Name: partial hepatectomy in adult zebrafish
Uploaded: 2021-04-04T15:00:00
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I.M.O. est pris en charge par la NIAAA (F32AA027135). W.G. est soutenu par R01DK090311, R01DK105198, R24OD017870 et le Claudia Adams Barr Program for Excellence in Cancer Research. W.G. est boursier Pew en sciences biomédicales.

Les poissons zèbres ont été élevés et élevés selon les procédures standard. Les expériences ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux du Brigham and Women’s Hospital (2016N000405). Les poissons zèbres adultes ont été jeûnés pendant 24 h avant le début du protocole. L’eau du système fait référence à l’eau dans les réservoirs abritant des poissons zèbres dans l’installation aquatique.
1. Préparation et anesthésie
...

<ol>
	<li>Michalopoulos, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+liver+regeneration+and+growth+homeostasis.">Principles of liver regeneration and growth homeostasis.</a> Comprehensive Physiology. 3, 485-513 (2013).</li><li>Wang, S., Miller, S. R., Ober, E. A., Sadler, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+it+new+again:+insight+into+liver+development,+regeneration,+and+disease+from+zebrafish+research.">Making it new again: insight into liver development, regeneration, and disease from zebrafish research.</a> Current Topics in Developmental Biology. 124, (2017).</li><li>Michalopoulos, G. K., Bhushan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+regeneration:+biological+and+pathological+mechanisms+and+implications.">Liver regeneration: biological and pathological mechanisms and implications.</a> Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology. , (2020).</li><li>Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+as+a+model+for+complex+tissue+regeneration.">The zebrafish as a model for complex tissue regeneration.</a> Trends in Genetics. 29, 611-620 (2013).</li><li>Sadler, K. C., Krahn, K. N., Gaur, N. A., Ukomadu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+growth+in+the+embryo+and+during+liver+regeneration+in+zebrafish+requires+the+cell+cycle+regulator+uhrf1.">Liver growth in the embryo and during liver regeneration in zebrafish requires the cell cycle regulator uhrf1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 1570-1575 (2007).</li><li>Goessling, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=APC+mutant+zebrafish+uncover+a+changing+temporal+requirement+for+wnt+signaling+in+liver+development.">APC mutant zebrafish uncover a changing temporal requirement for wnt signaling in liver development.</a> Developmental Biology. 320, 161-174 (2008).</li><li>Dovey, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topoisomerase+II+is+required+for+embryonic+development+and+liver+regeneration+in+zebrafish.">Topoisomerase II is required for embryonic development and liver regeneration in zebrafish.</a> Molecular and Cellular Biology. 29, 3746-3753 (2009).</li><li>Kan, N. G., Junghans, D., Belmonte, J. C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compensatory+growth+mechanisms+regulated+by+BMP+and+FGF+signaling+mediate+liver+regeneration+in+zebrafish+after+partial+hepatectomy.">Compensatory growth mechanisms regulated by BMP and FGF signaling mediate liver regeneration in zebrafish after partial hepatectomy.</a> The FASEB Journal. 23, 3516-3525 (2009).</li><li>Zhu, Z., Chen, J., Xiong, J. W., Peng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haploinsufficiency+of+Def+activates+p53-dependent+TGF&#946;+signalling+and+causes+scar+formation+after+partial+hepatectomy.">Haploinsufficiency of Def activates p53-dependent TGF&#946; signalling and causes scar formation after partial hepatectomy.</a> PLoS One. 9, (2014).</li><li>Feng, G., Long, Y., Peng, J., Li, Q., Cui, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+characterization+of+the+dorsal+lobes+after+hepatectomy+of+the+ventral+lobe+in+zebrafish.">Transcriptomic characterization of the dorsal lobes after hepatectomy of the ventral lobe in zebrafish.</a> BMC Genomics. 16, 979 (2015).</li><li>Michalopoulos, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+regeneration.">Liver regeneration.</a> Journal of Cellular Physiology. 213, 286-300 (2007).</li><li>Grisham, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organizational+principles+of+the+liver.">Organizational principles of the liver.</a> The Liver: Biology and Pathobiology: Fifth Edition. , 1-15 (2009).</li></ol>

Les différences anatomiques entre les modèles de régénération hépatique chez le poisson zèbre et les mammifères présentent des défis uniques pour la résection hépatique. Le foie chez le poisson zèbre est à proximité du cœur et de l’intestin; Endommageant par inadvertance l’un ou l’autre organe a comme conséquence la mortalité accrue. Le foie de poisson zèbre n’est pas encapsulé, ce qui le rend plus difficile à séparer de l’intestin. Le foie reçoit du sang riche en nutriments de l’intest...

Parmi les organes solides chez l’homme, le foie est le seul organe capable de régénération1. Ceci est essentiel, car le foie est un organe essentiel, responsable des fonctions métaboliques clés, du stockage de l’énergie, de la désintoxication du sang, de la sécrétion de protéines plasmatiques et de la production de bile2. Les hépatocytes perdus en raison de dommages toxiques ou inflammatoires sont remplacés principalement par division des hépatocytes restants1. Un modèle expérimental classique pour l’étude de la régénération du foie est l’hépatectomie partielle, où les lobes individuels du foie sont enlevés, laissant les lobes restants intacts3. Cette procédure a été initialement développée chez le rat, dans laquelle environ deux tiers de la masse hépatique est enlevée. Après hépatectomie partielle chez les mammifères, une régénération compensatoire se produit dans les lobes restants jusqu’à ce que le foie récupère sa masse initiale. Notamment, le foie des mammifères ne remplace pas les lobes manquants.
Le poisson zèbre (Danio rerio) représente un modèle traitable pour l’étude de la régénération des organes adultes4. Le foie de poisson zèbre, bien que structurellement différent du foie de mammifères, est composé des mêmes types de cellules et remplit la même fonction que chez les mammifères2. Il est composé de trois lobes, avec deux lobes dorsaux et un seul lobe ventral qui sont aplatir le long de l’intestin. L’hépatectomie partielle a été précédemment réalisée chez le poisson zèbre, avec des récits contradictoires quant au mode précis de régénération. Typiquement, une hépatectomie partielle d’un tiers est réalisée par ablation de l’ensemble du lobe ventral. Les rapports initiaux ont indiqué qu’après l’élimination du lobe ventral, il a été complètement régénéré en une semaine5,6,7,ce qui suggère que contrairement au foie de mammifère, le foie de poisson zèbre est capable de régénération épimorphique. Des études ultérieures ont démontré que l’ablation du lobe ventral entraînait une régénération compensatoire dans les lobes dorsaux, plutôt que la régénération du lobe ventral manquant, et finalement la récupération de la masse hépatique dans un délai de8,9. Le profilage transcriptomique des lobes dorsaux après la résection du lobe ventral a indiqué les changements significatifs liés à la régénération compensatoire10. Étant donné que le mode de régénération du foie peut varier avec l’étendue de la blessure8, nous avons spéculé que les écarts dans les résultats peuvent être dus à la variation technique dans le protocole partiel d’hépatectomie entre les groupes de recherche.
Ce protocole décrit un procédé pour exécuter un hepatectomy partiel d’un tiers sur le poisson zèbre adulte en enlevant le lobe ventral. Cette technique sera utile pour évaluer les mécanismes de régénération du foie.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde Aqueous Solution, EM Grade</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AS 82/220.R2 PLUS Analytical Balance</td>
			<td>Bay State Scale &#38; Systems, INC.</td>
			<td>WL-104-1051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #55 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11295-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMS Kuehne Coverglass/Specimen Forceps</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72997-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Discovery.V8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mastertop Cellulose Cleaning Scrub Sponge</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07CBSM53Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS10X Liquid Conc 4L</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>6505-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Fine Micro Scissors, 3 1/4&#34; straight</td>
			<td>Biomedical Research Instruments</td>
			<td>11-1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine methanesulfonate</td>
			<td>Syndel</td>
			<td>TRIC-M-GR-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20, Fisher BioReagents</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

partial hepatectomy in adult zebrafish

L’insuffisance hépatique est l’une des principales causes de décès dans le monde, et la mortalité due aux maladies chroniques du foie augmente fortement aux États-Unis. Les foies sains sont capables de se régénérer des dommages toxiques, mais dans les maladies hépatiques avancées, la capacité naturelle du foie à se régénérer est altérée. Le poisson zèbre est devenu un puissant système expérimental pour l’étude de la régénération. Ils sont un modèle idéal pour étudier la régénération du foie à partir d’une hépatectomie partielle, une procédure ayant une pertinence clinique directe dans laquelle une partie du foie est enlevée chirurgicalement, laissant le reste intact. Il n’y a aucun protocole standard pour l’hépatectomie partielle; des études antérieures utilisant ce modèle ont utilisé des protocoles légèrement différents et ont rapporté des résultats disparates. Décrit ici est un protocole efficace et reproductible pour effectuer une hépatectomie partielle chez le poisson zèbre adulte. Nous utilisons cette technique pour démontrer que les poissons zèbres sont capables de régénération épimorphe du lobe réséqué. Ce protocole peut être utilisé pour interroger davantage les mécanismes nécessaires à la régénération du foie chez le poisson zèbre.

Afin d’examiner le potentiel régénérateur du foie adulte de poisson zèbre, nous avons exécuté hepatectomy partiel (PHX) dans le poisson zèbre adulte. En général, de grands adultes (30-40 mm de longueur) ont été sélectionnés, allant de 1,5 à 2,5 ans. Dans le cadre d’expériences individuelles, les animaux ont été sélectionnés dans le même réservoir et ont été appariés selon l’âge et la taille. Comme contrôle approprié, nous avons utilisé des chirurgies simulées dans lesquelles l’animal ...

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Partial Hepatectomy in Adult Zebrafish

Ce protocole décrit la procédure pour enlever le lobe ventral du foie dans le poisson zèbre adulte pour permettre l’étude de la régénération de foie.

Hépatectomie partielle chez le poisson zèbre adulte

Liver failure is one of the leading causes of death worldwide, and mortality from chronic liver disease is rising sharply in the United States. Healthy ...

Ce protocole permettra aux chercheurs de tirer parti des outils chimiques et génétiques disponibles pour étudier les mécanismes de régénération du foie chez le poisson zèbre. L’hépatectomie partielle permet l’ablation précise des tissus pour stimuler la régénération du foie sans avoir besoin des effets à l’échelle du corps des lésions hépatiques toxiques. Ce n’est qu’en comprenant les mécanismes moléculaires et cellulaires de la régénération du foie que nous pouvons concevoir de nouvelles thérapies pour traiter les patients atteints d’une maladie hépatique avancée.Pour commencer, retirez les poissons du réservoir de Tricaine à l’aide de pinces et intégrez-les dans la rainure d’une éponge imbibée de Tricaine avec la face ventrale vers le haut. Placez ensuite l’éponge sous un microscope de dissection avec éclairage descendant. Pincez la peau et les écailles juste après le cœur avec une pince fine et créez un trou dans la cavité corporelle en faisant une coupe sous la pince avec le ciseau à ressort.Faites pivoter l’éponge et faites une incision de trois à quatre millimètres le long de l’abdomen en coupant postéralement vers les nageoires pelviennes. Ensuite, faites pivoter l’éponge vers l’arrière. Pressez les côtés de l’éponge d’une main pour forcer les organes viscéraux à sortir de la cavité corporelle.Le lobe ventral du foie est présent sur le dessus de l’intestin, et le foie est une structure rose ou orange répartie sur l’intestin brun doré, et peut être clairement visualisé avec la fluorescence CFP. Pressez les pinces fines pour que les dents se touchent et faites glisser les dents entre le foie et l’intestin. Ensuite, séparez lentement les dents pour briser les attaches de la veine porte entre le foie et l’intestin.Répétez ce processus jusqu’à ce que toutes les connexions portales entre le foie et l’intestin aient été sectionnés, et tirez le lobe ventral de l’intestin à l’aide d’une pince fine. Couper le lobe ventral libre du reste du foie. L’examen de l’animal avec la fluorescence de CFP démontre que le lobe ventral a été enlevé.Lorsque vous avez terminé, transférez soigneusement le poisson de l’éponge dans le réservoir contenant l’eau du système et faites couler l’eau du système sur les branchies pendant quelques minutes jusqu’à ce que le poisson se rétablisse et nage tout seul. Après avoir euthanasié le poisson, retirez-le de l’eau glacée. Placez-le dans la rainure d’une éponge avec la face ventrale vers le haut et faites une incision de la paroi ventrale du corps à la position postérieure antérieure du cœur.Ensuite, faites deux autres incisions à partir des bords de la première incision qui longent l’axe postérieur antérieur jusqu’aux nageoires pelviennes, et épluchez la peau et le muscle pour révéler les organes viscéraux. Les organes viscéraux peuvent maintenant être visualisés avec la microscopie à champ lumineux et à fluorescence. Le rétablissement du foie après une hépatectomie partielle a été estimé en calculant le rapport foie/poids corporel, qui était de 1,8 % pour les hommes et de 3,3 % pour les femmes.Le rapport foie/poids corporel des deux sexes a été déterminé au jour zéro après la chirurgie et au septième jour dans les contrôles partiels d’hépatectomie et de feinte. Au jour zéro de post-chirurgie, les animaux factices ont un lobe ventral visible, mais chez les animaux d’hépatectomie partielle, le lobe ventral était complètement absent, ce qui a entraîné une réduction de 30% chez les mâles et une réduction de 20% chez les femelles des rapports foie/poids corporel. Au jour de poteau-chirurgie sept chez les animaux partiels de hepatectomy, le lobe ventral n’a pas été régénéré, et le foie aux rapports de poids corporel dans les contrôles partiels de hepatectomy et de feinte étaient comparables, indiquant la masse retrouvée de foie après hepatectomy partiel.L’effet du temps sur la régénération ventrale de lobe a été déterminé en exécutant un plein hepatectomy 1/3 partiel et en mesurant le lobe ventral au rapport de longueur d’intestin. Le lobe ventral a occupé 50 à 100% de la longueur d’intestin dans des commandes de feinte, mais a été sévèrement réduit chez 1/3 des animaux hepatectomy partiels. Les animaux hepatectomy partiels au jour 36 de poteau-chirurgie ont eu un lobe ventral accru au rapport d’intestin par rapport au premier jour de poteau-chirurgie.On a observé une plus grande taille statistiquement significative du lobe ventral chez les animaux récupérant de hepatectomy partiel au jour 36 de poteau-chirurgie par rapport au premier jour, mais pas dans les contrôles de feinte. Certains animaux ont régénéré le lobe ventral, mais d’autres non, ce qui indique une variation de la réponse chirurgicale. La partie la plus critique de ce protocole est de séparer proprement le foie et l’intestin afin que le lobe ventral puisse être entièrement enlevé.L’hépatectomie partielle chez le poisson zèbre peut être réalisée dans des lignées mutantes ou transgéniques pour analyser les besoins génétiques de la régénération du foie.

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