Name: dna tension probes to map the transient piconewton receptor forces by immune cells
Uploaded: 2021-03-20T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about DNA Tension Probes to Map the Transient Piconewton Receptor Forces by Immune Cells at JoVE.com

Detta arbete stöddes av NIH Grants R01GM131099, NIH R01GM124472 och NSF CAREER 1350829. Vi tackar NIH Tetramer Facility för pMHC-ligander. Denna studie stöddes delvis av Emory Comprehensive Glycomics Core.

OT-1 transgena möss är inrymda vid avdelningen för djurresurser vid Emory University. Alla experiment godkändes och utfördes enligt IACUC-protokollet (Institutional Animal Care and Use Committee).
1. Oligonukleotidpreparat
<ol><li>Lös upp ligandsträngens DNA i vatten (18,2 MΩ resistivitet, används i hela protokollet). Vortex och snurra ner lösningen med en bordscentrifug. Ställ in vattenvolymen så att den slutliga koncentrationen är 1 mM. Validera koncentrationen med hjälp av e...

<ol>
	<li>Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+activation+through+immunological+synapses+and+kinapses.">T-cell activation through immunological synapses and kinapses.</a> Immunological Reviews. 221 (1), 77-89 (2008).</li><li>Spillane, K. M., Tolar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+cell+antigen+extraction+is+regulated+by+physical+properties+of+antigen-presenting+cells.">B cell antigen extraction is regulated by physical properties of antigen-presenting cells.</a> Journal of Cell Biology. 216 (1), 217-230 (2017).</li><li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanosensing+drives+acuity+of+&#945;&#946;+T-cell+recognition.">Mechanosensing drives acuity of &#945;&#946; T-cell recognition.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (39), 8204-8213 (2017).</li><li>Hong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+TCR+mechanotransduction+signaling+loop+induces+negative+selection+in+the+thymus.">A TCR mechanotransduction signaling loop induces negative selection in the thymus.</a> Nature Immunology. 19 (12), 1379-1390 (2018).</li><li>Basu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxic+T+cells+use+mechanical+force+to+potentiate+target+cell+killing.">Cytotoxic T cells use mechanical force to potentiate target cell killing.</a> Cell. 165 (1), 100-110 (2016).</li><li>Bashour, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD28+and+CD3+have+complementary+roles+in+T-cell+traction+forces.">CD28 and CD3 have complementary roles in T-cell traction forces.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (6), 2241-2246 (2014).</li><li>Ma, V. P. Y., Salaita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+nanotechnology+as+an+emerging+tool+to+study+mechanotransduction+in+living+systems.">DNA nanotechnology as an emerging tool to study mechanotransduction in living systems.</a> Small. 15 (26), 1900961 (2019).</li><li>Liu, Y., Yehl, K., Narui, Y., Salaita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tension+sensing+nanoparticles+for+mechano-imaging+at+the+living/nonliving+interface.">Tension sensing nanoparticles for mechano-imaging at the living/nonliving interface.</a> Journal of the American Chemical Society. 135 (14), 5320-5323 (2013).</li><li>Glazier, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+mechanotechnology+reveals+that+integrin+receptors+apply+pN+forces+in+podosomes+on+fluid+substrates.">DNA mechanotechnology reveals that integrin receptors apply pN forces in podosomes on fluid substrates.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-13 (2019).</li><li>Galior, K., Liu, Y., Yehl, K., Vivek, S., Salaita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Titin-based+nanoparticle+tension+sensors+map+high-magnitude+integrin+forces+within+focal+adhesions.">Titin-based nanoparticle tension sensors map high-magnitude integrin forces within focal adhesions.</a> Nano Letters. 16 (1), 341-348 (2016).</li><li>Zhang, Y., Ge, C., Zhu, C., Salaita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-based+digital+tension+probes+reveal+integrin+forces+during+early+cell+adhesion.">DNA-based digital tension probes reveal integrin forces during early cell adhesion.</a> Nature Communications. 5, 5167 (2014).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-based+nanoparticle+tension+sensors+reveal+that+T-cell+receptors+transmit+defined+pN+forces+to+their+antigens+for+enhanced+fidelity.">DNA-based nanoparticle tension sensors reveal that T-cell receptors transmit defined pN forces to their antigens for enhanced fidelity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (20), 5610-5615 (2016).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+integrins+exhibit+anisotropic+mechanosensing+and+harness+piconewton+forces+to+mediate+platelet+aggregation.">Platelet integrins exhibit anisotropic mechanosensing and harness piconewton forces to mediate platelet aggregation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (2), 325-330 (2018).</li><li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+kinetics+of+two-dimensional+TCR+and+pMHC+interactions+determine+T-cell+responsiveness.">The kinetics of two-dimensional TCR and pMHC interactions determine T-cell responsiveness.</a> Nature. 464 (7290), 932-936 (2010).</li><li>Ma, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+probes+that+store+mechanical+information+reveal+transient+piconewton+forces+applied+by+T+cells.">DNA probes that store mechanical information reveal transient piconewton forces applied by T cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (34), 16949-16954 (2019).</li><li>Hui, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+costimulatory+receptor+CD28+is+a+primary+target+for+PD-1-mediated+inhibition.">T cell costimulatory receptor CD28 is a primary target for PD-1-mediated inhibition.</a> Science. 355 (6332), 1428-1433 (2017).</li><li>Whitley, K. D., Comstock, M. J., Chemla, Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elasticity+of+the+transition+state+for+oligonucleotide+hybridization.">Elasticity of the transition state for oligonucleotide hybridization.</a> Nucleic Acids Research. 45 (2), 547-555 (2016).</li><li>Brockman, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+super-resolved+PAINT+imaging+of+piconewton+cellular+traction+forces.">Live-cell super-resolved PAINT imaging of piconewton cellular traction forces.</a> Nature Methods. 17 (10), 1018-1024 (2020).</li></ol>

Med de detaljerade procedurerna som tillhandahålls här kan man förbereda DNA-hårnålsspänningssondsubstrat för att kartlägga och kvantifiera receptorspänningen som produceras av immunceller. När celler pläteras på DNA-hårnålsspänningssondsubstratet landar, fäster och sprider de sig när receptorerna känner av liganderna både kemiskt och mekaniskt, varav den senare detekteras av våra sonder. I vissa fall kan celler dock misslyckas med att sprida sig (Figur 7A) eller misslyck...

Immunceller försvarar sig mot patogener och cancerceller genom att kontinuerligt krypa och skanna målcellernas ytor för antigener, studding deras yta 1,2. Antigenigenkänning initieras vid bindning mellan T-cellreceptorn (TCR) och det peptid-stora histokompatibilitetskomplexet MHC (pMHC) -komplexet uttryckt på ytan av målceller. Eftersom TCR-pMHC-igenkänning sker vid korsningen mellan två mobila celler har den länge misstänkts för att uppleva mekaniska krafter. Dessutom ledde detta till mekanosensormodellen för TCR-aktivering, vilket tyder på att TCR-krafter bidrar till dess funktion 3,4. För att förstå när, var och hur mekaniska krafter bidrar till T-cellernas funktion är det absolut nödvändigt att utveckla verktyg för att visualisera de molekylära krafter som överförs av T-celler. Traditionellt används metoder som dragkraftmikroskopi (TFM) och mikropelarrayer för att undersöka cellulära krafter 5,6. Emellertid är kraftkänsligheten hos TFM- och mikropelarrayer på nanonewton (nN) -skalan och är därför ofta otillräcklig för att studera molekylära piconewton (pN) -krafter som överförs av cellreceptorer7. För att förbättra kraften och den rumsliga upplösningen för detektion var vårt laboratorium banbrytande för utvecklingen av molekylära spänningsprober, som ursprungligen syntetiserades med användning av polyetylenglykol (PEG) polymerer7. Molekylära spänningsprober består av en utdragbar molekylär "fjäder" (PEG, protein, DNA) flankerad av en fluorofor och släckare och förankras på en yta. Krafter som appliceras på sondens ändpunkt leder till dess förlängning, separerar fluoroforen och släckaren och genererar därmed en stark fluorescenssignal (figur 1A)8,9,10.
Under det senaste decenniet har vi utvecklat ett bibliotek av olika klasser av molekylära spänningsprober med fjäderelement tillverkade av nukleinsyror11, proteiner10 och polymerer8. Bland dessa ger de DNA-baserade spänningsproberna det högsta signal-brusförhållandet och den största kraftkänsligheten, som enkelt ställs in från några pN upp till ~ 20 pN11. Vi har använt dessa DNA-spänningsprober i realtid för att studera de molekylära krafterna som genereras av många olika celltyper, inklusive fibroblaster, cancerceller, blodplättar och immunceller11,12,13. Detta manuskript kommer att beskriva protokoll för att syntetisera och montera DNA-spänningsprober på en yta för att kartlägga molekylära receptorkrafter med pN-kraftupplösning med hjälp av ett konventionellt fluorescensmikroskop. Medan det nuvarande förfarandet inkluderar kemiska modifieringar av nukleinsyran för att introducera den fluorescerande reportern (figur 1B), är det viktigt att notera att många av modifierings- och reningsstegen kan outsourcas till anpassade DNA-syntesföretag. Därför är DNA-spänningsprober teknik lätt och tillgänglig för de bredare cellbiologi- och mekanobiologiska samhällena.
Kortfattat, för att montera DNA-spänningssensorer, hybridiseras en DNA-hårnål till en fluorescerande ligandsträng på ena armen och en släckarankarsträng på den andra armen och immobiliseras sedan på ett glassubstrat (Figur 1C, realtidsspänning). I frånvaro av mekanisk kraft stängs hårnålen och fluorescensen släckes. Men när den applicerade mekaniska kraften är större än F1/2 (kraften vid jämvikt som leder till en 50% sannolikhet för utfällning) smälter hårnålen mekaniskt och en fluorescerande signal genereras.
Med utgångspunkt i DNA-spänningssensorn i realtid beskriver vi också protokoll för att kartlägga ackumulerade krafter, vilket är särskilt användbart för att studera interaktioner mellan receptorer på immunceller och deras naturliga ligand. Detta beror på att immunreceptorer ofta uppvisar kortlivade bindningar 3,14. Ackumulerade krafter avbildas med hjälp av en "låsande" sträng som företrädesvis binder till öppna DNA-hårnålar och möjliggör lagring av fluorescenssignaler associerade med mekaniska draghändelser (figur 1C, låst spänning). Låssträngen är utformad för att binda ett kryptiskt bindningsställe som exponeras vid mekaniskt inducerad smältning av hårnålen och låsa hårnålen i öppet tillstånd genom att blockera hårnålens omvikning, vilket lagrar spänningssignalen och genererar en ackumulerad spänningskarta. Dessutom är låssträngen utformad med en åtta-nukleotid-tåhållare, vilket möjliggör en tåhållmedierad strängförskjutningsreaktion med sitt fulla komplement, den "upplåsta" strängen. Med tillägget av upplåsningssträngen avlägsnas den bundna låssträngen från hårnålskonstruktionen, raderar den lagrade spänningssignalen och återställer hårnålen till realtidsläget.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62348/62348fig01.jpg"> Figur 1: Schema för de toppmoderna molekylära spänningsproberna . (A) Allmän design av molekylär spänningssond i realtid, (B) strängar för den DNA-baserade spänningssondkonstruktionen, och (C) konstruerade DNA-baserade spänningssonder och deras växling mellan realtidstillstånd och låst tillstånd. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62348/62348fig01large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
Huvudprotokollet består av fyra huvudsektioner - oligonukleotidberedning, ytbehandling, avbildning och dataanalys. Detta protokoll har framgångsrikt demonstrerats av vårt laboratorium och andra i naiva och aktiverade OT-1 CD8 + T-celler, OT-II CD4 + -celler, såväl som hybridom, och kan tillämpas för att förhöra olika immuncellreceptorer inklusive T-cellreceptor, programmerad celldödsreceptor (PD1) och lymfocytfunktionsassocierad antigen 1 (LFA-1) krafter. OT-1 CD8 + naiva T-celler används som exempel cellinje i detta papper.

<table fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#160;3-hydroxypicolinic acid (3-HPA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>56197</td>
			<td>maldi-TOF-MS matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;mPEG-SC</td>
			<td>Biochempeg</td>
			<td>MF001023-2K</td>
			<td>surface prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(3-Aminopropyl)triethoxysilane</td>
			<td>Acros</td>
			<td>AC430941000</td>
			<td>surface prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Red blood cell lysis buffer</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>00-4333-57</td>
			<td>buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8.8 nm gold nanoparticles, tannic acid</td>
			<td>Nanocomposix</td>
			<td>customized order</td>
			<td>surface prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atto647N NHS ester</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>18373-1MG-F</td>
			<td>fluorophore, oligo prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attofluor Cell Chamber, for microscopy</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A7816</td>
			<td>imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Syringes only with Luer-Lok</td>
			<td>BD bioscience</td>
			<td>309657</td>
			<td>cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>biotinylated anti-mouse CD3e</td>
			<td>ebioscience</td>
			<td>13-0031-82</td>
			<td>antibody/ligand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated pMHC ovalbumin (SIINFEKL)</td>
			<td>NIH Tetramer Core Facility at Emory University</td>
			<td>NA</td>
			<td>antibody/ligand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>735078001</td>
			<td>block non-specific interactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainers</td>
			<td>Biologix</td>
			<td>15-1100</td>
			<td>cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip Mini-Rack, teflon</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C14784</td>
			<td>surface prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3B NHS ester</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>PA63101</td>
			<td>fluorophore, oligo prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CM</td>
			<td>buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>459836</td>
			<td>surface prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s balanced salts (HBSS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H8264</td>
			<td>buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hydrogen peroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H1009</td>
			<td>surface prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LA-PEG-SC</td>
			<td>Biochempeg</td>
			<td>HE039023-3.4K</td>
			<td>surface prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Midi MACS (LS) startup kit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-301</td>
			<td>cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse CD8+ T cell isolation kit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-104-075</td>
			<td>cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanosep MF centrifugal devices</td>
			<td>Pall laboratory</td>
			<td>ODM02C35</td>
			<td>oligo prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>No. 2 round glass coverslips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48382-085</td>
			<td>surface prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTA-SAM</td>
			<td>Dojindo Molecular Technologies</td>
			<td>N475-10</td>
			<td>surface prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P2 gel</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1504118</td>
			<td>oligo prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sufuric acid</td>
			<td>EMD Millipore Corporation</td>
			<td>SX1244-6</td>
			<td>surface prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-NHS acetate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>26777</td>
			<td>surface prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent AdvanceBio Oligonucleotide C18 column, 4.6 x 150 mm, 2.7 &#956;m</td>
			<td>653950-702</td>
			<td></td>
			<td>oligonucleotide preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barnstead Nanopure water purifying system</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td>water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFI Apo 100&#215; NA 1.49 objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy5 cube</td>
			<td>CHROMA</td>
			<td></td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>evolve electron multiplying charge coupled device (EMCCD)</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td></td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-performance liquid chromatography</td>
			<td>Agilent 1100</td>
			<td></td>
			<td>oligonucleotide preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intensilight epifluorescence source</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometer (MALDI-TOF-MS)</td>
			<td>Voyager STR</td>
			<td></td>
			<td>oligonucleotide preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td>oligonucleotide preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ti inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Perfect Focus System</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>quad band TIRF 405/488/561/647 cube</td>
			<td>CHROMA</td>
			<td></td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RICM cube</td>
			<td>CHROMA</td>
			<td></td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TIRF launcher with 488 nm (50 mW), 561 nm (50 mW), and 640 nm</td>
			<td>Coherent</td>
			<td></td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRITC cube</td>
			<td>CHROMA</td>
			<td></td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligo name</td>
			<td>5&#39; modification / 3&#39; modification</td>
			<td>sequence (5&#39; to 3&#39;)</td>
			<td>Use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15mer amine locking strand</td>
			<td>5&#39; modification: no modification 
			3&#39; modification: /3AmMO/</td>
			<td>AAA AAA CAT TTA TAC CCT ACC TA</td>
			<td>locking real-time tension signal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15mer Atto647N locking strand</td>
			<td>5&#39; modification: Atto647N 
			3&#39; modification: /3AmMO/</td>
			<td>AAA AAA CAT TTA TAC CCT ACC TA</td>
			<td>locking real-time tension signal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15mer non-fluoresccent locking strand</td>
			<td>5&#39; modification: no modification 
			3&#39; modification: no modification</td>
			<td>A AAA AAC ATT TAT AC</td>
			<td>locking real-time tension signal for quantitative analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4.7 pN hairpin strand</td>
			<td>5&#39; modification: no modification 
			3&#39; modification: no modification</td>
			<td>GTGAAATACCGCACAGATGCGT 
 TTGTATAAATGTTTTTTTCATTTAT 
 ACTTTAAGAGCGCCACGTAGCC 
CAGC</td>
			<td>hairpin probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>amine ligand strand</td>
			<td>5&#39; modification: /5AmMC6/ 
			3&#39; modification: /3Bio/</td>
			<td>CGCATCTGTGCG GTA TTT CAC TTT</td>
			<td>hairpin probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BHQ2 anchor strand</td>
			<td>5&#39; modification: /5ThiolMC6-D/ 
			3&#39; modification: /3BHQ_2/</td>
			<td>TTTGCTGGGCTACGTGGCGCTCTT</td>
			<td>&#160;&#160;&#160;hairpin probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3B ligand strand</td>
			<td>5&#39; modification: Cy3B 
			3&#39; modification: /3Bio/</td>
			<td>CGCATCTGTGCG GTA TTT CAC TTT</td>
			<td>hairpin probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>unlocking strand</td>
			<td>5&#39; modification: no modification 
			3&#39; modification: no modification</td>
			<td>TAG GTA GGG TAT AAA TGT TTT TTT C</td>
			<td>unlocking accumulated tension signal</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dna tension probes to map the transient piconewton receptor forces by immune cells

Mekaniska krafter som överförs vid korsningen mellan två angränsande celler och vid korsningen mellan celler och den extracellulära matrisen är avgörande för att reglera många processer som sträcker sig från utveckling till immunologi. Därför är det viktigt att utveckla verktygen för att studera dessa krafter i molekylär skala. Vår grupp utvecklade en serie molekylära spänningssensorer för att kvantifiera och visualisera de krafter som genereras av celler och överförs till specifika ligander. Den känsligaste klassen av molekylära spänningssensorer består av nukleinsyrastamslinga hårnålar. Dessa sensorer använder fluorofor-släckarpar för att rapportera om den mekaniska förlängningen och utvecklingen av DNA-hårnålar som är i kraft. En utmaning med DNA-hårnålsspänningssensorer är att de är reversibla med snabb hårnålsvikning vid avslutad spänning och därmed är övergående krafter svåra att registrera. I den här artikeln beskriver vi protokollen för att förbereda DNA-spänningssensorer som kan "låsas" och förhindras från att vikas om för att möjliggöra "lagring" av mekanisk information. Detta möjliggör inspelning av mycket övergående piconewtonkrafter, som därefter kan "raderas" genom tillsats av komplementära nukleinsyror som tar bort låset. Denna förmåga att växla mellan spänningskartläggning i realtid och mekanisk informationslagring avslöjar svaga, kortlivade och mindre rikliga krafter, som vanligtvis används av T-celler som en del av deras immunfunktioner.

Här visar vi representativa bilder för ytkvalitetskontroll (figur 4). En yta av hög kvalitet bör ha en ren bakgrund i RICM-kanalen (figur 4B) och enhetlig fluorescensintensitet i Cy3B-kanalen (figur 4C). Med samma bildutrustning och identiska fluorescensbildningsförhållanden bör bakgrundsfluorescensintensiteten vara konsekvent och reproducerbar varje gång vid experiment med DNA-sonder. Vi rekommenderar att du använder den s...

Watch this Scientific Journal Video about DNA Tension Probes to Map the Transient Piconewton Receptor Forces by Immune Cells at JoVE.com

DNA Tension Probes to Map the Transient Piconewton Receptor Forces by Immune Cells

Detta dokument beskriver ett detaljerat protokoll för att använda DNA-baserade spänningssonder för att avbilda receptorkrafterna som appliceras av immunceller. Detta tillvägagångssätt kan kartlägga receptorkrafter >4.7pN i realtid och kan integrera krafter över tid.

DNA-spänningssonder för att kartlägga de övergående piconewtonreceptorkrafterna av immunceller

Mechanical forces transmitted at the junction between two neighboring cells and at the junction between cells and the extracellular matrix are critical ...

Detta protokoll erbjuder en metod för att kartlägga de molekylära krafter som genereras av celler och särskilt immunceller. Protokollet är avgörande för laboratorier som är intresserade av att studera mekanotransduktion i mekanobiologi. Den största fördelen med denna teknik är att den är superlätt och gör att man kan använda konventionell fluorescensmikroskopi för att kvantifiera kraftöverföring i odödliga och primära celler.Börja med att placera 25 millimeter täckglas på ett polytetrafluoretylenställ i en 50 ml bägare och skölj täckglasen tre gånger genom att sänka dem i vatten. Blanda lika stora volymer etanol och vatten och tillsätt 40 ml av denna lösning till bägaren som innehåller stället och täckglasen. Försegla sedan bägaren med parafilmtejp.Rengör täckglasen genom att sonikera bägaren i 15 minuter i en ultraljudsrengörare och kassera vätskan efter ultraljudsbehandling. Skölj sedan bägaren som innehåller stället och täckglasen med vatten minst sex gånger för att avlägsna eventuellt kvarvarande organiskt lösningsmedel. För att förbereda en ny piranha-lösning, tillsätt 30 ml svavelsyra till en 50 ml bägare och tillsätt långsamt 10 ml väteperoxid.Blanda försiktigt piranha-lösningen med änden av en glaspipett. För att initiera etsning, överför stället som håller täckglasen till bägaren som innehåller piranha-lösning och inkubera i 30 minuter vid rumstemperatur för att rengöra och hydroxylera täckglasen. Överför sedan stället med en pincett av stål eller polytetrafluoretylen till en ren 50 ml-bägare och skölj med vatten sex gånger.För att avlägsna vatten helt, sänk ner stället som håller täckglasen i en 50 ml bägare med 40 ml etanol. Kassera sedan etanolen. Därefter sänk ner stället i 40 ml etanol innehållande 3% aminopropyltrietoxisilan i en timme vid rumstemperatur för att initiera reaktionen med hydroxylgruppen på täckglasen.Skölj ytan på täckglasen sex gånger genom att sänka dem i 40 ml etanol och torka dem i en ugn vid 80 grader Celsius i 20 minuter. Täck den inre botten av petriskålen med en parafilmtejp för att förhindra att täckglasen glider in i petriskålen. Placera sedan de amintäckta täckglasen med sidan som ska funktionaliseras med DNA-spänningsprober uppåt.Täck täckglasen vid 20 grader Celsius för framtida bruk. För att modifiera amingrupperna på täckglasen, tillsätt liponsyra PEG NHS och mPEG NHS och inkubera petriskålen vid rumstemperatur i en timme. Vid slutet av inkubationen skölj ytan tre gånger med vatten.Därefter tillsätt 100 mikroliter 0,1 molar natriumbikarbonat innehållande ett milligram per milliliter Sulfo-NHS-acetat till en uppsättning sandwichtäcken och inkubera i 30 minuter för passivering att inträffa. Tillsätt 0,5 ml guldnanopartiklar till varje täckglas och inkubera i 30 minuter vid rumstemperatur. Efter inkubation, skölj täckglasen med vatten tre gånger.Efter tillsats av Black Hole Quencher 2-strängen till den glödgade DNA-spänningssonden i ett förhållande tio till ett, tillsätt 100 mikroliter av blandningen per två täckglas för att göra smörgåsen. Placera försiktigt en våt labvävnadsboll i petriskålen bort från täckglasen och försegla skålen med parafilmtejp för att förhindra att lösningen torkar. Därefter täcker du skålen med en folie och inkuberar den vid fyra grader Celsius över natten.Nästa dag, montera bildkammaren, var noga med att förhindra ytsprickor medan du drar åt kammaren. Tillsätt sedan 0,5 till en milliliter Hanks balanserade saltlösning i bildkammaren. Använd Cy3B-kanalen med ett 100X-mål för att fånga fluorescerande signaler från celler pläterade på DNA-hårnålsspänningsproberna när de börjar sprida sig.Efter beredning av 100 mikromolar icke-fluorescerande låssträngstam, vid önskad tidpunkt, tillsätt den till cellerna vid en slutlig koncentration av en mikromolar i bildkammaren för att lagra spänningssignalen och blanda den med cellerna genom pipettering. Efter cirka 10 minuters låsning, skaffa time-lapse-filmer eller slutpunktsbilder i epifluorescens för både kvalitativ spänningskartläggning och kvantitativ analys. En framgångsrik yta hade en blekrosa färg.Ytans höga kvalitet demonstrerades med en ren bakgrund och reflektionsinterferenskontrastmikroskopi eller RICM-kanal och enhetlig fluorescensintensitet i Cy3B-kanalen. Time-lapse-bilder av spänningslåsning indikerade att både TCR-anti-CD3-epsilon och TCR-peptid-MHC-spänningssignaler förstärktes på grund av hårnålslåsning och signalackumulering. Låssträngen registrerade kortlivade mekaniska draghändelser av TCR-peptid MHCN4 som började vid noll minuter, vilket underlättade kvantitativ analys och avslöjade det distinkta mönstret för TCR-peptiden MHC-kraften som liknade bullseye-mönstret för immunsynapser.Varje steg måste din förberedelse av sondsubstrat vara uppmärksam på detaljer och noggrann hantering av materialen. Denna teknik möjliggör visualisering av övergående molekylära krafter som uppstår vid cellytan när den interagerar med miljön, särskilt i immuncellerna i sökandet efter antigener.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design av en cyklisk tryck Bioreaktor för Ex vivo Studie av Aorta hjärtklaffar

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Attaching Biological Probes to Silica Optical Biosensors Using Silane Coupling Agents

Bifoga Biologiska sönder för att Silica optiska biosensorer med användning av silan Koppling ombud

In order to interface with biological environments, biosensor platforms, such as the popular Biacore system (based on the Surface Plasmon Resonance (SPR) ...

Mass Cytometry: Protocol for Daily Tuning and Running Cell Samples on a CyTOF Mass Cytometer

Mass Cytometry: Protokoll för Daily Tuning och kör prover cell på en CyTOF Mass Cytometer

In recent years, the rapid analysis of single cells has commonly been performed using flow cytometry and fluorescently-labeled antibodies. However, the ...

Measurement of Tension Release During Laser Induced Axon Lesion to Evaluate Axonal Adhesion to the Substrate at Piconewton and Millisecond Resolution

Mätning av spänning Release Under Laser Induced Axon skada som Utvärdera Axonal vidhäftning vid Piconewton och millisekundsupplösning

The formation of functional connections in a developing neuronal network is influenced by extrinsic cues. The neurite growth of developing neurons is ...

Insertion of Flexible Neural Probes Using Rigid Stiffeners Attached with Biodissolvable Adhesive

Insättning av Flexibel Neural Probes Använda Styva Förstyvningar Attached med Biodissolvable Adhesive

Microelectrode  arrays for neural interface devices that are made of biocompatible thin-film  polymer are expected to have extended functional lifetime ...

Generation of Shear Adhesion Map Using SynVivo Synthetic Microvascular Networks

Generering av Shear Adhesion Karta Använda SynVivo Syntetisk Mikrovaskulära Networks

Cell/particle adhesion assays are critical to understanding the biochemical interactions involved in disease pathophysiology and have important ...

Studying the Stoichiometry of Epidermal Growth Factor Receptor in Intact Cells using Correlative Microscopy

Studie stökiometrin hos receptorn för epidermal tillväxtfaktor i intakta celler genom att använda Korrelat Mikroskopi

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative fluorescence ...

An Experimental Protocol for Assessing the Performance of New Ultrasound Probes Based on CMUT Technology in Application to Brain Imaging

Ett experimentellt protokoll för bedömning av nya ultraljud sonder baserat på CMUT teknik i programmet och hjärnavbildning

The possibility to perform an early and repeatable assessment of imaging performance is fundamental in the design and development process of new ...

Probing the Roles of Physical Forces in Early Chick Embryonic Morphogenesis

Sondering av fysiska krafter i tidig Chick embryonala morfogenes roller

Embryonic development is traditionally studied from the perspective of biomolecular genetics, but the fundamental importance of mechanics in morphogenesis ...

Imaging Integrin Tension and Cellular Force at Submicron Resolution with an Integrative Tension Sensor

Imaging Integrin spänningar och cellulära kraft på Submicron upplösning med en integrativ spänningar sensorn

Molecular tension transmitted by integrin-ligand bonds is the fundamental mechanical signal in the integrin pathway that plays significant roles in many ...