Name: partial hepatectomy in adult zebrafish
Uploaded: 2021-04-04T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Partial Hepatectomy in Adult Zebrafish at JoVE.com

I.M.O. wordt ondersteund door de NIAAA (F32AA027135). W.G. wordt ondersteund door R01DK090311, R01DK105198, R24OD017870 en het Claudia Adams Barr Program for Excellence in Cancer Research. W.G. is een Pew Scholar in Biomedical Sciences.

Zebravissen werden gefokt volgens standaardprocedures. Experimenten werden goedgekeurd door het Brigham and Women's Hospital's Institutional Animal Care and Use Committee (2016N000405). Volwassen zebravissen werden 24 uur gevast voor het begin van het protocol. Systeemwater verwijst naar het water in zebravishuistanks in de aquatische faciliteit.
1. Voorbereiding en anesthesie
<ol><li>Bereid 0,016% Tricaine-oplossing in systeemwater. LET OP: Tricaine is irriterend als het in contact komt ...

<ol>
	<li>Michalopoulos, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+liver+regeneration+and+growth+homeostasis.">Principles of liver regeneration and growth homeostasis.</a> Comprehensive Physiology. 3, 485-513 (2013).</li><li>Wang, S., Miller, S. R., Ober, E. A., Sadler, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+it+new+again:+insight+into+liver+development,+regeneration,+and+disease+from+zebrafish+research.">Making it new again: insight into liver development, regeneration, and disease from zebrafish research.</a> Current Topics in Developmental Biology. 124, (2017).</li><li>Michalopoulos, G. K., Bhushan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+regeneration:+biological+and+pathological+mechanisms+and+implications.">Liver regeneration: biological and pathological mechanisms and implications.</a> Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology. , (2020).</li><li>Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+as+a+model+for+complex+tissue+regeneration.">The zebrafish as a model for complex tissue regeneration.</a> Trends in Genetics. 29, 611-620 (2013).</li><li>Sadler, K. C., Krahn, K. N., Gaur, N. A., Ukomadu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+growth+in+the+embryo+and+during+liver+regeneration+in+zebrafish+requires+the+cell+cycle+regulator+uhrf1.">Liver growth in the embryo and during liver regeneration in zebrafish requires the cell cycle regulator uhrf1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 1570-1575 (2007).</li><li>Goessling, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=APC+mutant+zebrafish+uncover+a+changing+temporal+requirement+for+wnt+signaling+in+liver+development.">APC mutant zebrafish uncover a changing temporal requirement for wnt signaling in liver development.</a> Developmental Biology. 320, 161-174 (2008).</li><li>Dovey, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topoisomerase+II+is+required+for+embryonic+development+and+liver+regeneration+in+zebrafish.">Topoisomerase II is required for embryonic development and liver regeneration in zebrafish.</a> Molecular and Cellular Biology. 29, 3746-3753 (2009).</li><li>Kan, N. G., Junghans, D., Belmonte, J. C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compensatory+growth+mechanisms+regulated+by+BMP+and+FGF+signaling+mediate+liver+regeneration+in+zebrafish+after+partial+hepatectomy.">Compensatory growth mechanisms regulated by BMP and FGF signaling mediate liver regeneration in zebrafish after partial hepatectomy.</a> The FASEB Journal. 23, 3516-3525 (2009).</li><li>Zhu, Z., Chen, J., Xiong, J. W., Peng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haploinsufficiency+of+Def+activates+p53-dependent+TGF&#946;+signalling+and+causes+scar+formation+after+partial+hepatectomy.">Haploinsufficiency of Def activates p53-dependent TGF&#946; signalling and causes scar formation after partial hepatectomy.</a> PLoS One. 9, (2014).</li><li>Feng, G., Long, Y., Peng, J., Li, Q., Cui, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+characterization+of+the+dorsal+lobes+after+hepatectomy+of+the+ventral+lobe+in+zebrafish.">Transcriptomic characterization of the dorsal lobes after hepatectomy of the ventral lobe in zebrafish.</a> BMC Genomics. 16, 979 (2015).</li><li>Michalopoulos, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+regeneration.">Liver regeneration.</a> Journal of Cellular Physiology. 213, 286-300 (2007).</li><li>Grisham, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organizational+principles+of+the+liver.">Organizational principles of the liver.</a> The Liver: Biology and Pathobiology: Fifth Edition. , 1-15 (2009).</li></ol>

De anatomische verschillen tussen zebravissen en zoogdiermodellen voor leverregeneratie vormen unieke uitdagingen voor leverresectie. De lever bij zebravissen bevindt zich in de nabijheid van het hart en de darm; onbedoeld beschadigen van beide organen leidt tot verhoogde mortaliteit. De zebravislever is niet ingekapseld, waardoor het moeilijker is om van de darm te scheiden. De lever ontvangt voedingsrijk bloed uit de darm via poortaders. Bij zoogdieren komen aders die de darm verlaten samen op een primaire poortader di...

Onder de vaste organen bij mensen is de lever het enige orgaan dat in staat is tot regeneratie1. Dit is van cruciaal belang, omdat de lever een essentieel orgaan is, verantwoordelijk voor belangrijke metabolische functies, energieopslag, bloedontgifting, afscheiding van plasma-eiwitten en galproductie2. Hepatocyten die verloren gaan als gevolg van toxische of inflammatoire schade worden voornamelijk vervangen door deling van de resterende hepatocyten1. Een klassiek experimenteel model voor het bestuderen van leverregeneratie is gedeeltelijke hepatectomie, waarbij individuele kwabben van de lever worden verwijderd, waardoor de resterende kwabben intact blijven3. Deze procedure werd aanvankelijk ontwikkeld bij ratten, waarbij ongeveer tweederde van de levermassa wordt verwijderd. Na gedeeltelijke hepatectomie bij zoogdieren vindt compenserende regeneratie plaats in de resterende kwabben totdat de lever zijn oorspronkelijke massa herstelt. Met name de zoogdierlever vervangt de ontbrekende kwabben niet.
Zebravis (Danio rerio) vertegenwoordigt een tracteerbaar model voor het bestuderen van volwassen orgaanregeneratie4. De zebravislever, hoewel structureel verschillend van de zoogdierlever, bestaat uit dezelfde celtypen en vervult dezelfde functie als bij zoogdieren2. Het bestaat uit drie lobben, met twee dorsale lobben en een enkele ventrale kwab die langs de darm zijn afgeplat. Gedeeltelijke hepatectomie is eerder uitgevoerd bij zebravissen, met tegenstrijdige rekeningen over de precieze wijze van regeneratie. Meestal wordt een derde gedeeltelijke hepatectomie uitgevoerd door verwijdering van de hele ventrale kwab. Eerste rapporten gaven aan dat na verwijdering van de ventrale kwab, het volledig werd geregenereerd binnen een week5,6,7, wat suggereert dat in tegenstelling tot de zoogdierlever, de zebravislever in staat is tot epimorfe regeneratie. Latere studies toonden aan dat verwijdering van de ventrale kwab resulteerde in compenserende regeneratie in de dorsale kwabben, in plaats van de regeneratie van de ontbrekende ventrale kwab, en uiteindelijk het herstel van levermassa binnen een week8,9. Transcriptomische profilering van de dorsale kwabben na resectie van de ventrale kwab bracht significante veranderingen aan het licht die verband houden met compenserende regeneratie10. Gezien het feit dat de wijze van leverregeneratie kan variëren met de omvang van de verwonding8, speculeerden we dat de verschillen in resultaten te wijten kunnen zijn aan technische variatie in het partiële hepatectomieprotocol tussen onderzoeksgroepen.
Dit protocol beschrijft een procedure voor het uitvoeren van een derde gedeeltelijke hepatectomie op volwassen zebravissen door het verwijderen van de ventrale kwab. Deze techniek zal waardevol zijn voor het beoordelen van mechanismen van leverregeneratie.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde Aqueous Solution, EM Grade</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AS 82/220.R2 PLUS Analytical Balance</td>
			<td>Bay State Scale &#38; Systems, INC.</td>
			<td>WL-104-1051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #55 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11295-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMS Kuehne Coverglass/Specimen Forceps</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72997-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Discovery.V8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mastertop Cellulose Cleaning Scrub Sponge</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07CBSM53Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS10X Liquid Conc 4L</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>6505-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Fine Micro Scissors, 3 1/4&#34; straight</td>
			<td>Biomedical Research Instruments</td>
			<td>11-1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine methanesulfonate</td>
			<td>Syndel</td>
			<td>TRIC-M-GR-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20, Fisher BioReagents</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

partial hepatectomy in adult zebrafish

Leverfalen is een van de belangrijkste doodsoorzaken wereldwijd, en de sterfte aan chronische leverziekte neemt sterk toe in de Verenigde Staten. Gezonde levers zijn in staat om te regenereren van toxische schade, maar bij gevorderde leverziekte is het natuurlijke vermogen van de lever om te regenereren aangetast. Zebravissen zijn ontstaan als een krachtig experimenteel systeem voor het bestuderen van regeneratie. Ze zijn een ideaal model voor het bestuderen van leverregeneratie van gedeeltelijke hepatectomie, een procedure met directe klinische relevantie waarbij een deel van de lever chirurgisch wordt verwijderd, waardoor de rest intact blijft. Er is geen standaardprotocol voor gedeeltelijke hepatectomie; eerdere studies met dit model hebben iets verschillende protocollen gebruikt en ongelijksoortige resultaten gerapporteerd. Hier beschreven is een efficiënt, reproduceerbaar protocol voor het uitvoeren van een gedeeltelijke hepatectomie bij volwassen zebravissen. We gebruiken deze techniek om aan te tonen dat zebravissen in staat zijn tot epimorfe regeneratie van de gereseceerde kwab. Dit protocol kan worden gebruikt om de mechanismen die nodig zijn voor leverregeneratie bij zebravissen verder te ondervragen.

Om het regeneratieve potentieel van de volwassen zebravislever te onderzoeken, voerden we gedeeltelijke hepatectomie (PHX) uit bij volwassen zebravissen. Over het algemeen werden grote volwassenen (30-40 mm lang) geselecteerd, variërend van 1,5-2,5 jaar oud. Binnen individuele experimenten werden dieren uit dezelfde tank geselecteerd en waren ze qua leeftijd en grootte op elkaar afgestemd. Als een geschikte controle maakten we gebruik van schijnoperaties waarbij het dier zowel verdoofd was als een grote incisie kreeg in...

Watch this Scientific Journal Video about Partial Hepatectomy in Adult Zebrafish at JoVE.com

Partial Hepatectomy in Adult Zebrafish

Dit protocol beschrijft de procedure voor het verwijderen van de ventrale kwab van de lever bij volwassen zebravissen om de studie van leverregeneratie mogelijk te maken.

Gedeeltelijke hepatectomie bij volwassen zebravissen

Liver failure is one of the leading causes of death worldwide, and mortality from chronic liver disease is rising sharply in the United States. Healthy ...

Dit protocol stelt onderzoekers in staat om gebruik te maken van beschikbare chemische en genetische hulpmiddelen om de mechanismen van leverregeneratie bij zebravissen te bestuderen. Gedeeltelijke hepatectomie maakt de nauwkeurige verwijdering van weefsel mogelijk om leverregeneratie te stimuleren zonder de lichaamsbrede effecten van toxisch leverletsel. Alleen door de moleculaire en cellulaire mechanismen van leverregeneratie te begrijpen, kunnen we nieuwe therapieën ontwerpen om patiënten met gevorderde leverziekte te behandelen.Verwijder om te beginnen de vis uit de Tricaine-tank met een tang en sluit ze in de groef van een door Tricaine doordrenkte spons met de ventrale kant naar boven. Plaats de spons vervolgens onder een ontleedmicroscoop met top-down verlichting. Knijp de huid en schubben net achter het hart met fijne tang en maak een gat in de lichaamsholte door een snee onder de tang te maken met de veerbelaste schaar.Draai de spons en maak een incisie van drie tot vier millimeter langs de buik door posteriaal naar de bekkenvinnen te snijden. Draai vervolgens de spons terug. Knijp met één hand in de zijkanten van de spons om de viscerale organen uit de lichaamsholte te dwingen.De ventrale kwab van de lever is aanwezig op de top van de darm, en de lever is een roze of oranje structuur verspreid over de goudbruine darm, en kan duidelijk worden gevisualiseerd met GVB fluorescentie. Knijp in de fijne tang zodat de tanden elkaar raken en schuif de tanden tussen de lever en de darm. Scheid vervolgens langzaam de tanden om de poortaderaanhechtingen tussen de lever en de darm te breken.Herhaal dit proces totdat alle portaalverbindingen tussen de lever en de darm zijn verbroken en trek de ventrale kwab uit de darm met behulp van fijne tang. Snijd de ventrale kwab vrij van de rest van de lever. Onderzoek van het dier met GVB-fluorescentie toont aan dat de ventrale kwab is verwijderd.Als u klaar bent, brengt u de vis voorzichtig over van de spons in de tank met systeemwater en stroomt u het systeemwater een paar minuten over de kieuwen totdat de vis herstelt en zelfstandig zwemt. Nadat u de vis hebt geëuthanaseerd, verwijdert u deze uit ijswater. Plaats het in de groef van een spons met de ventrale kant naar boven en maak een incisie van de ventrale lichaamswand op de voorste achterste positie van het hart.Maak vervolgens nog twee incisies vanaf de randen van de eerste incisie die langs de voorste achterste as naar de bekkenvinnen lopen en pel de huid en spier terug om de viscerale organen te onthullen. De viscerale organen kunnen nu worden gevisualiseerd met zowel heldere veld- als fluorescentiemicroscopie. Leverherstel na gedeeltelijke hepatectomie werd geschat door de verhouding tussen lever en lichaamsgewicht te berekenen, wat 1,8% was voor mannen en 3,3% voor vrouwen.De verhouding tussen lever en lichaamsgewicht van beide geslachten werd bepaald op dag nul na de operatie en dag zeven bij gedeeltelijke hepatectomie en schijncontroles. Op dag nul na de operatie hebben schijndieren een zichtbare ventrale kwab, maar bij gedeeltelijke hepatectomiedieren was de ventrale kwab volledig afwezig, wat resulteerde in een vermindering van 30% bij mannen en 20% vermindering van de verhouding tussen lever en lichaamsgewicht bij vrouwen. Op dag zeven na de operatie bij gedeeltelijke hepatectomiedieren werd de ventrale kwab niet geregenereerd en waren de lever-lichaamsgewichtverhoudingen in gedeeltelijke hepatectomie en schijncontroles vergelijkbaar, wat wijst op herwonnen levermassa na gedeeltelijke hepatectomie.Het effect van tijd op ventrale kwabregeneratie werd bepaald door een volledige 1/3 partiële hepatectomie uit te voeren en de ventrale kwab tot de darmlengteverhouding te meten. De ventrale kwab bezette 50 tot 100% van de darmlengte bij schijncontroles, maar werd ernstig verminderd bij 1/3 gedeeltelijke hepatectomiedieren. Gedeeltelijke hepatectomiedieren op dag 36 na de operatie hadden een verhoogde ventrale kwab-darmverhouding in vergelijking met de eerste dag na de operatie.Een statistisch significante verhoogde grootte van de ventrale kwab werd waargenomen bij dieren die herstelden van gedeeltelijke hepatectomie op dag 36 na de operatie in vergelijking met dag één, maar niet bij schijncontroles. Sommige dieren regenereerden de ventrale kwab, maar sommige niet, wat wijst op variatie in de respons op de operatie. Het meest kritieke deel van dit protocol is om de lever en de darm netjes te scheiden, zodat de ventrale kwab volledig kan worden verwijderd.Gedeeltelijke hepatectomie bij zebravissen kan worden uitgevoerd in mutante of transgene lijnen om te meten dat genetische vereisten voor leverregeneratie.

Research

JoVE Journal

Biology

Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

Transplantatie van Whole nier Marrow in Adult zebravis

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

Retro-orbital Injection in Adult Zebrafish

Retro-orbitale injectie in Adult zebravis

Drug treatment of whole animals is an essential tool in any model system for pharmacological and chemical genetic studies. Intravenous (IV) injection is ...

Dissection of Organs from the Adult Zebrafish

Dissectie van organen van de Adult zebravis

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental ...

Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish

Intraperitoneale injectie in de Adult zebravis

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, ...

Dissection of the Adult Zebrafish Kidney

Dissectie van de Adult zebravis Kidney

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem ...

Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio

Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio

Hart Dissection in larvale, jeugdige en volwassen zebravis, Danio rerio</em

Zebrafish have become a beneficial and practical model organism for the study of embryonic heart development (see recent reviews1-6), however, work ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

In vivo Elektroporatie van Morpholinos in de Adult zebravis Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

In vivo Elektroporatie van Morpholinos in het regenereren van Adult Zebravissen Tail Fin

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration ...

Blood Collection for Biochemical Analysis in Adult Zebrafish

Bloedafname voor biochemische analyse bij volwassen zebravis

The zebrafish has been used as an animal model for studies of several human diseases. It can serve as a powerful preclinical platform for studies of ...

Gavaging Adult Zebrafish

Gavaging Adult zebravis

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or ...