouro a cada lamínula e incube por 30 minutos à temperatura ambiente. Após a incubação, enxágue as lamínulas com água três vezes.Depois de adicionar a fita Black Hole Quencher 2 à sonda de tensão de DNA recozido em uma proporção de dez para um, adicione 100 microlitros da mistura por duas lamínulas para fazer o sanduíche. Coloque cuidadosamente uma bola de tecido de laboratório molhada na placa de Petri longe das lamínulas e sele a placa com fita parafilm para evitar que a solução seque. Depois disso, cubra o prato com um papel alumínio e incube-o a quatro graus Celsius durante a noite.No dia seguinte, monte a câmara de imagem, tomando cuidado para evitar rachaduras na superfície enquanto aperta a câmara. Em seguida, adicione 0,5 a um mililitro de Hank's Balanced Salt Solution à câmara de imagem. Use o canal Cy3B com uma objetiva de 100X para capturar sinais fluorescentes de células plaqueadas nas sondas de tensão hairpin de DNA quando elas começam a se espalhar.Depois de preparar 100 microMolares não fluorescentes de fita de bloqueio, no ponto de tempo desejado, adicione-o às células em uma concentração final de um micromolar na câmara de imagem para armazenar o sinal de tensão e misturá-lo com as células por pipetagem. Após cerca de 10 minutos de bloqueio, adquira filmes de lapso de tempo ou imagens de ponto final em epifluorescência para mapeamento qualitativo de tensão e análise quantitativa. Uma superfície bem-sucedida tinha uma cor rosa pálido.A alta qualidade da superfície foi demonstrada com um fundo limpo e a microscopia de contraste de interferência de reflexão ou canal RICM e intensidade de fluorescência uniforme no canal Cy3B. Imagens de lapso de tempo do bloqueio de tensão indicaram que os sinais de tensão TCR anti-CD3 epsilon e TCR-peptide-MHC foram amplificados devido ao bloqueio do hairpin e acúmulo de sinal. A fita de bloqueio registrou eventos de tração mecânica de curta duração do peptídeo TCR MHCN4 a partir de zero minutos, o que facilitou a análise quantitativa e revelou o padrão distinto da força MHC do peptídeo TCR que se assemelhava ao padrão bullseye das sinapses imunes.A cada passo, sua intenção de preparação do substrato da sonda precisa de atenção aos detalhes e manuseio cuidadoso dos materiais. Essa tecnologia permite a visualização de forças moleculares transitórias que ocorrem na superfície celular quando ela interage com o ambiente, especialmente nas células imunes em busca de antígenos.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Attaching Biological Probes to Silica Optical Biosensors Using Silane Coupling Agents

Colocar Sondas Biológicas para Biossensores ópticos de sílica usando agentes de acoplamento de silano

In order to interface with biological environments, biosensor platforms, such as the popular Biacore system (based on the Surface Plasmon Resonance (SPR) ...

Bioengenharia

Measurement of Tension Release During Laser Induced Axon Lesion to Evaluate Axonal Adhesion to the Substrate at Piconewton and Millisecond Resolution

Medição da tensão Lançamento Durante Laser Induced Axon lesão axonal Avaliar Adesão ao substrato em piconewton e resolução de milissegundos

The formation of functional connections in a developing neuronal network is influenced by extrinsic cues. The neurite growth of developing neurons is ...

Insertion of Flexible Neural Probes Using Rigid Stiffeners Attached with Biodissolvable Adhesive

Inserção de Flexible Neural Sondas Usando Reforços rígidos anexados com Biodissolvable Adhesive

Microelectrode  arrays for neural interface devices that are made of biocompatible thin-film  polymer are expected to have extended functional lifetime ...

Generation of Shear Adhesion Map Using SynVivo Synthetic Microvascular Networks

Geração de cisalhamento Adesão Mapa Usando SynVivo Networks microvasculares sintético

Cell/particle adhesion assays are critical to understanding the biochemical interactions involved in disease pathophysiology and have important ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

De alta resolução espacial e temporal Análise de Receptor Dynamics por uma única molécula de microscopia de fluorescência

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

Studying the Stoichiometry of Epidermal Growth Factor Receptor in Intact Cells using Correlative Microscopy

Estudando a estequiometria do Receptor do Factor de Crescimento Epidérmico em células intactas utilizando Microscopia Correlativo

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative fluorescence ...

An Experimental Protocol for Assessing the Performance of New Ultrasound Probes Based on CMUT Technology in Application to Brain Imaging

Um protocolo Experimental para avaliar o desempenho de novas sondas de ultrassom baseado na tecnologia CMUT na aplicação de imagens do cérebro

The possibility to perform an early and repeatable assessment of imaging performance is fundamental in the design and development process of new ...

Probing the Roles of Physical Forces in Early Chick Embryonic Morphogenesis

Os papéis de forças físicas no início Chick embrionárias morfogênese de sondagem

Embryonic development is traditionally studied from the perspective of biomolecular genetics, but the fundamental importance of mechanics in morphogenesis ...

Imaging Integrin Tension and Cellular Force at Submicron Resolution with an Integrative Tension Sensor

Imagem latente integrina tensão e força celular com resolução de Submicron com um Sensor de tensão Integrativa

Molecular tension transmitted by integrin-ligand bonds is the fundamental mechanical signal in the integrin pathway that plays significant roles in many ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Medição potencial de ação óptica unicelular em cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...