Name: partial hepatectomy in adult zebrafish
Uploaded: 2021-04-04T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Partial Hepatectomy in Adult Zebrafish at JoVE.com

I.M.O. נתמך על ידי NIAAA (F32AA027135). W.G. נתמך על ידי R01DK090311, R01DK105198, R24OD017870, ואת תוכנית קלאודיה אדמס בר למצוינות בחקר הסרטן. וו.ג'י הוא חוקר מכון פיו במדעי הביו-רפואה.

דגי זברה גדלו וגדלו על פי הנהלים הרגילים. הניסויים אושרו על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים של בית החולים בריגהם ונשים (2016N000405). דגי זברה בוגרים צמו במשך 24 שעות לפני תחילת הפרוטוקול. מי מערכת מתייחסים למים במיכלי דיור דגי זברה במתקן הימי.
1. הכנה ומרדים
<ol><li>הכן 0.016% פתרון Tr...

<ol>
	<li>Michalopoulos, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+liver+regeneration+and+growth+homeostasis.">Principles of liver regeneration and growth homeostasis.</a> Comprehensive Physiology. 3, 485-513 (2013).</li><li>Wang, S., Miller, S. R., Ober, E. A., Sadler, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+it+new+again:+insight+into+liver+development,+regeneration,+and+disease+from+zebrafish+research.">Making it new again: insight into liver development, regeneration, and disease from zebrafish research.</a> Current Topics in Developmental Biology. 124, (2017).</li><li>Michalopoulos, G. K., Bhushan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+regeneration:+biological+and+pathological+mechanisms+and+implications.">Liver regeneration: biological and pathological mechanisms and implications.</a> Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology. , (2020).</li><li>Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+as+a+model+for+complex+tissue+regeneration.">The zebrafish as a model for complex tissue regeneration.</a> Trends in Genetics. 29, 611-620 (2013).</li><li>Sadler, K. C., Krahn, K. N., Gaur, N. A., Ukomadu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+growth+in+the+embryo+and+during+liver+regeneration+in+zebrafish+requires+the+cell+cycle+regulator+uhrf1.">Liver growth in the embryo and during liver regeneration in zebrafish requires the cell cycle regulator uhrf1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 1570-1575 (2007).</li><li>Goessling, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=APC+mutant+zebrafish+uncover+a+changing+temporal+requirement+for+wnt+signaling+in+liver+development.">APC mutant zebrafish uncover a changing temporal requirement for wnt signaling in liver development.</a> Developmental Biology. 320, 161-174 (2008).</li><li>Dovey, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topoisomerase+II+is+required+for+embryonic+development+and+liver+regeneration+in+zebrafish.">Topoisomerase II is required for embryonic development and liver regeneration in zebrafish.</a> Molecular and Cellular Biology. 29, 3746-3753 (2009).</li><li>Kan, N. G., Junghans, D., Belmonte, J. C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compensatory+growth+mechanisms+regulated+by+BMP+and+FGF+signaling+mediate+liver+regeneration+in+zebrafish+after+partial+hepatectomy.">Compensatory growth mechanisms regulated by BMP and FGF signaling mediate liver regeneration in zebrafish after partial hepatectomy.</a> The FASEB Journal. 23, 3516-3525 (2009).</li><li>Zhu, Z., Chen, J., Xiong, J. W., Peng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haploinsufficiency+of+Def+activates+p53-dependent+TGF&#946;+signalling+and+causes+scar+formation+after+partial+hepatectomy.">Haploinsufficiency of Def activates p53-dependent TGF&#946; signalling and causes scar formation after partial hepatectomy.</a> PLoS One. 9, (2014).</li><li>Feng, G., Long, Y., Peng, J., Li, Q., Cui, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+characterization+of+the+dorsal+lobes+after+hepatectomy+of+the+ventral+lobe+in+zebrafish.">Transcriptomic characterization of the dorsal lobes after hepatectomy of the ventral lobe in zebrafish.</a> BMC Genomics. 16, 979 (2015).</li><li>Michalopoulos, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+regeneration.">Liver regeneration.</a> Journal of Cellular Physiology. 213, 286-300 (2007).</li><li>Grisham, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organizational+principles+of+the+liver.">Organizational principles of the liver.</a> The Liver: Biology and Pathobiology: Fifth Edition. , 1-15 (2009).</li></ol>

ההבדלים האנטומיים בין דגי זברה למודלים של יונקים להתחדשות הכבד מציבים אתגרים ייחודיים לפירוק הכבד. הכבד בדגי זברה נמצא בסמיכות ללב והמעי; פגיעה בשוגג בכל איבר גורמת לתמותה מוגברת. כבד דג הזברה אינו עטוף, מה שמקשה על הנפרדות מהמעי. הכבד מקבל דם עשיר בחומרים מזינים מהמעי דרך ורידים פורטל. בי?...

בין האיברים המוצקים בבני אדם, הכבד הוא האיבר היחיד המסוגל התחדשות1. זה קריטי, כמו הכבד הוא איבר חיוני, אחראי על פונקציות מטבוליות מפתח, אחסון אנרגיה, ניקוי רעלים בדם, הפרשת חלבוני פלזמה, וייצור מרה2. Hepatocytes שאבדו עקב נזק רעיל או דלקתי מוחלפים בעיקר באמצעות חלוקה של הפטוציטים הנותרים1. מודל ניסיוני קלאסי אחד לחקר התחדשות הכבד הוא כריתת כבד חלקית, שבה אונות בודדות של הכבד מוסרות, ומשאירות את האונות הנותרות שלמות3. הליך זה פותח בתחילה בחולדות, שבהן כשני שלישים ממסת הכבד מוסרים. לאחר כריתת הפטקטומיה חלקית ביונקים, התחדשות מפצה מתרחשת באונות הנותרות עד שהכבד משחזר את המסה הראשונית שלו. ראוי לציין כי כבד היונקים אינו מחליף את האונות החסרות.
דג זברה(דניו ריו)מייצג מודל מתיחה לחקר התחדשות איברים למבוגרים4. כבד דג הזברה, בעודו שונה מבנית מהכבד היונקים, מורכב מאותם סוגי תאים ומשרת את אותה פונקציה כמו ביונקים2. הוא מורכב משלוש אונות, עם שתי אונות הגב ואונה גחונית אחת המשטחות לאורך המעי. כריתת הפטקטומיה חלקית בוצעה בעבר בדגי זברה, עם תיאורים סותרים לגבי מצב ההתחדשות המדויק. בדרך כלל, שליש כריתת hepatectomy חלקית מבוצעת על ידי הסרת האונה הגחוני כולו. דיווחים ראשוניים הצביעו על כך שלאחר הסרת האונה הגחונית, הוא התחדש במלואו בתוך שבוע5,6,7, מה שמצביע על כך שבניגוד לכבד היונקים, כבד דג הזברה מסוגל להתחדשות אפימורפית. מחקרים מאוחרים יותר הראו כי הסרת האונה הגחונית הביאה להתחדשות מפצה באונות החזיר, ולא להתחדשות האונה הגחונית החסרה, ובסופו של דבר להתאוששות של מסת הכבד בתוך שבוע8,9. פרופיל תמלול של האונות הגעשיות בעקבות כריתה של האונה הגחונית חשף שינויים משמעותיים הקשוריםהתחדשות מפצה 10. בהתחשב בכך שמצב התחדשות הכבד יכול להשתנות עם היקף הפציעה8, שיערנו כי הפערים בתוצאות עשויים להיות עקב שונות טכנית בפרוטוקול כריתת ההפטיקטומיה החלקית בין קבוצות מחקר.
פרוטוקול זה מתאר הליך לביצוע כריתת הפטיקטומיה חלקית שליש על דגי זברה בוגרים על ידי הסרת האונה הגחונית. טכניקה זו תהיה בעלת ערך להערכת מנגנונים של התחדשות הכבד.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde Aqueous Solution, EM Grade</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AS 82/220.R2 PLUS Analytical Balance</td>
			<td>Bay State Scale &#38; Systems, INC.</td>
			<td>WL-104-1051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #55 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11295-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMS Kuehne Coverglass/Specimen Forceps</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72997-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Discovery.V8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mastertop Cellulose Cleaning Scrub Sponge</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07CBSM53Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS10X Liquid Conc 4L</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>6505-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Fine Micro Scissors, 3 1/4&#34; straight</td>
			<td>Biomedical Research Instruments</td>
			<td>11-1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine methanesulfonate</td>
			<td>Syndel</td>
			<td>TRIC-M-GR-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20, Fisher BioReagents</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

partial hepatectomy in adult zebrafish

אי ספיקת כבד היא אחד הגורמים המובילים למוות ברחבי העולם, והתמותה ממחלת כבד כרונית עולה בחדות בארצות הברית. כבדים בריאים מסוגלים להתחדש מנזק רעיל, אך במחלת כבד מתקדמת, היכולת הטבעית של הכבד להתחדש נפגעת. דגי זברה התגלו כמערכת ניסיונית רבת עוצמה לחקר ההתחדשות. הם מודל אידיאלי לחקר התחדשות הכבד מהפטקטומיה החלקית, הליך עם רלוונטיות קלינית ישירה שבה חלק מהכבד מוסר בניתוח, ומשאיר את השאר ללא פגע. אין פרוטוקול סטנדרטי לכריתת הפטי חלקית; מחקרים קודמים המשתמשים במודל זה השתמשו בפרוטוקולים שונים במקצת ודיווחו על תוצאות שונות. מתואר כאן פרוטוקול יעיל, לשחזור לביצוע כריתת hepatectomy חלקית בדגי זברה בוגרים. אנו משתמשים בטכניקה זו כדי להדגים כי דגי זברה מסוגלים להתחדשות אפימורפית של האונה הנתבת. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לחקור עוד יותר את המנגנונים הנדרשים להתחדשות הכבד בדגי זברה.

על מנת לבחון את הפוטנציאל המתחדש של כבד דג הזברה הבוגר, ביצענו כריתת הפטקטומיה חלקית (PHX) בדגי זברה בוגרים. באופן כללי, נבחרו מבוגרים גדולים (30-40 מ"מ אורך) הנעים בין 1.5-2.5 שנים. במסגרת ניסויים בודדים, בעלי חיים נבחרו מאותו טנק, והיו מותאמים לגילם ולגודלם. כבקרה מתאימה, השתמשנו בניתוחים מזויפים ש...

Watch this Scientific Journal Video about Partial Hepatectomy in Adult Zebrafish at JoVE.com

Partial Hepatectomy in Adult Zebrafish

פרוטוקול זה מתאר את ההליך להסרת האונה הגחונית של הכבד בדגי זברה בוגרים כדי לאפשר את המחקר של התחדשות הכבד.

כריתת הפטקטומיה חלקית בדגי זברה למבוגרים

Liver failure is one of the leading causes of death worldwide, and mortality from chronic liver disease is rising sharply in the United States. Healthy ...

פרוטוקול זה יאפשר לחוקרים לנצל כלים כימיים וגנטיים זמינים כדי לחקור את המנגנונים של התחדשות הכבד בדגי זברה. כריתת הפטקטומיה חלקית מאפשרת הסרה מדויקת של רקמות כדי לעורר התחדשות הכבד ללא צורך בהשפעות בכל הגוף של פגיעה בכבד רעיל. רק על ידי הבנת המנגנונים המולקולריים והתאים של התחדשות הכבד נוכל לעצב טיפולים חדשים לטיפול בחולים עם מחלת כבד מתקדמת.כדי להתחיל, להסיר את הדגים ממיכל Tricaine באמצעות מלקחיים ולהטמיע אותם בחריץ של ספוג ספוג Tricaine עם הצד הגחוני למעלה. לאחר מכן מניחים את הספוג תחת מיקרוסקופ ניתוח עם תאורה מלמעלה למטה. לצבוט את העור ואת קשקשים רק אחורי ללב עם מלקחיים עדינים וליצור חור בחלל הגוף על ידי ביצוע חתך מתחת למלקחיים עם מספריים טעון האביב.לסובב את הספוג ולעשות חתך שלושה עד ארבעה מילימטר לאורך הבטן על ידי חיתוך posterially לכיוון סנפירי האגן. ואז לסובב את הספוג בחזרה. לסחוט את הצדדים של הספוג ביד אחת כדי לכפות את האיברים הקרביים מתוך חלל הגוף.האונה הגחונית של הכבד נמצאת על גבי המעי, והכבד הוא מבנה ורוד או כתום הפרוס על פני המעי החום הזהוב, וניתן לדמיין אותו בבירור עם פלואורסצנטיות CFP. לסחוט את המלקחיים העדין, כך tines נוגעים זה בזה ולהחליק את הפחיות בין הכבד והמעי. ואז לאט להפריד את הפחיות כדי לשבור את קבצים מצורפים וריד הפורטל בין הכבד והמעי.חזור על תהליך זה עד שכל קשרי הפורטל בין הכבד למעי נותקו, ולמשוך את האונה הגחון מהמעי באמצעות מלקחיים עדינים. חותכים את האונה הגחונית חופשית משאר הכבד. בדיקה של החיה עם פלואורסצנטיות CFP מראה כי האונה הגחונית הוסרה.בסיום, מעבירים בזהירות את הדגים מהספוג למיכל המכיל מי מערכת ומזרים את מי המערכת מעל הזימים לכמה דקות עד שהדגים מתאוששים ושוחים בכוחות עצמו. לאחר המתת חסד של הדג, להסיר אותו ממי קרח. מניחים אותו בחריץ של ספוג עם הצד הגחון למעלה ולעשות חותך של דופן הגוף הגחון בעמדה האחורית הקדמית של הלב.לאחר מכן בצע שני חותכים נוספים משולי ההסתעפות הראשונות המרוצות לאורך הציר האחורי הקדמי לסנפירי האגן, ומקלפים את העור והשריר כדי לחשוף את האיברים הקרביים. כעת ניתן לדמיין את האיברים הקרביים עם מיקרוסקופיית שדה בהירה ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית. התאוששות הכבד לאחר כריתת הפטקטומיה חלקית הוערכה על ידי חישוב יחס משקל הכבד לגוף, שהיה 1.8% לגברים ו -3.3% עבור נקבות.יחס משקל הכבד לגוף של שני המינים נקבע ביום אפס שלאחר הניתוח, וביום השביעי בבקרות החלקיות של כריתת הפטקטומיה והזיוף. ביום האפס שלאחר הניתוח, לבעלי חיים מזויפים יש אונה גחונית גלויה, אך בבעלי חיים כריתת הפטיקטומיה חלקית, האונה הגחונית נעדרה לחלוטין, מה שגרם לירידה של 30% בזכרים ולירידה של 20% ביחסי משקל הכבד לגוף. ביום השביעי שלאחר הניתוח בבעלי חיים כריתת חציית חלקית, האונה הגחונית לא התחדשה, ויחסי משקל הכבד לגוף בבקרות כריתת חזה ושיפוף חלקיות היו דומים, מה שמצביע על כך שמסת כבד שחזרה לאחר כריתת חזה חלקית.השפעת הזמן על התחדשות האונה הגחונית נקבעה על ידי ביצוע כריתת hepatectomy חלקית מלאה 1/3 ומדידת האונה הגחונית ליחס אורך המעי. האונה הגחונית כבשה 50 עד 100% מאורך המעי בבקרת זיוף, אך צומצמה קשות ב 1/3 בעלי חיים כריתת חלק. בעלי חיים כריתת חלק ביום שלאחר הניתוח 36 היה יחס גחוני למעי מוגבר בהשוואה ליום הראשון שלאחר הניתוח.הגדלה משמעותית סטטיסטית של האונה הגחונית נצפתה בבעלי חיים המתאוששים מהפטיקטומיה חלקית ביום 36 שלאחר הניתוח בהשוואה ליום הראשון, אך לא בבקרות מזויפות. חלק מבעלי החיים חידשו את האונה הגחונית, אך חלקם לא עשו זאת, מה שמצביע על שונות בתגובת הניתוח. החלק הקריטי ביותר של פרוטוקול זה הוא להפריד באופן נקי את הכבד ואת המעי, כך האונה הגחון ניתן להסיר לחלוטין.כריתת הפטקטומיה חלקית בדגי זברה יכולה להתבצע בקווים מוטנטיים או מהונדסים כדי לומר את הדרישות הגנטיות להתחדשות הכבד.

Research

JoVE Journal

Biology

Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

השתלה של מח כליות שלמים דג הזברה למבוגרים

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

Retro-orbital Injection in Adult Zebrafish

רטרו מסלולית הזרקה של דג הזברה למבוגרים

Drug treatment of whole animals is an essential tool in any model system for pharmacological and chemical genetic studies. Intravenous (IV) injection is ...

Dissection of Organs from the Adult Zebrafish

Dissection של איברים מן דג הזברה למבוגרים

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental ...

Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish

הזרקה לתוך intraperitoneal דג הזברה למבוגרים

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, ...

Dissection of the Adult Zebrafish Kidney

Dissection של הכליה דג הזברה למבוגרים

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem ...

Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio

Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio

הלב Dissection ב הזחל, דג הזברה לנוער ו למבוגרים, Danio rerio</em

Zebrafish have become a beneficial and practical model organism for the study of embryonic heart development (see recent reviews1-6), however, work ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

ב electroporation vivo של Morpholinos לתוך הרשתית דג הזברה למבוגרים

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

ב electroporation vivo של Morpholinos לתוך למבוגרים התחדשות זנב סנפיר דג הזברה

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration ...

Blood Collection for Biochemical Analysis in Adult Zebrafish

הדם אוסף של ניתוח ביוכימי דג הזברה למבוגרים בלבד

The zebrafish has been used as an animal model for studies of several human diseases. It can serve as a powerful preclinical platform for studies of ...

Gavaging Adult Zebrafish

Gavaging דג הזברה למבוגר

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or ...