Name: partial hepatectomy in adult zebrafish
Uploaded: 2021-04-04T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Partial Hepatectomy in Adult Zebrafish at JoVE.com

I.M.O. understøttes af NIAAA (F32AA027135). W.G. understøttes af R01DK090311, R01DK105198, R24OD017870 og Claudia Adams Barr Program for Excellence in Cancer Research. W.G. er en Pew Scholar i biomedicinsk videnskab.

Zebrafisk blev opdrættet og opdrættet efter standardprocedurer. Eksperimenter blev godkendt af Brigham and Women's Hospital's Institutional Animal Care and Use Committee (2016N000405). Voksne zebrafisk blev fastet i 24 timer før starten af protokollen. Systemvand refererer til vandet i zebrafiskhustanke i vandfaciliteten.
1. Forberedelse og anæstesiisering
<ol><li>Forbered 0,016% Tricaine løsning i systemvand. ADVARSEL: Tricain er irriterende, hvis det kommer i kontakt med øjne, hud...

<ol>
	<li>Michalopoulos, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+liver+regeneration+and+growth+homeostasis.">Principles of liver regeneration and growth homeostasis.</a> Comprehensive Physiology. 3, 485-513 (2013).</li><li>Wang, S., Miller, S. R., Ober, E. A., Sadler, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+it+new+again:+insight+into+liver+development,+regeneration,+and+disease+from+zebrafish+research.">Making it new again: insight into liver development, regeneration, and disease from zebrafish research.</a> Current Topics in Developmental Biology. 124, (2017).</li><li>Michalopoulos, G. K., Bhushan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+regeneration:+biological+and+pathological+mechanisms+and+implications.">Liver regeneration: biological and pathological mechanisms and implications.</a> Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology. , (2020).</li><li>Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+as+a+model+for+complex+tissue+regeneration.">The zebrafish as a model for complex tissue regeneration.</a> Trends in Genetics. 29, 611-620 (2013).</li><li>Sadler, K. C., Krahn, K. N., Gaur, N. A., Ukomadu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+growth+in+the+embryo+and+during+liver+regeneration+in+zebrafish+requires+the+cell+cycle+regulator+uhrf1.">Liver growth in the embryo and during liver regeneration in zebrafish requires the cell cycle regulator uhrf1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 1570-1575 (2007).</li><li>Goessling, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=APC+mutant+zebrafish+uncover+a+changing+temporal+requirement+for+wnt+signaling+in+liver+development.">APC mutant zebrafish uncover a changing temporal requirement for wnt signaling in liver development.</a> Developmental Biology. 320, 161-174 (2008).</li><li>Dovey, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topoisomerase+II+is+required+for+embryonic+development+and+liver+regeneration+in+zebrafish.">Topoisomerase II is required for embryonic development and liver regeneration in zebrafish.</a> Molecular and Cellular Biology. 29, 3746-3753 (2009).</li><li>Kan, N. G., Junghans, D., Belmonte, J. C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compensatory+growth+mechanisms+regulated+by+BMP+and+FGF+signaling+mediate+liver+regeneration+in+zebrafish+after+partial+hepatectomy.">Compensatory growth mechanisms regulated by BMP and FGF signaling mediate liver regeneration in zebrafish after partial hepatectomy.</a> The FASEB Journal. 23, 3516-3525 (2009).</li><li>Zhu, Z., Chen, J., Xiong, J. W., Peng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haploinsufficiency+of+Def+activates+p53-dependent+TGF&#946;+signalling+and+causes+scar+formation+after+partial+hepatectomy.">Haploinsufficiency of Def activates p53-dependent TGF&#946; signalling and causes scar formation after partial hepatectomy.</a> PLoS One. 9, (2014).</li><li>Feng, G., Long, Y., Peng, J., Li, Q., Cui, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+characterization+of+the+dorsal+lobes+after+hepatectomy+of+the+ventral+lobe+in+zebrafish.">Transcriptomic characterization of the dorsal lobes after hepatectomy of the ventral lobe in zebrafish.</a> BMC Genomics. 16, 979 (2015).</li><li>Michalopoulos, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+regeneration.">Liver regeneration.</a> Journal of Cellular Physiology. 213, 286-300 (2007).</li><li>Grisham, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organizational+principles+of+the+liver.">Organizational principles of the liver.</a> The Liver: Biology and Pathobiology: Fifth Edition. , 1-15 (2009).</li></ol>

De anatomiske forskelle mellem zebrafisk og pattedyr modeller for lever regenerering udgør unikke udfordringer for lever resektion. Leveren i zebrafisk er tæt på hjertet og tarmen; utilsigtet skadelige begge organer resulterer i øget dødelighed. Zebrafiskleveren er ikke indkapslet, hvilket gør det vanskeligere at adskille fra tarmen. Leveren modtager næringsrige blod fra tarmen gennem portal vener. Hos pattedyr konvergerer vener, der forlader tarmen, på en primær portalåre, der derefter opdeles, når den kommer...

Blandt de faste organer hos mennesker er leveren det eneste organ, der er i stand til regenerering1. Dette er kritisk, da leveren er et vigtigt organ, der er ansvarlig for vigtige metaboliske funktioner, energilagring, blod afgiftning, sekretion af plasmaproteiner og galdeproduktion2. Hepatocytter tabt på grund af giftige eller inflammatoriske skader erstattes primært via opdeling af de resterende hepatocytter1. En klassisk eksperimentel model til undersøgelse af leverregenerering er delvis hepatektomi, hvor individuelle lobes af leveren fjernes, hvilket efterlader de resterende lobesintakte 3. Denne procedure blev oprindeligt udviklet hos rotter, hvor ca. to tredjedele af levermassen fjernes. Efter delvis hepatektomi hos pattedyr forekommer kompenserende regenerering i de resterende lobes, indtil leveren genvinder sin oprindelige masse. Især erstatter pattedyrsleveren ikke de manglende lobes.
Zebrafisk (Danio rerio) repræsenterer en tractable model for at studere voksen organ regenerering4. Zebrafiskleveren, mens den er strukturelt forskellig fra pattedyrsleveren, består af de samme celletyper og tjener den samme funktion som hos pattedyr2. Det er sammensat af tre lapper, med to dorsale lobes og en enkelt ventral lap, der er fladt langs tarmen. Delvis hepatektomi er tidligere blevet udført i zebrafisk, med modstridende beretninger om den præcise form for regenerering. Typisk udføres en tredjedel delvis hepatektomi ved fjernelse af hele ventral lap. Indledende rapporter viste, at efter fjernelse af ventral lapen var den fuldt regenereret inden for en uge5,6,7, hvilket tyder på, at zebrafiskleveren i modsætning til pattedyrsleveren er i stand til epimorf regenerering. Efterfølgende undersøgelser viste , at fjernelse af ventral lap resulterede i kompenserende regenerering i dorsale lobes, snarere end regenerering af den manglende ventral lap, og i sidste ende inddrivelse af levermasse inden for en uge8,9. Transskriptionsprofilering af dorsale lobes efter resektion af ventral lap afslørede betydelige ændringer forbundet med kompenserende regenerering10. I betragtning af at tilstanden af leverregenerering kan variere med omfanget af skaden8, spekulerede vi på, at forskellene i resultaterne kan skyldes teknisk variation i den delvise hepatektomiprotokol mellem forskningsgrupper.
Denne protokol beskriver en procedure for udførelse af en tredjedel delvis hepatektomi på voksne zebrafisk ved at fjerne ventral lap. Denne teknik vil være værdifuld til vurdering af mekanismer til leverregenerering.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde Aqueous Solution, EM Grade</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AS 82/220.R2 PLUS Analytical Balance</td>
			<td>Bay State Scale &#38; Systems, INC.</td>
			<td>WL-104-1051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #55 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11295-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMS Kuehne Coverglass/Specimen Forceps</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72997-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Discovery.V8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mastertop Cellulose Cleaning Scrub Sponge</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07CBSM53Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS10X Liquid Conc 4L</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>6505-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Fine Micro Scissors, 3 1/4&#34; straight</td>
			<td>Biomedical Research Instruments</td>
			<td>11-1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine methanesulfonate</td>
			<td>Syndel</td>
			<td>TRIC-M-GR-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20, Fisher BioReagents</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

partial hepatectomy in adult zebrafish

Leversvigt er en af de førende dødsårsager på verdensplan, og dødeligheden fra kronisk leversygdom stiger kraftigt i USA. Sunde lever er i stand til at regenerere fra giftige skader, men i fremskreden leversygdom er leverens naturlige evne til at regenerere nedsat. Zebrafisk er opstået som et stærkt eksperimentelt system til at studere regenerering. De er en ideel model til at studere leverregenerering fra delvis hepatektomi, en procedure med direkte klinisk relevans, hvor en del af leveren fjernes kirurgisk, hvilket efterlader resten intakt. Der er ingen standardprotokol for delvis hepatektomi. tidligere undersøgelser ved hjælp af denne model har brugt lidt forskellige protokoller og rapporteret forskellige resultater. Beskrevet her er en effektiv, reproducerbar protokol til udførelse af en delvis hepatektomi hos voksne zebrafisk. Vi bruger denne teknik til at demonstrere, at zebrafisk er i stand til epimorf regenerering af den resected lap. Denne protokol kan bruges til yderligere at afhøre de mekanismer, der kræves for leverregenerering i zebrafisk.

For at undersøge det regenerative potentiale i den voksne zebrafisklever udførte vi delvis hepatektomi (PHX) hos voksne zebrafisk. Generelt blev store voksne (30-40 mm i længden) udvalgt, lige fra 1,5-2,5 år gamle. Inden for individuelle forsøg blev dyrene udvalgt fra samme tank og var alders- og størrelsesmatchede. Som en passende kontrol brugte vi falske operationer, hvor dyret både blev bedøvet og modtog et stort snit i ventral kropsvæggen, men blev genvundet uden at fjerne noget væv. Overlevelsesraten for f...

Watch this Scientific Journal Video about Partial Hepatectomy in Adult Zebrafish at JoVE.com

Partial Hepatectomy in Adult Zebrafish

Denne protokol beskriver proceduren for fjernelse af leverens ventral lap hos voksne zebrafisk for at gøre det muligt at studere leverregenerering.

Delvis Hepatectomy hos voksne zebrafisk

Liver failure is one of the leading causes of death worldwide, and mortality from chronic liver disease is rising sharply in the United States. Healthy ...

Denne protokol vil give forskerne mulighed for at drage fordel af tilgængelige kemiske og genetiske værktøjer til at studere mekanismerne for leverregenerering i zebrafisk. Delvis hepatektomi gør det muligt præcis fjernelse af væv for at stimulere lever regenerering uden behov for hele kroppen virkninger af giftige leverskader. Kun ved at forstå de molekylære og cellulære mekanismer i leverregenerering kan vi designe nye behandlinger til behandling af patienter med fremskreden leversygdom.Til at begynde med skal du fjerne fisken fra Tricaine-tanken ved hjælp af pincet og integrere dem i rillen af en Tricaine gennemblødt svamp med den ventrale side op. Placer derefter svampen under et dissekerende mikroskop med top-down belysning. Klem huden og skalaer bare posterior til hjertet med fine pincet og skabe et hul i kroppen hulrum ved at gøre et snit under pincet med foråret indlæst saks.Roter svampen og lav et tre til fire millimeter snit langs maven ved at skære posterialt mod bækkenfinnerne. Drej derefter svampen tilbage. Klem siderne af svampen med den ene hånd for at tvinge de viscerale organer ud af kroppens hulrum.Leverens ventral lap er til stede oven på tarmen, og leveren er en lyserød eller orange struktur spredt ud over den gyldenbrune tarm og kan tydeligt visualiseres med CFP-fluorescens. Klem de fine pincet, så tænderne rører hinanden og glider tænderne mellem leveren og tarmen. Derefter langsomt adskille tænderne til at bryde portalen vene vedhæftede filer mellem leveren og tarmen.Gentag denne proces, indtil alle portalforbindelser mellem leveren og tarmen er blevet afskåret, og træk ventral lap fra tarmen ved hjælp af fine pincet. Skær ventral lap fri fra resten af leveren. En undersøgelse af dyret med fluorescens i den fælles fiskeripolitik viser, at ventralflappen er fjernet.Når du er færdig, skal du forsigtigt overføre fisken fra svampen til tanken, der indeholder systemvand, og streame systemvandet over gællerne i et par minutter, indtil fisken kommer sig og svømmer alene. Efter aflivning af fisken skal du fjerne den fra isvandet. Placer den i rillen af en svamp med ventral side op og gøre et snit af ventral kropsvæg på den forreste bageste position af hjertet.Lav derefter yderligere to snit fra kanterne af det første snit, der løber langs den forreste bageste akse til bækkenfinnerne, og skræl huden og musklen tilbage for at afsløre de viscerale organer. De viscerale organer kan nu visualiseres med både lyse felt og fluorescens mikroskopi. Levergendannelse efter delvis hepatektomi blev anslået ved at beregne forholdet mellem lever og kropsvægt, som var 1,8% for mænd og 3,3% for kvinder.Forholdet mellem lever og kropsvægt for begge køn blev bestemt på post-kirurgi dag nul, og dag syv i delvis hepatektomi og fingeret kontrol. På post-kirurgi dag nul, sham dyr har en synlig ventral lap, men i delvis hepatectomy dyr, ventral lap var helt fraværende, hvilket resulterede i en 30% reduktion hos mænd og 20% reduktion i kvinder i leveren til kropsvægt nøgletal. På post-kirurgi dag syv i delvis hepatectomy dyr, ventral lap blev ikke regenereret, og leveren til kropsvægt nøgletal i delvis hepatektomi og fingeret kontrol var sammenlignelige, hvilket indikerer genvundet levermasse efter delvis hepatektomi.Effekten af tid på ventral lobe regenerering blev bestemt ved at udføre en fuld 1 / 3 delvis hepatektomi og måle ventral lap til tarmens længde forholdet. Ventral lap besatte 50 til 100% af tarmens længde i falske kontroller, men blev alvorligt reduceret i 1/3 delvis hepatektomi dyr. Delvis hepatektomi dyr på post-kirurgi dag 36 havde en øget ventral lap til tarm ratio i forhold til post-kirurgi dag ét.En statistisk signifikant øget størrelse af ventral lap blev observeret hos dyr at komme sig efter delvis hepatektomi på post-kirurgi dag 36 i forhold til dag ét, men ikke i fingeret kontrol. Nogle dyr regenererede ventral lap, men nogle gjorde det ikke, hvilket indikerer variation i kirurgirespons. Den mest kritiske del af denne protokol er at rent adskille leveren og tarmen, så ventral lap kan fjernes helt.Delvis hepatektomi hos zebrafisk kan udføres i mutante eller transgene linjer for at analysere, at genetiske krav til leverregenerering.

Research

JoVE Journal

Biology

Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

Retro-orbital Injection in Adult Zebrafish

Drug treatment of whole animals is an essential tool in any model system for pharmacological and chemical genetic studies. Intravenous (IV) injection is ...

Dissection of Organs from the Adult Zebrafish

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental ...

Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, ...

Dissection of the Adult Zebrafish Kidney

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem ...

Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio

Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio

Zebrafish have become a beneficial and practical model organism for the study of embryonic heart development (see recent reviews1-6), however, work ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

In vivo Elektroporation af Morpholinos i den voksne zebrafisk Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

In vivo elektroporation af Morpholinos i Regenerating Adult zebrafisk Tail Fin

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration ...

Blood Collection for Biochemical Analysis in Adult Zebrafish

Blodprøvetagningssystem for Biokemisk Analyse i Voksen Zebrafisk

The zebrafish has been used as an animal model for studies of several human diseases. It can serve as a powerful preclinical platform for studies of ...

Gavaging Adult Zebrafish

Gavaging Voksen Zebrafisk

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or ...