Name: partial hepatectomy in adult zebrafish
Uploaded: 2021-04-04T15:00:00
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I.M.O. wird von der NIAAA (F32AA027135) unterstützt. W.G. wird von R01DK090311, R01DK105198, R24OD017870 und dem Claudia Adams Barr Program for Excellence in Cancer Research unterstützt. W.G. ist Pew Scholar in Biomedical Sciences.

Zebrafische wurden nach Standardverfahren gezüchtet und gezüchtet. Die Experimente wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee des Brigham and Women's Hospital genehmigt (2016N000405). Erwachsene Zebrafische wurden vor Beginn des Protokolls 24 Stunden lang gefastet. Systemwasser bezieht sich auf das Wasser in Zebrafisch-Haltungsbecken in der Wasseranlage.
1. Vorbereitung und Betäubung
<ol><li>Bereiten Sie 0,016% ige Tricainlösung in Systemwasser vor. VORSICHT: Tricain ist e...

<ol>
	<li>Michalopoulos, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+liver+regeneration+and+growth+homeostasis.">Principles of liver regeneration and growth homeostasis.</a> Comprehensive Physiology. 3, 485-513 (2013).</li><li>Wang, S., Miller, S. R., Ober, E. A., Sadler, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+it+new+again:+insight+into+liver+development,+regeneration,+and+disease+from+zebrafish+research.">Making it new again: insight into liver development, regeneration, and disease from zebrafish research.</a> Current Topics in Developmental Biology. 124, (2017).</li><li>Michalopoulos, G. K., Bhushan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+regeneration:+biological+and+pathological+mechanisms+and+implications.">Liver regeneration: biological and pathological mechanisms and implications.</a> Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology. , (2020).</li><li>Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+as+a+model+for+complex+tissue+regeneration.">The zebrafish as a model for complex tissue regeneration.</a> Trends in Genetics. 29, 611-620 (2013).</li><li>Sadler, K. C., Krahn, K. N., Gaur, N. A., Ukomadu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+growth+in+the+embryo+and+during+liver+regeneration+in+zebrafish+requires+the+cell+cycle+regulator+uhrf1.">Liver growth in the embryo and during liver regeneration in zebrafish requires the cell cycle regulator uhrf1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 1570-1575 (2007).</li><li>Goessling, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=APC+mutant+zebrafish+uncover+a+changing+temporal+requirement+for+wnt+signaling+in+liver+development.">APC mutant zebrafish uncover a changing temporal requirement for wnt signaling in liver development.</a> Developmental Biology. 320, 161-174 (2008).</li><li>Dovey, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topoisomerase+II+is+required+for+embryonic+development+and+liver+regeneration+in+zebrafish.">Topoisomerase II is required for embryonic development and liver regeneration in zebrafish.</a> Molecular and Cellular Biology. 29, 3746-3753 (2009).</li><li>Kan, N. G., Junghans, D., Belmonte, J. C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compensatory+growth+mechanisms+regulated+by+BMP+and+FGF+signaling+mediate+liver+regeneration+in+zebrafish+after+partial+hepatectomy.">Compensatory growth mechanisms regulated by BMP and FGF signaling mediate liver regeneration in zebrafish after partial hepatectomy.</a> The FASEB Journal. 23, 3516-3525 (2009).</li><li>Zhu, Z., Chen, J., Xiong, J. W., Peng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haploinsufficiency+of+Def+activates+p53-dependent+TGF&#946;+signalling+and+causes+scar+formation+after+partial+hepatectomy.">Haploinsufficiency of Def activates p53-dependent TGF&#946; signalling and causes scar formation after partial hepatectomy.</a> PLoS One. 9, (2014).</li><li>Feng, G., Long, Y., Peng, J., Li, Q., Cui, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+characterization+of+the+dorsal+lobes+after+hepatectomy+of+the+ventral+lobe+in+zebrafish.">Transcriptomic characterization of the dorsal lobes after hepatectomy of the ventral lobe in zebrafish.</a> BMC Genomics. 16, 979 (2015).</li><li>Michalopoulos, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+regeneration.">Liver regeneration.</a> Journal of Cellular Physiology. 213, 286-300 (2007).</li><li>Grisham, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organizational+principles+of+the+liver.">Organizational principles of the liver.</a> The Liver: Biology and Pathobiology: Fifth Edition. , 1-15 (2009).</li></ol>

Die anatomischen Unterschiede zwischen Zebrafisch- und Säugetiermodellen für die Leberregeneration stellen einzigartige Herausforderungen für die Leberresektion dar. Die Leber beim Zebrafisch befindet sich in unmittelbarer Nähe zum Herzen und zum Darm; Die versehentliche Schädigung beider Organe führt zu einer erhöhten Mortalität. Die Zebrafischleber ist nicht eingekapselt, was es schwieriger macht, sich vom Darm zu trennen. Die Leber erhält nährstoffreiches Blut aus dem Darm durch Pfortadern. Bei Säugetieren ...

Unter den festen Organen beim Menschen ist die Leber das einzige Regenerationsorgan1. Dies ist von entscheidender Bedeutung, da die Leber ein essentielles Organ ist, das für wichtige Stoffwechselfunktionen, Energiespeicherung, Blutentgiftung, Sekretion von Plasmaproteinen und Gallenproduktion verantwortlich ist2. Hepatozyten, die durch toxische oder entzündliche Schäden verloren gehen, werden in erster Linie durch Teilung der verbleibenden Hepatozyten ersetzt1. Ein klassisches experimentelles Modell zur Untersuchung der Leberregeneration ist die partielle Hepatektomie, bei der einzelne Leberlappen entfernt werden, wobei die verbleibenden Lappen intaktbleiben 3. Dieses Verfahren wurde ursprünglich bei Ratten entwickelt, bei denen etwa zwei Drittel der Lebermasse entfernt werden. Nach partieller Hepatektomie bei Säugetieren erfolgt eine kompensatorische Regeneration in den verbleibenden Lappen, bis die Leber ihre Ursprüngliche Masse wiedererlangt hat. Bemerkenswerterweise ersetzt die Säugetierleber nicht die fehlenden Lappen.
Zebrafische (Danio rerio) stellen ein handhabbares Modell zur Untersuchung der Erwachsenenorganregenerationdar 4. Die Zebrafischleber unterscheidet sich zwar strukturell von der Säugetierleber, besteht jedoch aus den gleichen Zelltypen und erfüllt die gleiche Funktion wie bei Säugetieren2. Es besteht aus drei Lappen mit zwei Rückenlappen und einem einzigen Bauchlappen, die entlang des Darms abgeflacht sind. Eine partielle Häpatektomie wurde zuvor bei Zebrafischen durchgeführt, mit widersprüchlichen Berichten über die genaue Art der Regeneration. Typischerweise wird eine ein Drittel partielle Häpatektomie durch Entfernung des gesamten Ventrallappens durchgeführt. Erste Berichte deuteten darauf hin, dass der Ventrallappen nach Entfernung innerhalb einer Woche vollständig regeneriert wurde5,6,7, was darauf hindeutet, dass die Zebrafischleber im Gegensatz zur Säugetierleber zu einer epimorphen Regeneration fähig ist. Nachfolgende Studien zeigten, dass die Entfernung des Bauchlappens zu einer kompensatorischen Regeneration in den Rückenlappen führte, anstatt zur Regeneration des fehlenden Bauchlappens und schließlich zur Wiederherstellung der Lebermasse innerhalb einer Woche8,9. Die transkriptomische Profilierung der Rückenlappen nach der Resektion des Bauchlappens ergab signifikante Veränderungen im Zusammenhang mit der kompensatorischen Regeneration10. Angesichts der Tatsache, dass die Art der Leberregeneration mit dem Ausmaß der Verletzung variieren kann8, spekulierten wir, dass die Diskrepanzen in den Ergebnissen auf technische Unterschiede im partiellen Hepatektomie-Protokoll zwischen forschungsgruppen zurückzuführen sein könnten.
Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Durchführung einer partiellen Hepatektomie bei erwachsenen Zebrafischen durch Entfernen des Bauchlappens. Diese Technik wird für die Beurteilung der Mechanismen der Leberregeneration wertvoll sein.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde Aqueous Solution, EM Grade</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AS 82/220.R2 PLUS Analytical Balance</td>
			<td>Bay State Scale &#38; Systems, INC.</td>
			<td>WL-104-1051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #55 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11295-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMS Kuehne Coverglass/Specimen Forceps</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72997-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Discovery.V8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mastertop Cellulose Cleaning Scrub Sponge</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07CBSM53Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS10X Liquid Conc 4L</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>6505-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Fine Micro Scissors, 3 1/4&#34; straight</td>
			<td>Biomedical Research Instruments</td>
			<td>11-1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine methanesulfonate</td>
			<td>Syndel</td>
			<td>TRIC-M-GR-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20, Fisher BioReagents</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

partial hepatectomy in adult zebrafish

Leberversagen ist eine der weltweit führenden Todesursachen, und die Sterblichkeit durch chronische Lebererkrankungen steigt in den Vereinigten Staaten stark an. Gesunde Lebern sind in der Lage, sich von toxischen Schäden zu regenerieren, aber bei fortgeschrittenen Lebererkrankungen ist die natürliche Regenerationsfähigkeit der Leber beeinträchtigt. Zebrafische haben sich als leistungsfähiges experimentelles System zur Untersuchung der Regeneration herausgestellt. Sie sind ein ideales Modell für die Untersuchung der Leberregeneration aus der partiellen Hepatektomie, einem Verfahren mit direkter klinischer Relevanz, bei dem ein Teil der Leber operativ entfernt wird, wobei der Rest intakt bleibt. Es gibt kein Standardprotokoll für die partielle Hepatektomie; Frühere Studien, die dieses Modell verwendeten, verwendeten leicht unterschiedliche Protokolle und berichteten über unterschiedliche Ergebnisse. Hier wird ein effizientes, reproduzierbares Protokoll zur Durchführung einer partiellen Hepatektomie bei erwachsenen Zebrafischen beschrieben. Mit dieser Technik zeigen wir, dass Zebrafische in der Lage sind, den resezierten Lappen epimorph zu regenerieren. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um die Mechanismen, die für die Leberregeneration bei Zebrafischen erforderlich sind, weiter zu untersuchen.

Um das regenerative Potenzial der erwachsenen Zebrafischleber zu untersuchen, haben wir eine partielle Hepatektomie (PHX) bei erwachsenen Zebrafischen durchgeführt. Im Allgemeinen wurden große Erwachsene (30-40 mm Länge) ausgewählt, die zwischen 1,5 und 2,5 Jahre alt waren. In einzelnen Experimenten wurden Tiere aus demselben Tank ausgewählt und auf Alter und Größe abgestimmt. Als angemessene Kontrolle verwendeten wir Scheinoperationen, bei denen das Tier sowohl betäubt wurde als auch einen großen Schnitt in der...

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Partial Hepatectomy in Adult Zebrafish

Dieses Protokoll beschreibt das Verfahren zur Entfernung des Bauchlappens der Leber bei erwachsenen Zebrafischen, um die Untersuchung der Leberregeneration zu ermöglichen.

Partielle Hepatektomie bei erwachsenen Zebrafischen

Liver failure is one of the leading causes of death worldwide, and mortality from chronic liver disease is rising sharply in the United States. Healthy ...

Dieses Protokoll wird es den Forschern ermöglichen, die verfügbaren chemischen und genetischen Werkzeuge zu nutzen, um die Mechanismen der Leberregeneration bei Zebrafischen zu untersuchen. Die partielle Häpatektomie ermöglicht die präzise Entfernung von Gewebe, um die Leberregeneration zu stimulieren, ohne dass die körperweiten Auswirkungen einer toxischen Leberschädigung erforderlich sind. Nur durch das Verständnis der molekularen und zellulären Mechanismen der Leberregeneration können wir neue Therapien zur Behandlung von Patienten mit fortgeschrittener Lebererkrankung entwickeln.Um zu beginnen, entfernen Sie die Fische aus dem Tricain-Tank mit einer Zette und betten Sie sie mit der ventralen Seite nach oben in die Rille eines mit Tricain getränkten Schwamms ein. Dann legen Sie den Schwamm unter ein Seziermikroskop mit Top-Down-Beleuchtung. Kneifen Sie die Haut und die Schuppen nur nach hinter dem Herzen mit einer feinen Zette und erzeugen Sie ein Loch in der Körperhöhle, indem Sie mit der federbelasteten Schere einen Schnitt unter der Ziffe machen.Drehen Sie den Schwamm und machen Sie einen Drei- bis Vier-Millimeter-Schnitt entlang des Bauches, indem Sie nachträglich in Richtung der Beckenflossen schneiden. Dann drehen Sie den Schwamm zurück. Drücken Sie die Seiten des Schwammes mit einer Hand zusammen, um die viszeralen Organe aus der Körperhöhle zu drücken.Der Bauchlappen der Leber ist oben im Darm vorhanden, und die Leber ist eine rosa oder orange Struktur, die über den goldbraunen Darm verteilt ist und mit CFP-Fluoreszenz deutlich visualisiert werden kann. Drücken Sie die feine Zette so zusammen, dass sich die Zinken berühren und schieben Sie die Zinken zwischen Leber und Darm. Dann trennen Sie langsam die Zinken, um die Pfortaderbefestigungen zwischen Leber und Darm zu brechen.Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis alle Portalverbindungen zwischen Leber und Darm durchtrennt sind, und ziehen Sie den Bauchlappen mit einer feinen Zette aus dem Darm. Schneiden Sie den Bauchlappen frei vom Rest der Leber. Die Untersuchung des Tieres mit CFK-Fluoreszenz zeigt, dass der Bauchlappen entfernt wurde.Wenn Sie fertig sind, geben Sie den Fisch vorsichtig vom Schwamm in den Tank mit Systemwasser und strömen Sie das Systemwasser für einige Minuten über die Kiemen, bis sich der Fisch erholt und von selbst schwimmt. Nachdem Sie den Fisch eingeschläfert haben, entfernen Sie ihn aus dem Eiswasser. Legen Sie es in die Rille eines Schwamms mit der ventralen Seite nach oben und machen Sie einen Schnitt der ventralen Körperwand an der vorderen hinteren Position des Herzens.Machen Sie dann zwei weitere Einschnitte von den Rändern des ersten Schnitts, die entlang der vorderen hinteren Achse zu den Beckenflossen verlaufen, und schälen Sie die Haut und den Muskel zurück, um die viszeralen Organe freizulegen. Die viszeralen Organe können nun sowohl mit Hellfeld- als auch mit Fluoreszenzmikroskopie visualisiert werden. Die Lebererholung nach partieller Hepatektomie wurde durch Berechnung des Leber-Körpergewichts-Verhältnisses geschätzt, das bei Männern 1,8% und bei Frauen 3,3% betrug.Das Leber-Körpergewicht-Verhältnis beider Geschlechter wurde am Tag null nach der Operation und am siebten Tag bei partieller Hepatektomie und Scheinkontrollen bestimmt. Am Tag Null nach der Operation haben Scheintiere einen sichtbaren Ventrallappen, aber bei partiellen Hepatektomietieren fehlte der Ventrallappen vollständig, was zu einer 30% igen Verringerung bei Männern und einer 20% igen Verringerung bei Frauen des Lebergewichts führte. Am siebten Tag nach der Operation wurde bei partiellen Hepatektomietieren der Ventrallappen nicht regeneriert, und das Verhältnis von Leber zu Körpergewicht bei partieller Hepatektomie und Scheinkontrollen war vergleichbar, was auf eine wiedergewonnene Lebermasse nach partieller Hepatektomie hindeutet.Der Einfluss der Zeit auf die Regeneration des Ventrallappens wurde durch eine vollständige 1/3 partielle Hepatektomie und die Messung des Ventrallappens zum Darmlängenverhältnis bestimmt. Der Ventrallappen nahm bei Scheinkontrollen 50 bis 100% der Darmlänge ein, war aber bei 1/3 partiellen Hepatektomietieren stark reduziert. Partielle Hepatektomie-Tiere am 36. Tag nach der Operation hatten ein erhöhtes Verhältnis von Ventrallappen zu Darm im Vergleich zum ersten Tag nach der Operation.Eine statistisch signifikante vermehrte Größe des Ventrallappens wurde bei Tieren beobachtet, die sich am 36. Tag nach der Operation von einer partiellen Hepatektomie erholten, verglichen mit dem ersten Tag, jedoch nicht bei Scheinkontrollen. Einige Tiere regenerierten den Bauchlappen, andere jedoch nicht, was auf eine Variation der Operationsreaktion hindeutet. Der kritischste Teil dieses Protokolls besteht darin, Leber und Darm sauber zu trennen, damit der Bauchlappen vollständig entfernt werden kann.Eine partielle Häpatektomie bei Zebrafischen kann in mutierten oder transgenen Linien durchgeführt werden, um die genetischen Anforderungen für die Leberregeneration zu bestimmen.

Research

JoVE Journal

Biology

Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

Die Transplantation von Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafisch

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

Forschung

Biologie

Retro-orbital Injection in Adult Zebrafish

Retro-Orbital-Injection in Adult Zebrafisch

Drug treatment of whole animals is an essential tool in any model system for pharmacological and chemical genetic studies. Intravenous (IV) injection is ...

Dissection of Organs from the Adult Zebrafish

Dissection von Organen aus dem Adult Zebrafisch

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental ...

Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish

Intraperitoneale Injektion in Adult Zebrafisch

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, ...

Dissection of the Adult Zebrafish Kidney

Präparation des Adult Zebrafisch Kidney

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem ...

Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio

Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio

Herz Dissection in Larven, juvenile und adulte Zebrafisch, Danio rerio</em

Zebrafish have become a beneficial and practical model organism for the study of embryonic heart development (see recent reviews1-6), however, work ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

In-vivo-Elektroporation von Morpholinos in die Adult Zebrafisch Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

In-vivo-Elektroporation von Morpholinos in das Regenerations Adult Zebrafisch Leitwerk

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration ...

Blood Collection for Biochemical Analysis in Adult Zebrafish

Blutentnahme für Biochemische Untersuchungen an adulten Zebrafisch

The zebrafish has been used as an animal model for studies of several human diseases. It can serve as a powerful preclinical platform for studies of ...

Gavaging Adult Zebrafish

Gavaging Adult Zebrafisch

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or ...